专利名称：：四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑的衍生物，及其盐在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术：
：鉴于近年来病毒性疾病如SARS、禽流感、疯牛病等的全球性流行，开发抗病毒药物成为了人们广泛关注的热点。目前，国际上抗病毒药物研究的主要策略包括阻断病毒与耙细胞的结合、抑制逆转录酶、抑制病毒蛋白翻译、抑制蛋白质修饰或病毒颗粒的出芽释出、以及切断病毒基因组等。通过对己知疗效化合物进行结构改造、计算机设计先导分子、反义寡核苷酸结构改造和组合化学合成、免疫功能调节剂的研制、以及从植物和微生物中筛选天然抗病毒先导化合物等，研究开发新的抗病毒药物。作为今日临床使用的抗病毒剂，可以涉及用于控制疱疹病毒的阿昔洛伟和阿糖胞苷、用于控制巨细胞病毒的更昔洛韦和膦甲酸、和用于控制肝炎病毒的干扰素等。目前治疗乙肝的药物主要有核苷类化合物甘昔洛韦、阿昔洛韦、范昔洛韦、拉夫嘧啶。近来，已报道核苷化合物如lamivudine和泛苜洛弗(famvir)对HBV增殖是有用的抑制剂，虽然它们初始已经开发成治疗获得性免疫缺陷综合征和带状疱疹感染的疗法。但由于高耗费和副作用如毒性、耐药性病毒的产生以及停止治疗后疾病的复发，这些核苷化合物被当作治疗乙肝不好的选择。在非核苷化合物范围内寻找乙肝疗法的努力一直持续着，并且对喹诺酮化合物、三价铱化合物和对苯二胺衍生物已有抗HBV的抗病毒效果报道。尽管付出很多努力，然而治疗乙肝的有效药物仍未开发成功，疗法还主要依赖于症状治疗。临床中由于对病毒类疾病缺乏有针对性的药物，为了能够抑制病毒的复制，常常加大光谱抗病毒药物的剂量，这又导致病毒的变种，更加难以有效控制。多年来对病毒感染所造成的疾病缺乏有效的预防和治疗手段，传统的化学药物治疗病毒感染存在着特异性差、疗效不佳的缺陷。因此，已经需要开发对各种病毒、尤其对病毒具有感染预防效果和表现治疗效果的抗病毒剂，研究有效的特异性抗病毒新型药物具有重要的意义。
发明内容本发明的目的在于提供四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑的衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用。本发明中所述的四氢吲哚酮衍生物为具有如下通式(I)的化合物其中-n表示0或1;Z表示N或C—R4;Rl为氢或甲基；R2为氢或甲基；R3、R4选择下面两种组合之一(1)R4表示H、卤素、取代的氨基、杂环或取代的杂环，R3表示氨甲酰基；(2)R4和R4共同形成一个杂环或取代的杂环。优选的，所述的四氢吲哚酮衍生物为表1中所列的结构式为1-011-11、1-37、1-48和1-49的化合物。本发明中所述的四氢吲唑酮衍生物为具有如下通式(II)的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(II)其中Y表示N或C一R8;R5为三氟甲基或甲基；R8、R6选择下面两种组合之一(1)R8表示H、卤素、取代的氨基、杂环或取代的杂环，R6表示氨甲酰基、取代的氨甲酰基或氰基；(2)R8和R6共同形成一个杂环或取代的杂环；R7表示H或取代的氨基。优选的，所述的四氢吲唑酮衍生物为表l中所列的结构式为I-121_36、1-38、1-441-47和1-501-55的化合物。本发明中所述的四氢咔唑衍生物为具有如下通式(ni)的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R9为氢或三氟甲基；R10为取代的氨基。优选的，所述的四氢咔唑衍生物为表1中所列的结构式为I-39I-43的化合物。本发明中所述的四氢吲哚酮衍生物、四氢吲唑酮衍生物或四氢咔唑衍生物，及其盐均具有抗病毒作用，所述的病毒包括I型、II型疱疹病毒，科萨奇病毒3型(CVB3)，和乙肝病毒。表1、四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑的衍生物的结构式和名称<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>具体实施方式本发明中的化合物均可按照本申请人的在先专利申请200610087495.1(公开号CN1896060A)中的方法制备。实施例l、抗单纯疱疹病毒I型(HSV1)的实验(1)仪器与试药进口96孔培养板、倒置显微镜、C02培养箱、微量加样器；培养基为DMEM(含青链双抗各250U/ml)，除菌过滤前用碳酸氢钠调pH至7.0—7.2;小牛血清经56"，30分钟灭活补体，除菌分装；消化液5。/。的胰蛋白酶+lXEDTA+0.01mol/L(pH7.2)PBS，除菌分装，低温保存；细胞生长液含10%FBS的DMEM培养液；细胞维持液含1%FBS的DMEM培养液；阳性药物无环鸟苷ACV;试验药物如表1所述的四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物(结构式I-01至1-55)。(2)病毒与细胞株单纯疱疹病毒I型病毒株HSV-1(美国ATCC,VR733,F株)，经Vero细胞传代滴定约为105TCID5();细胞株非洲绿猴肾细胞(Vero)，来源于美国ATCC，CCX81株。(3)药物处理取阳性药物和实验药物10mg，溶于1mLDMSO，终浓度为10mg/mL(母液)。(4)测定方法药物对Vero的细胞毒性实验采用MTT比色法；药物抗病毒活性实验采用MTT比色法和空斑减数法。(5)药物的细胞毒性实验单层细胞制备(预板):将培养瓶中生长良好的Vero细胞用消化液常规消化，用DMEM生长液稀释至浓度1.5xl05cdl/mL，100nL/孔，37°C，5%<302培养箱孵育24h，形成均匀一致的单层细胞。药物稀释取阳性药物(ACV)，试验药物(1-01—1-55化合物)的工作母液分别用维持液稀释1000倍，使DMSO的含量不超过0.1X，然后再依次倍比稀释6个浓度梯度。加样将微孔中生长液吸出，每孔加入IOO)LIL已稀释好的样品溶液，每个浓度设3个复孔，同时设正常细胞对照孔(加入无药维持液10(HiL/孔)，37°C，5%(202培养箱中继续培养。.结果观察每天观察细胞长势，以-、*、**、***、****表示细胞毒性情况，72h为终点。选取对细胞生长无毒性的最大药物浓度作为抗病毒实验的起始浓度。(注"-"表示细胞没有出现毒性，"*"表示0~25%细胞出现毒性，"**"表示25%~50%细胞出现毒性，"***"表示50%~75%细胞出现毒性，"****"表示75%~100%细胞出现毒性。)MTT法培养结束前4h，每孔加10nLMTT,37°C，5%C02培养箱继续培养4h，小心吸去上清，每孔加100pLDMSO，避光放置lh后，于酶标仪a二570nm，参考X二630nm)上测OD值，计算细胞存活率以及药物的半数中毒浓度TCs()。(6)药物的抗病毒活性试验-单层细胞制备同上药物稀释根据细胞毒性的结果，从最大无毒浓度开始，用维持液依次倍比稀释6个浓度梯度。病毒稀释用维持液将病毒稀释成100TCID5Q/50nL的病毒使用液。阳性药物无环鸟苷(ACV)。加样将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的药物溶液5(HiL，立即加入病毒使用液50pL，每个浓度设3个复孔，同时设正常细胞对照，病毒对照和阳性药物对照，37'C，5%0)2培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE):每天观察细胞长势，以-、+、++、+++、++++表示细胞病变情况。(注"-"表示细胞没有出现病变，"+"表示0~25%的细胞出现病变，"++"表示25%~50%的细胞出现病变，"+++"表示50%~75%的细胞出现病变，"++++"表示75%100%的细胞出现病变)。以细胞对照仍然完好而病毒对照完全病变(++++)作为试验的终点。记录病变情况并照相，照相取最低高效浓度，倍数为100x。MTT法具体步骤同上。计算细胞存活率以及药物的半数有效浓度IC50。空斑减数实验根据MTT法的结果，空斑减数实验设药物组、ACV阳性对照组、病毒对照组、阴性对照组。37°C,5%(202培养箱培养3天，根据空斑形成单位计算药物的半数有效浓度IC50。(7)实验结果1)细胞毒性MTT法结果表1中所列的四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物对Vero细胞均表现出较低的细胞毒作用，实验结果见表2。选取各样品最大无毒浓度作为抗病毒活性试验的最大药物使用浓度。2)抗病毒活性结果&CPE结果结构式I一Ol至1一55所示的四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物作用后，细胞病变比病毒对照延缓，表现出一定的抑制作用。②MTT法及空斑减数实验结果构式I一01至I一55所示的四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物对HSV-l的感染有一定的抗病毒作用，其IC5o列于表3。实施例2、抗单纯疱疹病毒II型(HSV2)(1)仪器与试药参照实施例l。(2)病毒与细胞株单纯疱疹病毒II型病毒株HSV-2(武汉典型物种保存中心提供)，经Vero细胞传代滴定约为105TCID5。；细胞株非洲绿猴肾细胞(Vero)，来源于美国ATCC，CCL81株。(3)药物处理参照实施例1。(4)测定方法参照实施例1。(5)药物的细胞毒性实验参照实施例l。(6)药物的抗病毒活性试验参照实施例l。(7)实验结果1)细胞毒性MTT法结果四氢n引哚酮衍生物和四氢n引唑酮衍生物的化合物，对Vero细胞均表现出较低的细胞毒作用，其TC5o见表2。选取各样品最大无毒浓度作为抗病毒活性试验的最大药物使用浓度。2)抗病毒活性结果①CPE结果四氢吲哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物(结构式I一01至I一55的化合物)作用后，细胞病变比病毒对照延缓，表现出一定的抑制作用。②MTT法及空斑减数实验结果四氢吲哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物(结构式I一Ol至I一55的化合物)对HSV-1的感染有一定的抗病毒作用，其ICso见表3。空斑减数试验结果与MTT法测定结果一致。实施例3、抗柯萨奇病毒实验(1)仪器与试药进口96孔培养板、倒置显微镜、CCb培养箱、微量加样器；培养基为DMEM(含青链双抗各250U/ml)，除菌过滤前用碳酸氢钠调pH至7.0-7.2;小牛血清经56°C，30分钟灭活补体，除菌分装；消化液5%的胰蛋白酶+1%EDTA+0.01mol/L(pH7.2)PBS，除菌分装，低温保存；细胞生长液含10。/。FCS的DMEM培养液；细胞维持液含l。/oFCS的DMEM培养液；阳性药物病毒唑；试验药物四氢吲哚衍生物和四氢吲唑衍生物的表1所述化合物(结构式见表1中1-01至1-55)。(2)细胞与病毒株细胞宫颈癌细胞(Hela)，来源于美国ATCC，CCL81株病毒CVB3(武汉大学医学院病毒研究所提供)，经Hela细胞传代滴定约为105TCID50。(3)药物处理阳性药物和试验药物分别称取9.91mg，溶于lmLDMSO，浓度9.91mg/mL。(4)测定方法药物对Hda的毒性实验采用MTT比色法。药物抗CVB3病毒活性实验采用MTT比色法。(5)药物的细胞毒试验单层细胞制备(预板)将培养瓶中生长良好的Hda细胞用消化液常规消化,用DMEM生长液稀释至浓度1.5xl05cell/mL，100nL/孔，37°C，5%0)2培养箱孵育24h，形成均匀一致的单层细胞。药物稀释药物的工作母液用维持液稀释1000倍，使DMSO的含量不超过0.1%，然后再依次倍比稀释6个浓度梯度。加样将微孔中生长液吸出，每孔加入100nL已稀释好的样品溶液，每个浓度设3个复孔，同时设正常细胞对照孔(加入无药维持液10(VL/孔)，37°C，5%(302培养箱中继续培养。结果观察每天观察细胞长势，以-、*、**、***、****表示细胞毒性情况，72h为终点。选取对细胞生长无毒性的最大药物浓度作为抗病毒实验的起始浓度。(注"-"表示细胞没有出现毒性，"*"表示0~25%细胞出现毒性，"**"表示25%50%细胞出现毒性，"***"表示50°/。~75%细胞出现毒性，"****"表示75%100%细胞出现毒性。)MTT法培养结束前4h，每孔加10pLMTT,37°C，5%C02培养箱继续培养4h，小心吸去上清，每孔加100nLDMSO，避光放置lh后，于酶标仪a二570nm，参考X二630nm)上测OD值，计算细胞存活率以及药物的半数中毒浓度TCM)。(6)药物的抗病毒试验单层细胞制备同上。药物稀释根据细胞毒性的结果，从最大无毒浓度开始，用维持液依次倍比稀释6个浓度梯度。病毒稀释用维持液将病毒稀释成100TCIDW50nL的病毒使用液。阳性药物病毒唑。加样将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的药物溶液50nL，立即加入病毒使用液50pL，每个浓度设3个复孔，同时设正常细胞对照，病毒对照和阳性药物对照，37°C，5%<:02培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE):每天观察细胞长势，以-、+、++、+++、++++表示细胞病变情况(注"-"表示细胞没有出现病变，"+"表示025%的细胞出现病变，"++"表示25%~50%的细胞出现病变，"+++"表示50%~75%的细胞出现病变，"++++"表示75%~100%的细胞出现病变)。以细胞对照仍然完好而病毒对照完全病变(++++)作为试验的终点。记录病变情况并照相，照相取最低高效浓度，倍数为100x。MTT法具体步骤同上。计算细胞存活率以及药物的半数有效浓度IC50。(7)实验结果1)细胞毒性MTT法结果四氢吲哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物，对Hela细胞表现出较低的细胞毒作用，其TC5o见表2。选取各样品最大无毒浓度作为抗病毒活性试验的最大药物使用浓度。2)抗病毒活性结果①CPE结果四氢B引哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物(结构式I一01至I一55的化合物)作用的细胞病变比病毒对照延缓，表现出一定的抑制作用。②MTT法及空斑减数实验结果药物作用后，细胞病变比病毒对照延缓，说明化合物对CVB3的感染有一定的抑制作用，其IC5。见表3。实施例4、抗乙肝病毒实验(1)仪器与试药进口96孔培养板、倒置显微镜、C02培养箱、微量加样器；培养基为RPMI-1640(含青链双抗各250U/ml)，除菌过滤前用碳酸氢钠调pH至7.0-7.2;小牛血清经56°C，30分钟灭活补体，除菌分装；消化液5%的胰蛋白酶+1%EDTA+0.01mol/L(pH7.2)PBS，除菌分装，低温保存；细胞生长液含10%FBS的1640培养液，含10%FCS的DMEM培养液；细胞维持液含1%FCS的DMEM培养液；阳性药物干扰素；试验药物四氢吲哚衍生物和四氢d引唑衍生物的表1所述化合物(结构式见表l中I-Ol至1-55)。(2)细胞HBV-DNA克隆转染HepG2.2.15细胞株。(3)药物处理分别称取阳性药物和试验药物，溶于DMSO，配成不同浓度的溶液。(4)测定方法药物对HepG2.2.15细胞的毒性实验采用MTT比色法。药物抗CVB3病毒活性实验采用MTT比色法。1)药物对HepG2.2.15人肝细胞的毒性试验①取对数生长期的HepG2.2.15人肝细胞用胰酶常规消化后，用1640生长液调成浓度为1.8xl05cell/mL的细胞悬液，加到96孔板中，100pl/孔，置37。C，5%(302孵箱中培养，直至细胞长成单层。②细胞完全附着后，小心吸去上清(生长液)，加入含不同浓度药物的1640生长液，100pl/L每个浓度至少设3格复孔，同时设正常细胞对照(加不含药物的1640生长液)，置37匸，5XC02孵箱中培养48小时，其间不断在光学显微镜下观察细胞的生长状况。③培养结束时，在镜下记录细胞的生长状况，后加入5mg/mL的MTT10pl/L，终止培养。置37。C，5%<:02孵箱中继续培养4小时，小心吸取上清，加入DMSO100p1/孔，终止反应，l小时后，在酶标仪a二570nm，参考波长630nm)上测各孔吸光值A,计算药物对细胞生长的抑制率及TC50。细胞存活率二A药/A对xlOOX细胞生长抑制率=1一细胞存活率按Reed-Muench方法计算TC50。2)药物抗2.2.15细胞表达HbsAg活性试验①同药物对2.2.15细胞毒性试验②根据药物对2.2.15人肝细胞的毒性试验结果，取药物的最大无毒浓度开始，用DMEM维持液稀释几个不同浓度。③弃上清，将不同浓度的药物加入24孔板中，200^L/孔，每个浓度3个复孔，同时设正常细胞对照(加入既不含药物又不含病毒的维持液)、病毒对照组(加入只含病毒的维持液)，置37'C、5XC02孵箱中培养。每隔3天更换一次，并收集培养上清，连续3次。A.预防法弃上清，加入不同浓度的药物，50pl/L，3个复孔，置37t:孵箱中培养lh后再加入病毒悬液50pl/孔，设正常细胞对照组，病毒对照组。B.治疗法弃上清，加入病毒悬液50^1/孔，孵箱中培养使病毒吸附lh后加入不同浓度的药物，3个复孔，50pl/孔，设正常细胞对照，病毒对照组。④培养期间不断在镜下观察细胞的病变情况，至病毒对照组细胞完全病变(75%~100%CPE)，在镜下记录各药物组的细胞病变情况(CPE)。⑤ELISA法测定培养上清液乙肝表面抗原。(5)试验结果四氢吲哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物(结构式I一Ol至1一55的化合物)对HepG2,2.15细胞的TC50，见表2。四氢吲哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物(结构式I一Ol至1一55的化合物)对HepG2.2.15细胞分泌表达HbsAg的抑制率，见表3。药物抑制抗原百分率(％)=(细胞对照Bq-给药组Bq)/(细胞对照Bq-空白对照Bq)xl00%(6)实验结论四氢吲哚酮衍生物和四氢吲唑酮衍生物的化合物(结构式I一Ol至I一55的化合物)对HepG2.2.15细胞有明显的抗HBV活性，在试验浓度范围内，随着药物浓度和作用时间的延长，其抗HBV活性增强。表2四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物的细胞毒性实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表3四氢n引哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑衍生物的抗病毒活性结果<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>权利要求1.一种四氢吲哚酮衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，其中所述的四氢吲哚酮衍生物为具有如下通式(I)的化合物其中n表示0或1；Z表示N或C-R4；R1为氢或甲基；R2为氢或甲基；R3、R4选择下面两种组合之一(1)R4表示H、卤素、取代的氨基、杂环或取代的杂环，R3表示氨甲酰基；(2)R4和R4共同形成一个杂环或取代的杂环。2、如权利要求1所述的四氢B引哚酮衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，所述的病毒为I型、II型疱疹病毒，科萨奇病毒3型，或乙肝病毒。3、一种四氢吲唑酮衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，其中所述的四氢n引唑酮衍生物为具有如下通式(II)的化合物其中Y表示N或C一R8;R5为三氟甲基或甲基；R8、R6选择下面两种组合之一(1)R8表示H、卤素、取代的氨基、杂环或取代的杂环，R6表示氨甲酰基、取代的氨甲酰基或氰基；(2)R8和R6共同形成一个杂环或取代的杂环；R7表示H或取代的氨基。4、如权利要求3所述的四氢吲唑酮衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，所'述的病毒为I型、II型疱疹病毒，科萨奇病毒3型，或乙肝病毒。5、一种四氢咔唑衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，其中所述的四氢咔唑衍生物为具有如下通式(III)的化合物6、如权利要求5所述的四氢咔唑衍生物及其盐在制备抗病毒药物中的应用，所述的病毒为I型、n型疱疹病毒，科萨奇病毒3型，或乙肝病毒。全文摘要本发明涉及四氢吲哚酮/四氢吲唑酮/四氢咔唑的衍生物，及其盐在制备抗病毒药物中的应用。本发明中所述的四氢吲哚酮衍生物、四氢吲唑酮衍生物或四氢咔唑衍生物，及其盐均具有抗病毒作用，所述的病毒包括I型、II型疱疹病毒，科萨奇病毒3型(CVB3)，和乙肝病毒。文档编号A61P31/00GK101273991SQ20071006482公开日2008年10月1日申请日期2007年3月28日优先权日2007年3月28日发明者敏夏,王一飞,邢国文申请人:北京国药龙立生物医药新技术有限公司;广州暨南生物医药研究开发基地有限公司