一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法与流程

本发明涉及一种重组猪流行性腹泻病毒n、s蛋白单克隆抗体的制备方法，涉及猪流行性病毒的n、s基因，属于分子生物学领域，同时也涉及抗pedv单克隆抗体一种新的快速高效检测pedv的抗体生产技术领域。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(pedv)引起猪的一种急性高度接触性传染病，主要以腹泻、呕吐和脱水为特征，该病分布广，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。ped与猪传染性胃肠炎(porcinetransmissiblegastroenteritis，tge)非常相似，在临床表现等各个方面都不易区分，所以给该病及时诊断和治疗带来了一定困难。近年来，随着我国规模化猪场比例的不断扩大，种猪场的不断增加，仔猪病死率升高，本病的危害也愈加突出，给我国养猪业带来巨大打击。

n蛋白作为核衣壳蛋白是冠状病毒结构蛋白中的多功能磷酸化蛋白质，保守型强，且在病毒粒子中含量高，在感染的细胞中能够大量表达，同时n蛋白在病毒的复制和机体免疫方面发挥重要作用。猪在感染pedv早期，体内会产生较高水平的抗n蛋白抗体，所以利用n蛋白建立的检测pedv诊断技术具有很好的前景。s蛋白为纤突蛋白，位于病毒囊膜表面，该蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，具有很强的免疫原性。感染pedv的猪的血清中抗s蛋白抗体较持久，可长时间的检测到s蛋白抗体。

单抗涉及多种检测方法，包括补体结合试验、血清中和试验、免疫荧光技术、免疫酶技术等，这些技术都已经在临床或实验室得到广泛应用。单克隆抗体在疾病诊断和治疗等方面广泛应用，近年来，不少学者研制出了很多单克隆抗体，其中很多单抗对于改善临床疾病诊断的方法至关重要，单克隆抗体可以用来建立快速的临床检查方法。综上所述，单克隆抗体对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种重组猪流行性腹泻病毒n、s蛋白单克隆抗体的制备方法，制备出抗pedv的单克隆抗体。

本发明的目的是这样实现的，一种重组猪流行性腹泻病毒n、s蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)根据genbank中已发表的猪流行性腹泻病毒n、s基因序列设计特异性的引物(上下游分别插入相应的酶切位点)，通过pt-pcr方法扩增n、s基因，测序鉴定正确后克隆到原核表达载体pcoldi上，得到重组表达载体pcoldi-n、pcoldi-s；

(2)将步骤(1)得到的重组表达载体pcoldi-n、pcoldi-s转入大肠杆菌rosseta后，经iptg诱导获得重组蛋白；

(3)利用亲和柱对重组蛋白进行纯化，并用western-blot鉴定分析所获得的重组蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有反应原性；

(4)以纯化的重组蛋白作为免疫原，取6-8周龄balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与s/p20细胞融合，利用间接酶联免疫吸附实验(elisa)筛选出阳性杂交瘤细胞株，同时用重组蛋白包被酶标板，建立了间接elisa检测单抗的方法；

(5)将经步骤(4)筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过三次亚克隆，得到3株抗pedvn蛋白特异性杂交瘤细胞株，分别命名为：4b8、4c10、3c3；对获得的抗pedvn蛋白特异性杂交瘤细胞株进行western-blot鉴定分析，结果表明该3株抗pedvn蛋白特异性杂交瘤细胞株均能与pedv全病毒发生特异性反应；

(6)将3株抗pedvn蛋白特异性杂交瘤细胞株分别注入小鼠腹腔，收获腹水并进行纯化，最终获得了具有高纯度高特异性的抗pedv单克隆抗体。

步骤(5)中筛选出的3株抗pedvn蛋白特异性杂交瘤细胞株可用来制备快速检测pedv的试剂盒。

本发明方法先进科学，通过本发明，所获得的3株单抗可用来制备快速检测pedv的试剂盒。本发明根据genbank中已发表的猪流行性腹泻病毒n、s基因序列设计特异性的引物，通过pt-pcr方法扩增n、s基因，测序鉴定正确后克隆到原核表达载体pcoldi上，得到重组表达载体pcoldi-n、pcoldi-s，转入大肠杆菌rosseta后经iptg诱导获得重组蛋白。利用亲和柱对重组蛋白进行纯化，并用western-blot鉴定分析所获得的重组蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有反应原性。

以纯化的重组蛋白作为免疫原，取6-8周龄balb/c雌性小鼠，按照常规免疫程序进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与s/p20细胞融合，利用间接酶联免疫吸附实验(elisa)筛选阳性融合细胞株并亚克隆，同时用重组蛋白包被酶标板，建立了间接elisa检测单抗的方法。经2次融合筛选出3株抗pedvn蛋白特异性单克隆抗体，分别命名为：4b8、4c10、3c3。对获得的单抗进行western-blot以及间接免疫荧光试验(ifa)鉴定分析，结果表明所获得的3株单抗均能与pedv全病毒发生特异性反应。

最后，将3株阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，收获腹水并进行纯化，因此获得了具有高纯度高特异性的抗pedv单克隆抗体。

以上实验结果表明，试验所获得的3株单抗，能够与pedv全病毒发生特异性反应，说明制备的单克隆抗体是抗pedv的特异性抗体，为以后研发检测pedv的试剂盒奠定了基础。

诊断pedv的方法非常多，例如病毒分离，免疫电镜观察，免疫组化，免疫荧光试验等已被用于抗原或抗体检测，但这些方法存在操作复杂，耗时，敏感性特异性较低等缺点，随着生物学技术的发展，pcr和elisa技术也在pedv的诊断中发挥重要作用。但是单克隆抗体以其绝对的优势在疾病诊断和治疗等方面发挥越来越重要的作用。我们的试验结果为改善临床诊断ped的方法至关重要，可以用来建立一种快速诊断pedv的方法。

附图说明

图1a为pedvn基因pcr扩增图。

图1b为重组载体pcoldi-n菌液pcr鉴定图。

图1c为重组载体pcoldi-n双酶切鉴定图。

图2a为pedvs基因pcr扩增图。

图2b为重组载体pcoldi-s菌液pcr鉴定图。

图2c为重组载体pcoldi-s双酶切鉴定图。

图3为重组n蛋白诱导表达后sds-page分析图。

图4为重组s蛋白诱导表达后sds-page分析图。

图5a为纯化后的重组n蛋白sds-page分析图。

图5b为纯化后的重组s蛋白sds-page分析图。

图6a为western-blot鉴定阳性杂交瘤细胞株4b8培养上清与病毒蛋白的反应性。

图6b为western-blot鉴定阳性杂交瘤细胞株4c10培养上清与病毒蛋白的反应性。

图6c为western-blot鉴定阳性杂交瘤细胞株3c3培养上清与病毒蛋白的反应性。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.生物材料与试剂：

1.1生物材料

vero细胞、pedvcaj毒株，雌性balb/c(6～10周龄)小鼠和icr雌性小鼠，sp2/0骨髓瘤细胞。

1.2实验试剂与耗材

α-mem，胎牛血清，青链霉素，l-谷氨酰胺，胰酶，rna提取试剂盒，oligo(dt)，dntps，5×cdnabuffer，mdtt，amv，dreamtaqhotstartdnapolymerase，dl2000dnaplusmaker，限制性核酸内切酶sali、xhoi、xbai、bamhi、kpni，t4dna连接酶，pentr-4原核表达载体pcoldi，iptg，盐酸胍，蛋白纯化柱。50×tae电泳缓冲液，琼脂糖，考马斯亮蓝r250，hpr标记羊抗鼠igg，蛋白mark，pcr产物回收试剂盒，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，透析袋，peg8000，dmem培养基，双抗，hat和ht培养基添加剂(50×)，胎牛血清，弗氏不完全佐剂(fia)、弗氏完全佐剂(fca)，peg1500，可溶性单组分tmb底物溶液，脱脂奶，96孔聚苯乙烯酶标板，细胞冻存液，单抗亚型鉴定试剂盒。

2.实验方法

2.1rt-pcr扩增目的基因

根据genbank中已发表的猪流行性腹泻病毒cv777毒株基因序列，用dnastar生物学软件分析，选择抗原性良好的区域，设计n和s基因编码区引物，并在上下游引物中分别加入限制性核酸内切酶sali和xhoi(n基因)，kpni和xbai(s基因)的识别位点及保护性碱基。将各组分加入pcr管，混匀瞬离后放入pcr仪中进行扩增。反应程序：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，32个循环；72℃7min。反应结束后取5μl产物，利用1％琼脂糖凝胶电泳分析，经凝胶成像系统观察。其余产物-20℃保存。

2.2重组蛋白的诱导表达

将构建的重组质粒经iptg诱导表达重组蛋白，具体步骤如下：

(1)取鉴定正确的重组质粒转化到100μlrosseta感受态细胞中。

挑取单个菌落接种于4mllb液体培养基中(含amp100μg/ml)，37℃，225rpm过夜培养。

(2)取过夜培养的菌液按1：100接种于3mllb液体培养基中(amp100μg/ml)，37℃，225rpm培养3h，待od值达到0.4～0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg，16℃，225rpm培养8h。

(3)将菌液移至离心管，10000rpm/min离心5min，弃上清，灭菌pbs洗两次，取适量pbs重悬细菌团块，冰上超声破碎，30hz，7min，后10000rpm/min离心5min，收集上清，沉淀用80μl灭菌pbs重悬。

(4)取诱导表达的重组蛋白上清和沉淀进行sds-page分析，加入等量的2×loadingbuffer,充分混匀后金属95℃煮样5min，冰浴2min，每孔上样20μl，80v恒压至分离胶，120v恒压1.5小时。

(5)电泳完毕后，小心剥离电泳胶，经考马斯亮蓝染色1h，充分脱色至蛋白条带清晰，观察结果。

2.3小鼠免疫

(1)选择6周龄balb/c雌性小鼠，用纯化的重组蛋白进行免疫。

(2)首免：蛋白与弗氏完全佐剂按1:1比例充分混匀，用注射器乳化至“油包水，水包油”的状态，每只老鼠皮下注射0.2ml。

(3)二免：2周后再次免疫，按1:1的比例与弗氏不完全佐剂充分混匀，用注射器乳化至“油包水，水包油”的状态，每只老鼠皮下注射0.2ml。

(4)三免：二免2周后进行三免，方法同二免相同。

(5)三免后10天，小鼠断尾采血，分离血清，用间接elisa法测定血清中抗体水平。血清抗体效价达到理想滴度后准备细胞融合，在融合前3天进行加强免疫，蛋白溶液不添加任何佐剂，直接腹腔注射，0.2ml/只。

2.4细胞融合

加强免疫3天后，进行细胞融合，具体步骤如下：

(1)将1×10⁸个脾细胞与2～5×10⁷骨髓瘤细胞混合于一支50ml离心管中，补加基础培养基至30ml，混合；1000rpm/min离心10min，弃上清。于手掌心轻击管底，使细胞分散均匀，置于40℃水浴预热。

(2)吸取1ml预热至40℃的peg1500于60s内滴加至融合管中，边加边轻轻搅拌。

(3)90s内加20～30ml预热至37℃的基础培养基，终止融合，室温静置10min，1000rpm/min离心10min，弃上清。

(4)加入5mlhat培养基，轻轻吹吸沉淀，悬浮均匀，补加hat至80～100ml。

(5)分装96孔板，37℃培养；5天后用hat换出1/2培养基，10天后用ht换出hat，经常观察，待培养基变黄，吸出上清检测。

实验案例一：pedvcaj毒株n和s基因扩增及重组载体的构建

根据genbank中已发表的猪流行性腹泻病毒cv777毒株基因序列，用dnastar生物学软件分析，选择抗原性良好的区域，设计n和s基因编码区引物，并在上下游引物中分别加入限制性核酸内切酶sali和xhoi(n基因)，kpni和xbai(s基因)的识别位点及保护性碱基，以反转录得到的cdna为模板，用设计的引物进行n基因和s基因的扩增。将n和s基因与表达载体进行连接、转化到感受态rosseta中，挑取单菌落，接种lb液体培养基，12h后进行菌液pcr，鉴定阳性的菌液进行扩大培养，提取质粒，分别用sali、xbai以及xbai、kpni双酶切鉴定。

结果：扩增产物经电泳后分别得到大小约为1400bp和1300bp的条带，与预期结果一致。酶切产物结果与预期一致，表明目的基因以及成功插入到原核表达载体pcoldi中，得到阳性重组质粒pcoldi-n、pcoldi-s。(见图1和2)。

实验案例二：重组蛋白的诱导表达。

取鉴定正确的重组质粒pcoldi-n和pcoldi-s，以及空载体pcoldi，用含有终浓度为1mm的iptg液体lb培养基，37℃诱导表达8h，离心收集沉淀，经超声破碎后离心分别收集上清和沉淀，经sds-page分析。

结果：在重组质粒pcoldi-n裂解上清和沉淀中均可见一条分子量约为58kd的蛋白条带(见图3)，说明重组蛋白n成功表达，且大部分为可溶性蛋白。在重组质粒pcoldi-s裂解沉淀中可见一条分子量约55kd的蛋白条带，但在裂解上清中则无该条带，表明重组蛋白s成功表达，且为不可溶的包涵体蛋白(见图4)。

实验案例三：重组蛋白的纯化。

按照优化的表达条件，分别对n和s蛋白进行大量的诱导表达，表达产物处理后经histrapf柱层析纯化并透析浓缩，取适量纯化蛋白经sds-page分析纯化效果，余下蛋白测得浓度后﹣20℃保存备用。

结果：sds-page显示，重组n蛋白以及重组s蛋白纯化效果良好(见图5)。

实验案例四：单克隆抗体与病毒蛋白反应

将vero细胞培养于6孔板，待细胞生长状态良好并长满时，以0.5moipedv感染细胞，37℃感染2h，后换成维持液，37℃感染8h，当cpe达到80％时，用pbs洗三遍，每孔加入1mlpbs，50μledta，37℃消化5min，轻轻吹下细胞，收集于1.5mlep管，8000rpm/min，4℃，离心5min，弃上清，再次离心1min，弃上清，根据细胞团块大小加入适量裂解缓冲液，冰上孵育15min，后15000rpm/min，4℃，离心15min，吸取上清，加入等体积的2×loadingbuffer，混匀后，放置金属浴，95℃煮样5min，取15μl样品，同时用未接毒的样品作为阴性对照，进行sds-page，120伏电泳恒压120min，结束后进行westernblot分析。

从胶板上轻轻取下分离胶，与pvdf膜以及滤纸共同组成三明治样结构，用玻璃棒赶净其中气泡；放入半干转转印机进行转印，15伏恒压30min；取出pvdf膜，1×tbst快洗3次，放入5％脱脂奶中，摇床震荡孵育1h；1×tbst快洗3次，慢洗3次，每次3min，将确定为阳性的杂交瘤细胞培养上清作为一抗，4℃孵育过夜；从一抗管中取出pvdf膜，用1×tbst快洗3次，慢洗3次，每次3min，置于hrp标记的山羊抗鼠igg抗体稀释液中(用5％脱脂奶1:3000稀释)，摇床震荡孵育1h；用1×tbst快洗3次，慢洗3次，每次3min，将pvdf膜置于保鲜膜上，用现配的化学发光底物显色液孵育5min，然后经超灵敏化学发光成像系统分析结果。

结果：用western-blotting试验测定所获得的3株单抗特异性，以确定稳定分泌单抗的杂交瘤细胞培养上清为一抗，hrp-羊抗鼠igg为二抗，结果在55kda可见一条特异性反应带(图6)，表明单抗能与pedvn蛋白发生特异性反应，是针对pedvn蛋白的单抗。

图1a中，m：dl2000dna分子质量标准；1：n基因pcr产物；

图1b、图1c中，m：dl2000dna分子质量标准；1-7；菌液pcr产物；8：阴性对照9：阳性对照10：重组载体pcoldi-nsali和xbai双酶切产物。

图2a中，m：dl2000dna分子质量标准；1：s基因pcr产物。

图2b、图2c中，m(图2b)：dnamarkerf；m(2c)：dl2000dna分子质量标准；1-17；菌液pcr产物；18：阴性对照；19：阳性对照20：重组载体pcoldi-sxbai和kpni双酶切产物。

图3中，m：蛋白质相对分子质量标准；1：空载体未诱导超声破碎上清；2：空载体诱导超声破碎上清；3：重组载体未诱导超声破碎上清；4：重组载体诱导超声破碎上清；5：空载体未诱导超声破碎沉淀；6：空载体诱导超声破碎沉淀；7：重组载体未诱导超声破碎沉淀；8：重组载体诱导超声破碎沉淀。

图4中，m：蛋白质相对分子质量标准；分子质量标准；1：空载体未诱导超声破碎上清；2：空载体诱导超声破碎上清；3：重组载体未诱导超声破碎上清；4：重组载体诱导超声破碎上清；5：空载体未诱导超声破碎沉淀；6：空载体诱导超声破碎沉淀；7：重组载体未诱导超声破碎沉淀；8：重组载体诱导超声破碎沉淀。

图5a中，m：蛋白质相对分子质量标准1：未纯化的n蛋白2：纯化后的n蛋。

图5b中，m：蛋白质相对分子质量标准1：未纯化的s蛋白2：纯化后的s蛋白。

图6a、图6b、图6c中，m:蛋白质相对分子质量标准；1：阴性对照；2：4b8与pedv全病毒反应；4：4c10与pedv全病毒反应；6:3c3与pedv全病毒反应。