杯[n]咔唑类衍生物及其作为T交叉DNA荧光分子探针的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及制备杯[n]咔唑类衍生物及其作为t交叉dna荧光分子探针的应用。

背景技术：

受到尺寸大小等结构因素的限制，传统的苯酚骨架的杯芳烃与体积较大的离子、生物大分子匹配程度不高。鉴于大环主体分子在超分子化学中的重要意义，新型大环化合物的创制已经得到越来越多的关注。构筑新型大环主体分子，并将其应用于离子检测、环境检测、药物传递、疾病的早期诊断和治疗等领域，具有重要的意义。

dna在复制和转录的过程中，会出现局部的解链，产生变型。这种变型会导致一种称为超螺旋的、不寻常的dna结构形成(如支链dna连接体，三链体和四链体dna等)。这种超螺旋的结构会阻碍dna的正常转运。近年来，四链体dna引起了化学家和生物学家的足够关注，但对于支链dna连接体(t交叉dna，threewayjunction,twj)的研究还不够深入。在dna中，twj产生于噬菌体的重组和复制后随链的过程中。更进一步，在腺病毒末端反向重复中能够观察到twj的结构。它参与病毒dna的复制和将病毒dna与宿主基因组结合。根据这种结合特点，能使病毒开发为基因治疗载体。通过外加的药物来稳定t交叉dna的结构，可能会阻止dna正常的酶反应进程，从而引起基因组的不稳定性，达到抑制dna复制的目的。

杯咔唑类衍生物在与t交叉dna结合前后荧光的明显差异，提高了检测的灵敏度，这种荧光探针染料由于其标记速度快、生理ph条件、对生物分子的功能活性影响小。

技术实现要素：

本发明的目的是改进杯[n]咔唑衍生物的结构、优化其制备方法并提高其响应的灵敏度。本发明不改变杯咔唑的母体结构，在咔唑2,7位，以及9位n原子上引入不同的取代基，制备了一系列衍生结构，增大了探针与t交叉dna的结合能力，所检测核酸的极限浓度为275nm。表明杯咔唑衍生物可作为一种定量检测t交叉dna的高灵敏探针。

本发明所述的杯[n]咔唑衍生物，其化学结构通式为：

r2＝-h,c1～c4的烷基或烷氧基，卤素

进一步地，本发明所述的杯[n]咔唑衍生物选自：

本发明还提供了所述的杯[n]咔唑衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)在四氢呋喃(thf)，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)或n,n-二甲基亚砜(dmso)等溶剂中，向r1含有酯基的化合物中加入5～30倍量(摩尔比)的n,n-二甲基乙二胺，25～90℃加热5～24小时，制备r1含有烷氨基侧链的化合物；

(2)加入四氢呋喃，n,n-二甲基甲酰胺，n,n-二甲基亚砜等溶剂使化合物溶解，加入3～10倍量碘甲烷，25～60℃加热3～10小时制备r1含有季胺盐侧链的化合物。

本发明中杯[n]咔唑类衍生物可以用于检测核酸，包括以下步骤：

(1)紫外检测

向溶于化合物的缓冲液中逐渐加入dna溶液，得260nm-450nm的紫外吸收值。

(2)荧光检测

设定波谱范围在310nm-600nm，激发波长为300nm，向溶于化合物的缓冲液中逐渐加入dna溶液，得到其荧光吸收的谱图。以dna的浓度为横坐标，以荧光强度f为纵坐标作图，选取389nm对荧光增强范围使用1:1模型拟合，结合能为1×10²～1×10⁵m^-1之间。

本发明的优势在于：t交叉dna作为一种新的药物靶点具有重要研究价值，而目前t交叉dna的配体报道还不多见，尤其是对于t交叉dna具有选择性荧光响应的配体还未见报道。发展t交叉dna的选择性荧光配体具有学术和商业价值。杯咔唑衍生物，在生理条件下可与不同结构核酸的相互作用，特异性识别t交叉dna，并使之稳定。(2)两者之间相互结合所展现出的荧光选择性，对t交叉dna相关疾病的早期诊断和预防的应用价值。

附图说明

图1为2,7-二甲氧基杯[3]咔唑季铵盐(化合物3)的紫外全谱图：化合物浓度为10μm，[cdna/c化合物]从0开始加入t交叉dna(twj)0.2个当量，紫外稍有减色，继续加入t交叉dna出现明显地增色现象。

图2为将图1中329nm增色处进行经验公式曲线：两端线性区间相交于[cdna/c化合物]＝1处。

图3为2,7-二甲氧基杯[3]咔唑季铵盐(化合物3)的荧光全谱图：化合物浓度为3μm，逐渐加入t交叉dna，[cdna/c化合物]从0开始0.1和0.3当量荧光被猝灭，0.3当量之后，389nm处荧光逐渐增强，当t交叉dna加入到6.0当量时强度达到饱和。

图4为图3中389nm荧光增强范围的拟合曲线：使用1:1模型拟合，得到结合能为4.33×10⁴m^-1。

图5为2,7-二甲氧基杯[3]咔唑季铵盐(化合物3)的荧光全谱图：化合物浓度为4μm，逐渐加入双螺旋dna(ds-dna)，[cdna/c化合物]0.1—8.0当量荧光被猝灭。

图6为2,7-二甲氧基杯[3]咔唑季铵盐(化合物3)的荧光全谱图：化合物浓度为4μm，逐渐加入g-四链体dna(g4-dna)[cdna/c化合物]0.1—8.0当量荧光被猝灭。

图7为2,7-二甲氧基杯[3]咔唑季铵盐(化合物3)的紫外全谱图：化合物浓度为10μm，[cdna/c化合物]从0开始加入双螺旋dna(ds-dna)，0.4当量之前紫外强度升高，0.4—6.0当量紫外强度逐渐降低。

图8为2,7-二甲氧基杯[3]咔唑季铵盐(化合物3)的紫外全谱图：化合物浓度为10μm，[cdna/c化合物]从0开始加入g-四链体dna(g4-dna)，紫外无明显变化。

图9为化合物3的高分辨质谱图。

图10为化合物6的高分辨质谱图。

具体实施方式

实施例1

化合物3的合成

取干燥后的化合物1称取20mg(0.018mmol)，0.5mln,n-二甲基乙二胺，0.2mlthf，超声震荡使其溶解，60℃搅拌24h，期间逐渐有白色沉淀析出。降至室温后倒入乙醚中，离心收集沉淀，得到固体用甲醇洗3次，干燥得到化合物2，11.7mg，收率70.5％。

干燥后的化合物2称取10mg(0.011mmol)，加入0.3mldmf使其溶解，加入0.1ml碘甲烷，密闭条件下，50℃搅拌12h后。有淡黄色沉淀析出，降至室温后倒入乙醚中，离心收集沉淀，得到固体用甲醇洗3次，干燥得到化合物3,10.0mg，收率72.1％。

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.31(t,j＝5.8hz,3h),7.53(s,6h),7.02(s,6h),5.02(s,6h),4.06(s,6h),3.86(s,18h),3.53(q,j＝6.0hz,6h),3.36(q,j＝6.0hz,6h),3.05(s,27h).¹³c-nmr(151mhz,dmso-d6):δ168.97,155.91,140.62,121.96,120.45,115.84,,92.57,63.77,56.32,52.94,46.22,34.78,33.71.hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for382.2125,found382.2143

实施例2

目标化合物4的合成

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.37(s,6h),8.18(t,j＝5.6hz,3h),7.41(d,j＝8.2hz,6h),7.31(d,j＝8.2hz,6h),4.92(s,6h),4.21(s,6h),3.40(t,j＝6.0hz,6h),3.26(t,j＝6.0hz,6h),2.96(s,27h,).¹³c-nmr(151mhz,dmso-d6):δ168.71,139.77,134.23,126.71,123.26,120.11,109.19,63.76,52.85,46.07,41.99,33.56.hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for322.1914,found322.1947.

实施例3

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.35(s,6h),8.17(t,3h),7.40(d,6h),7.31(d,6h),4.89(s,6h),4.21(s,6h),3.37(m,6h),3.25(q,6h),2.87(s,27h),1.83(m,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for336.2070,found336.2097.

实施例4

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.32(s,6h),8.18(t,3h),7.40(d,6h),7.32(d,6h),4.88(s,6h),4.20(s,6h),3.34(m,6h),3.27(q,6h),2.83(s,27h),1.75(m,6h),1.58(m,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for350.2227,found350.2253.

实施例5

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.27(t,3h),7.56(s,6h),7.07(s,6h),4.99(s,6h),4.07(s,6h),3.88(s,18h),3.23(m,6h),3.17(q,6h),2.96(s,27h),1.83(m,6h).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ168.3,155.9,140.6,121.9,120.4,115.8,92.7,63.8,56.4,52.6,46.3,36.1,27.4,23.2.hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺:396.2282；found:396.2282.

实施例6

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.30(t,3h),7.55(s,6h),7.09(s,6h),5.02(s,6h),4.06(s,6h),3.87(s,18h),3.22(q,6h),3.05(t,6h),2.97(s,27h),1.65-1.52(m,12h).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ168.8,155.9,140.6,121.8,120.4,115.8,92.5,63.9,56.2,46.3,35.8,33.8,32.6,27.3,23.8.hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺:410.2438；found:410.2476

实施例7

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.19(s,4h),7.07(s,8h),7.00(s,8h),5.10(s,8h),3.89(s,8h),3.81(s,24h),3.52(s,8h),3.38(s,8h),3.06(s,36h).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ169.0,156.0,140.5,121.0,119.7,115.7,92.3,63.8,56.1,52.9,46.3,33.8,30.2.hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-4i]⁴⁺:382.2125；found:382.2137.

实施例8

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.21(t,4h),7.14(s,8h),7.03(s,8h),5.12(s,8h),3.90(s,8h),3.83(s,24h),3.28(s,8h),3.19(s,8h),3.00(s,36h),1.85(s,8h).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ168.3,156.0,140.6,120.8,119.8,115.7,92.4,63.8,56.2,52.6,46.4,36.1,30.5,23.2.hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-4i]⁴⁺:396.2282；found:396.2304.

实施例9

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.21(t,j＝6.0hz,4h),7.13(s,8h),7.03(s,8h),5.11(s,8h),3.90(s,8h),3.83(s,24h),3.23(m,8h),3.16(q,j＝6.0hz,j＝6.0hz,8h),2.93(s,36h),1.64(m,8h),1.45(m,8h).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ168.1,156.0,140.6,120.7,119.7,115.6,92.3,65.2,56.2,52.5,38.2,34.8,26.4,19.9.hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺:589.6279；found:589.6298.for[m-4h]⁴⁺:410.4947；found:410.4989

实施例10

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6),δ(ppm):8.43(s,1h),8.02(s,6h),7.38(s,6h),5.12(s,6h),4.32(s,6h),3.21(q,6h),3.06(s,27h),2.73(s,6h).hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺480.0104,found480.0149

实施例11

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6),δ(ppm):8.41(s,1h),8.00(s,6h),7.36(s,6h),5.10(s,6h),4.36(s,6h),3.27(q,6h),3.13(t,6h),3.22(s,27h),1.94(s,6h).hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺494.0260,found494.0293

实施例12

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6),δ(ppm):8.40(s,1h),8.01(s,6h),7.36(s,6h),5.14(s,6h),4.36(s,6h),3.21(m,6h),3.12(q,6h),3.16(s,27h),1.70(m,6h),1.54(m,6h).hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺508.0417found508.0433

实施例13

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.30(s,6h),7.32(d,6h),7.27(d,6h),4.62(s,6h),4.20(s,6h),3.63(s,6h),3.22(t,6h),3.16(t,6h),2.85(s,27h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for308.2121,found308.2156.

实施例14

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.30(s,6h),7.32(d,6h),7.27(d,6h),4.62(s,6h),4.18(s,6h),3.63(s,6h),3.19(m,6h),3.12(q,6h),2.83(s,27h),1.75(m,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for322.2278,found322.2305.

实施例15

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ8.29(s,6h),7.30(d,6h),7.28(d,6h),4.60(t,6h),4.18(s,6h),3.62(t,6h),3.15(m,6h),3.11(q,6h),2.79(s,27h),1.62(m,6h),1.53(m,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for336.2434,found336.2477.

实施例16

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.27(m,3h),7.50(s,6h),7.01(s,6h),4.65(t,6h),4.02(s,6h),3.84(s,18h),3.66(t,6h),3.43(q,6h),3.30(t,6h),2.98(s,27h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for368.2333,found368.2362.

实施例17

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)7.48(s,6h),7.00(s,6h),4.65(t,6h),4.02(s,6h),3.84(s,18h),3.64(t,6h),3.10(m,6h),3.04(q,6h),2.86(s,27h),1.78(m,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for382.2489,found382.2517.

实施例18

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.46(s,6h),7.00(s,6h),4.64(t,6h),4.02(s,6h),3.85(s,18h),3.62(t,6h),3.02(q,6h),2.87(t,6h),2.83(s,27h),1.61-1.48(m,12h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for396.2646,found396.2671

实施例19

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.02(s,8h),6.97(s,8h),4.72(t,8h),3.86(s,8h),3.78(s,24h),3.68(t,8h),3.43(q,8h),3.30(t,8h),2.98(s,36h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-4i]⁴⁺calcd.for368.2333,found368.2347.

实施例20

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.11(s,8h),7.00(s,8h),4.71(t,8h),3.86(s,8h),3.77(s,24h),3.68(t,8h),3.16(t,8h),3.08(m,8h),2.87(s,36h),1.71(m,8h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-4i]⁴⁺calcd.for382.2489,found382.2513

实施例21

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ.10(s,8h),7.00(s,8h),4.72(t,8h),3.86(s,8h),3.77(s,24h),3.67(t,8h),3.12(t,8h),3.04(m,8h),2.81(s,36h),1.58(m,8h),1.37(m,8h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-4i]⁴⁺calcd.for396.2646,found396.2669

实施例22

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.98(s,6h),7.38(s,6h),4.71(t,6h),4.30(s,6h),3.67(t,6h),3.10(q,6h),2.93(s,27h),2.70(t,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for466.0311,found466.0348

实施例23

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.98(s,6h),7.38(s,6h),4.70(t,6h),4.32(s,6h),3.65(t,6h),3.12(q,6h),3.06(t,6h),2.97(s,27h),1.91(t,6h).hrms(esi/tof-q):m/z[m-3i]³⁺calcd.for480.0468,found480.0482

实施例24

¹h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.98(s,6h),7.32(s,6h),4.71(t,6h),4.30(s,6h),3.67(t,6h),3.12(m,6h),3.07(q,6h),2.84(s,27h),1.57(m,6h),1.39(m,6h).hrms(esi/tof-q)calcd.for[m-3i]³⁺494.0624,found494.0650

实施例25

荧光检测

设定波谱范围在310-600nm，激发波长为300nm，向比色皿中加入2000μl的缓冲溶液(ph＝7.25-7.35)，再加入化合物使其终浓度达3μm，向溶于化合物的缓冲液中逐渐加入t交叉dna溶液(附图3)，得到其荧光吸收的谱图。

经测定，化合物4,5,6,15,16,17的荧光被dna猝灭；dna的加入对化合物1,12,13,14,24,25,26的荧光影响不大；dna的加入增强了化合物2,3,7,8,9,10,11,18,19,20,21,22,23的荧光强度，其中以化合物3的荧光增强最为显著。

以cdna为横坐标，以荧光强度f为纵坐标作图，选取389nm对荧光增强范围使用1:1模型拟合，结合能为4.33×10⁴m^-1(附图4)。其对t交叉dna的检测极限为275nm。

实施例26

荧光检测

相同检测条件下，化合物3对双螺旋dna和g-四链体dna荧光单纯猝灭(见附图4，5)，没有荧光增强的现象出现。