本发明涉及生物医学领域的病毒免疫学检测
技术领域：
，特别是涉及一种gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及用途。
背景技术：
：诺如病毒(norovirus，nov)是引起病毒性胃肠炎最主要的病原体，全世界近90％的病毒性胃肠炎流行都是由nov引起的，在发展中国家每年至少有20万5岁以下儿童因nov引起的腹泻而丧生。nov是单股正链rna病毒，属杯状病毒科，无包膜、无折叠，衣壳呈二十面体对称结构。其全基因组编码三个开放阅读框(orf)，其中orf2编码主要结构蛋白vp1，由s区和向外凸起的p区域两部分组成。nov具有基因多样性，基于vp1序列分为5个基因组(gi-gv)，其中感染人类的主要为gⅱ基因组。nov的基因和抗原性具有丰富的多样性。研究表明，gii是全球多数国家病毒性急性肠胃炎暴发及散发最主要的病原体，基因型优势株为gii.4，占60-80％以上。自20世纪90年代中期首次确认gii.4型毒株导致绝大部分胃肠炎暴发后，gii.4型毒株一直为全球优势流行株。nov变异速度快，每2-4年gii.4型nov进化形成新的基因簇，取代原有基因簇成为优势流行株而造成多次全球规模的大流行，1995年至今，由不同变异株引起了7次全球nov暴发流行，分别是95/96-us株(1995-2002年)、farmingtonhills株(2002-2004年)、hunter株(2003-2006年)、2006a株(2006-2008)和2006b株(2006-2009)、osaka株(2007-2008)、neworleans株(2009-至今)和sydney株(2012-至今)，因此，有必要研制对同型和异型nov兼具免疫保护作用的高效疫苗。病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的起始步骤和关键因素之一。受体对于宿主非常关键，且感染性病原体往往为了适应不同的受体表型选择性进化。研究发现，人类组织血型抗原(hbga)是nov的病毒受体，hbga是一类具有高度多态性的糖类抗原，广泛分布于人体的上皮细胞和红细胞表面、腺上皮组织及其分泌物中。研究发现不同基因型的流行率与其结合宿主谱一致，其中gii.4由于其可以结合所有的a、b、o分泌性抗原，成为优势流行株。衣壳蛋白vp1是nov抗原主要决定簇，并负责识别宿主受体。衣壳蛋白vp1可以划分为2个区域，分别为衣壳蛋白中间的s区域和向外突出的p区域。p区域又可分为p1和p2两个主要的亚区。p1亚区与抗原性有关，而p2亚区被认为与细胞受体结合有关。novp区域在大肠杆菌中表达时，可形成p二聚体、12聚体小颗粒和24聚体p颗粒，这三种不同p聚合体都具有免疫原性并且可识别hbga受体。p颗粒具有与vlp类似的立体空间结构，及天然结合宿主受体特性和高免疫原性。诺如病毒缺少细胞培养模型，也没有小动物模型，这给疫苗和抗病毒药物的研究带来了很大的阻碍。目前对nov的诊断方法主要是免疫电镜法(iem)、放射免疫法(ria)、酶联免疫试验(elisa法)、实时荧光定量-聚合酶链反应(realtime-pcr)等，其中夹心elisa法，用单克隆抗体(monoclonalantibody，mab)捕获粪便中的病毒抗原，mab具有交叉反应小，灵敏度高，特异性强的特点，在许多疾病的诊断中已得到广泛应用。因此，本领域技术人员致力于开发具有良好临床应用前景的抗诺如病毒药物。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及其用途。本发明的目的通过以下技术措施实现。提供一种gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：1)，免疫原的制备，具体是：扩增或设计合成p序列，构建pgex-4t-1-p重组表达载体，利用大肠杆菌表达系统表达novgⅱ.4型p蛋白，经gst亲和层析柱纯化，制备p颗粒；2)，动物免疫，具体是：取6-8周龄雌性balb/c小鼠，将nov96簇(va387)、2004簇、2006b簇和2010簇4种gⅱ.4型novp颗粒等比例混合，再与等体积的弗式完全佐剂混合并充分乳化，在小鼠颈背部皮下多点免疫，免疫量为60ug/只；间隔14天后，用等量的复合抗原伴有弗氏不完全佐剂进行加强免疫，免疫量为30ug/只，共进行5次加强免疫，以60ug/只的免疫量冲击免疫3天后取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；3)杂交瘤细胞株的制备和筛选，具体是：将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过peg1500融合，制备杂交瘤细胞；七天之后，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选特异性针对gⅱ.4型诺如病毒的抗体；4)杂交瘤细胞的克隆化，具体是：采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆，连续克隆培养3次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养阳性细胞株，冻存。进一步的，上述的gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，步骤1)中制备的免疫原为gⅱ.4型novp颗粒，分别为gⅱ.4型nov96簇、2004簇、2006b簇和2010簇。进一步的，上述的gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，分别采用nov96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种gⅱ.4型novp序列按照步骤1)的方法制备得到nov96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种gⅱ.4型p颗粒。进一步的，上述的gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，步骤1)中免疫原的制备过程具体是：将p序列进行bamhi和noti双酶切，再与经bamhi和noti双酶切的pgex-4t-1表达载体连接得到连接产物pgex-4t-1-p，连接产物pgex-4t-1-p转化至感受态细胞top10得到重组质粒，将重组质粒经双酶切鉴定；将鉴定正确的重组质粒转化到感受态细胞bl21，挑取单个菌落接种于5ml氨苄青霉素含量为100mg/ml的lb液体培养基中，在37℃下、以200r/min震荡培养12-16h，将培养物以1:100的稀释度接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃震荡培养3.5h至od600为0.4-0.6，加入iptg使得iptg在lb液体培养基中的终浓度为0.4mmol/l；继续在22℃下，以220r/min震荡培养12-16h；于4℃、5000rmp离心菌液12min，弃上清，收集菌体，用80mlpbs重悬菌体，并将菌液于冰浴中对其进行超声破碎，于4℃，12000rmp离心75min；利用gst-resin结合gst-p蛋白，用pbs洗去杂蛋白，用凝血酶除去融合蛋白gst-p的gst标签蛋白，获得p颗粒。进一步的，上述的gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，步骤3)中通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选特异性针对gⅱ.4型诺如病毒的抗体，具体是：以novva387p颗粒作为包被抗原、hrp-羊抗鼠igg多克隆抗体为二抗，建立间接elisa检测方法筛选阳性杂交瘤细胞，并以抗va387p颗粒鼠多抗血清为阳性对照，未免疫鼠血清为阴性对照，通过酶标仪读取od450值；读数时以p/n值>2.1为判断标准，p/n值>2.1判定为阳性，否则为阴性。本发明同时提供一种抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体，通过上述的方法制备而成。本发明还提供一种试剂盒，用于检测nov抗原或nov的igg或igm，所述试剂盒中含有上述的抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体。进一步的，上述抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体选择gii.4、gii.3或者gii.17基因型中的至少一种。本发明的gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，能够制备出具有针对nov特异性强、敏感性高、稳定的抗体，且可用于作为nov检测试剂盒。具体实施方式结合以下实施例对本发明作进一步说明。实施例1。一种gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：1)，免疫原的制备，具体是扩增或设计合成p序列，构建pgex-4t-1-p重组表达载体，利用大肠杆菌表达系统表达novgⅱ.4型p蛋白，经gst亲和层析柱纯化，制备p颗粒。本发明所制备的免疫原为gⅱ.4型novp颗粒，分别为gⅱ.4型nov96簇、2004簇、2006b簇和2010簇。具体是分别采用nov96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种gⅱ.4型novp序列按照步骤1)免疫原的制备方法对应制备得到nov96簇、2004簇、2006b簇和2010簇4种gⅱ.4型p颗粒。步骤1)中免疫原的制备过程具体是：将p序列进行bamhi和noti双酶切，再与经bamhi和noti双酶切的pgex-4t-1表达载体连接得到连接产物pgex-4t-1-p，连接产物pgex-4t-1-p转化至感受态细胞top10得到重组质粒，将重组质粒经双酶切鉴定；将鉴定正确的重组质粒转化到感受态细胞bl21，挑取单个菌落接种于5ml氨苄青霉素含量为100mg/ml的lb液体培养基中，在37℃下、以200r/min震荡培养12-16h，将培养物以1:100的稀释度接种于新鲜lb液体培养基中，于37℃震荡培养3.5h至od600为0.4-0.6，加入iptg使得iptg在lb液体培养基中的终浓度为0.4mmol/l；继续在22℃下，以220r/min震荡培养12-16h；于4℃、5000rmp离心菌液12min，弃上清，收集菌体，用80mlpbs重悬菌体，并将菌液于冰浴中对其进行超声破碎，于4℃、12000rmp离心75min；利用gst-resin结合gst-p蛋白，用pbs洗去杂蛋白，用凝血酶除去融合蛋白gst-p的gst标签蛋白，获得p颗粒。2)，动物免疫，具体是：取6-8周龄雌性balb/c小鼠，将nov96簇(va387)、2004簇、2006b簇和2010簇4种gⅱ.4型novp颗粒等比例混合，再与等体积的弗式完全佐剂混合并充分乳化，在小鼠颈背部皮下多点免疫，免疫量为60ug/只；间隔14天后，用等量的复合抗原伴有弗氏不完全佐剂进行加强免疫，免疫量为30ug/只，共进行5次加强免疫，以60ug/只的免疫量冲击免疫3天后取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞。3)杂交瘤细胞株的制备和筛选，具体是：将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过peg1500融合，制备杂交瘤细胞；七天之后，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选特异性针对gⅱ.4型诺如病毒的抗体。筛选过程具体是：以novva387p颗粒作为包被抗原、hrp-羊抗鼠igg多克隆抗体为二抗，建立间接elisa检测方法筛选阳性杂交瘤细胞，并以抗va387p颗粒鼠多抗血清为阳性对照，未免疫鼠血清为阴性对照，通过酶标仪读取od450值；读数时以p/n值>2.1为判断标准，p/n值>2.1判定为阳性，否则为阴性。4)杂交瘤细胞的克隆化，具体是：采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆，连续克隆培养3次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养阳性细胞株，冻存。结果续3次亚克隆阳性杂交瘤细胞得到13株稳定分泌抗体的细胞株，编号为c5a，e10h，g2b，g7c，g2e，e10e，g6e，g4d，e11b，g3e，e4c，c4g，e2h。本发明的gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法，能够制备出具有针对nov特异性强、敏感性高、稳定的抗体。为了验证其性能，进入如下检测。a.nov单克隆抗体(mab)的生物学性状a1.免疫球蛋白亚类鉴定按照义翘神州小鼠单抗亚类鉴定试剂盒说明书对步骤4得到的单克隆抗体进行分型鉴定。结果13株单抗分泌的抗体类型均为igg1亚型。a2.mab效价测定用上述步骤1得到纯化的p颗粒用pbs缓冲液稀释至2μg/ml每孔100μl包被于96孔酶标板上，4℃过夜；0.05％pbst洗板1次，5％脱脂奶粉-pbs200μl于37℃封闭2h；0.05％pbst洗板1次，每孔分别加入用1％脱脂奶粉-pbs连续倍比稀释步骤4得到的单克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；0.05％pbst洗板5次，加入hpr-羊抗鼠igg(1∶5000)100μl/孔37℃孵育1h；0.05％pbst洗板5次，使用tmb避光显色10min后每孔加入100μl2m磷酸终止反应，测定波长为450nm的吸光值。每板均设无单克隆抗体对照。以实验组的od450nm/对照组的od450nm＞2.1的孔判为阳性。结果梯度稀释测得13株单抗细胞上清的抗体效价均能达到10-4-10-6。a3.mab特异性鉴定采用间接elisa法鉴定mab特异性，用gⅱ.3，gⅱ.17和gⅱ.4型p颗粒包被酶标板，其中gⅱ.4型变异株包括联合免疫株别2006b簇和非联合免疫株别2008b簇、2012/sydney簇p颗粒。对照设置为采用同样的原核表达系统表达的轮状病毒(rotavirus，rv)vp8融合蛋白(gst-vp8)。结果显示，13株mab与gⅱ.4型nov联合免疫株别2006b簇和非联合免疫株别2008b簇、2012/sydney簇均有良好的反应性，但与rvgst-vp8均不反应，表明13株单克隆抗体有针对nov较强的特异性，且筛选出13株单克隆抗体对gⅱ.4各株均有较强的结合活性。其中c5a，g2b，g6e，g3e，c4g5株mab与gⅱ.3和gⅱ.17型nov均具有结合反应能力，表明筛选出5株单克隆抗体对gⅱ.4、gⅱ.3和gⅱ.17型各基因型均有较强的结合活性。a4.mab识别表位的构象依赖性采用间接elisa法，用经热处理变性和非变性的va387包被酶标板。结果见表1，对va387进行热处理破坏其高级结构后，e11b，e2h，e4c，g4d和g6e这5株mab的反应性均有显著下降，表明这5株mab识别的表位依赖于特定的空间构象。而mabc4g和e10e的反应性升高，c5a，e10h，g2b和g3e对va387聚体、热处理后蛋白的反应性均基本相同，表明这7株mab识别的表位基本不受空间结构的影响，属于线性表位。表1变性和非变性的va387间接elisa检测od值单克隆抗体c4gc5ae10ee10he11be2he4cg2bg3eg4dg6e非变性0.6590.4990.8590.7740.8410.9241.0781.1910.9012.4061.363变性0.8540.5951.1140.8750.6290.5390.5111.2741.0452.2181.161差值-0.195-0.096-0.255-0.1010.2120.3850.567-0.083-0.1440.1880.202a5.体外替代中和试验人类组织血型抗原(humanhisto-bloodgroupantigen，hbga)是分布在粘膜组织和红细胞上的糖类，是nov感染所需的受体。基于hbga受体的结合阻断试验已被广泛应用于nov体外替代中和试验。基于novp颗粒与唾液hbga受体的结合实验，增加待测单抗样本阻断步骤，以hbga表型为分泌型b型的人唾液样品作为包被抗原，将0.2μg/mlva387p颗粒与待测mab(以1:25为起始稀释度，两倍梯度稀释)37℃共同孵育，以未加mab样本的va387p颗粒od450nm值为阴性对照，计算mab样本的阻断率，作为衡量抗体特异性阻断蛋白结合位点的中和能力指标。结果见表2，其中3株mab，即g7c，g2e，g4d具有明显的阻断能力，且稀释度为1:50时，阻断率均超过80％。表2mab阻断va387-hbga结合能力上述实验数据表明，本发明的这种抗nov单克隆抗体具有针对nov特异性强，敏感性高，稳定，适合用于制备nov检测试剂盒。实施例2。一种试剂盒，用于检测nov抗原或nov的igg或igm，所述试剂盒中含有实施例1的方法所制备的抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体。抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体可以选择gii.4、gii.3或者gii.17基因型中的至少一种。由于本发明所制备的单克隆抗体对于novgii.4、gii.3、gii.17三种基因型均有高水平的结合效果，所以本发明的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合可用于作为制备检测novgii.4、gii.3、gii.17三种基因型的抗原的试剂、药剂或试剂盒用途，可进一步用于诊断nov感染。本发明的这种抗nov单克隆抗体具有针对nov特异性强，敏感性高，稳定，适合用于制备nov检测试剂盒。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>南方医科大学<120>一种gii.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法<130>gzzrh0504-19-188<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>318<212>prt<213>人工序列(artificial)<400>1serargthrlysprophethrvalproileleuthrvalgluglumet151015serasnserargpheproileproleuglulysleutyrthrglypro202530serseralaphevalvalglnproglnasnglyargcysthrthrasp354045glyvalleuleuglythrthrglnleuseralavalasnilecysthr505560pheargglyaspvalthrhisilealaglyserhisasptyrilemet65707580asnleualaserglnasntrpasnasntyraspprothrglugluile859095proalaproleuglythrproaspphevalglylysileglnglymet100105110leuthrglnthrthrarggluaspglyserthrargalahislysala115120125thrvalserthrglyservalhisphethrprolysleuglyserval130135140glntyrthrthraspthrasnasnaspleuglnthrglyglnasnthr145150155160lysphethrprovalglyvalileglnaspglyasnasnhisglnasn165170175gluproglnglntrpvalleuproasntyrserglyargthrglyhis180185190asnvalhisleualaproalavalalaprothrpheproglyglugln195200205leuleuphepheargserthrmetproglycysserglytyrproasn210215220metasnleuaspcysleuleuproglnglutrpvalglnhisphetyr225230235240glnglualaalaproalaglnseraspvalalaleuleuargpheval245250255asnproaspthrglyargvalleupheglucyslysleuhislysser260265270glytyrvalthrvalalahisthrglyprohisaspleuvalilepro275280285proasnglytyrpheargpheaspsertrpvalasnglnphetyrthr290295300leualaprometglyasnglyalaglyargargargalaleu305310315<210>2<211>319<212>prt<213>人工序列(artificial)<400>2serargthrlyspropheservalproileleuthrvalgluglumet151015thrasnserargpheproileproleuglulysleuphethrglypro202530serseralaphevalvalglnproglnasnglyargcysthrthrasp354045glyvalleuleuglythrthrglnleuserprovalasnilecysthr505560pheargglyaspvalthrhisilealaglythrglnasntyrthrmet65707580asnleualaserglnasntrpasnasntyraspprothrglugluile859095proalaproleuglythrproaspphevalglylysileglnglyval100105110leuthrglnthrthrargargaspglyserthrargglyhislysala115120125thrvalserthrglyservalhisphethrprolysleuglyserval130135140glnpheserthraspthrserasnaspphegluthrglyglnasnthr145150155160argphethrprovalglyvalvalglnaspglyserthrthrhisgln165170175asngluproglnglntrpvalleuproasptyrserglyargaspser180185190hisasnvalhisleualaproalavalalaprothrpheproglyglu195200205glnleuleuphepheargserthrmetproglycysserglytyrpro210215220asnmetasnleuaspcysleuleuproglnglutrpvalglnhisphe225230235240tyrglngluseralaproalaglnseraspvalalaleuleuargphe245250255valasnproaspthrglyargvalleupheglucyslysleuhislys260265270serglytyrvalthrvalalahisthrglyglnhisaspleuvalile275280285proproasnglytyrpheargpheaspsertrpvalasnglnphetyr290295300thrleualaprometglyasnglyalaglyargargargalaleu305310315<210>3<211>319<212>prt<213>人工序列(artificial)<400>3serargthrlysprophethrvalproileleuthrvalgluglumet151015thrasnserargpheproileproleuglulysleuphethrglypro202530serglyalaphevalvalglnproglnasnglyargcysthrthrasp354045glyvalleuleuglythrthrglnleuserprovalasnilecysthr505560pheargglyaspvalthrhisilealaglyserargasntyrthrmet65707580asnleualaserleuasntrpasnasntyraspprothrglugluile859095proalaproleuglythrproaspphevalglylysileglnglyval100105110leuthrglnthrthrlysglyaspglyserthrargglyhislysala115120125thrvaltyrthrglyseralaprophethrprolysleuglyserval130135140glnpheserthraspthrgluasnaspphegluthrhisglnasnthr145150155160lysphethrprovalglyvalileglnaspglyserthrthrhisarg165170175asngluproglnglntrpvalleuprosertyrserglyargasnval180185190hisasnvalhisleualaproalavalalaprothrpheproglyglu195200205glnleuleuphepheargserthrmetproglycysserglytyrpro210215220asnmetaspleuaspcysleuleuproglnglutrpvalglnhisphe225230235240tyrglnglualaalaproalaglnseraspvalalaleuleuargphe245250255valasnproaspthrglyargvalleupheglucyslysleuhislys260265270serglytyrvalthrvalalahisthrglyglnhisaspleuvalile275280285proproasnglytyrpheargpheaspsertrpvalasnglnphetyr290295300thrleualaprometglyasnglythrglyargargargalaleu305310315<210>4<211>319<212>prt<213>人工序列(artificial)<400>4serargthrlyspropheservalprovalleuthrvalgluglumet151015thrasnserargpheproileproleuglulysleuphethrglypro202530serseralaphevalvalglnproglnasnglyargcysthrthrasp354045glyvalleuleuglythrthrglnleuserprovalasnilecysthr505560pheargglyaspvalthrhisileproglyserargasntyrthrmet65707580asnleualaserglnasntrpasnsertyraspprothrglugluile859095proalaproleuglythrproaspphevalglylysileglnglyval100105110leuthrglnthrthrargthrasnglyserthrargglyhislysala115120125thrvaltyrthrglyseralaasppheserprolysleuglyargval130135140glnphealathraspthraspasnaspphegluthrasnglnasnthr145150155160lysphethrprovalglyvalileglnaspglyserthrthrproarg165170175asngluproglnglntrpvalleuprosertyrserglyargasnile180185190hisasnvalhisleualaproalavalalaprothrpheproglyglu195200205glnleuleuphepheargserthrmetproglycysserglytyrpro210215220asnmetaspleuaspcysleuleuproglnglutrpvalglntyrphe225230235240tyrglnglualaalaproalaglnseraspvalalaleuleuargphe245250255valasnproaspthrglyargvalleupheglucyslysleuhislys260265270serglytyrvalthrvalalahisthrglyglnhisaspleuvalile275280285proproasnglytyrpheargpheaspsertrpvalasnglnphetyr290295300thrleualaprometglyasnglythrglyargargargalaleu305310315当前第1页12