一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药
技术领域：
。
背景技术：
：裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus，rvfv)是严重威胁人类和动物健康的虫媒病毒之一，属于布尼亚病毒目(bunyavirale)白细病毒科(phenuiviridae)白蛉病毒属(phlebovirus)，可引起人畜共患病裂谷热(riftvalleyfever，rvf)，致牲畜死亡和流产。其表面覆有囊膜及糖蛋白突起，由3段负链rna构成病毒基因组(s、m和l)，其中，m片段编码表面糖蛋白gn和gc，且在gn的5’端编码非结构蛋白(nsm)，而gn和gc是病毒的主要囊膜蛋白，是病毒进行入侵和膜融合的关键蛋白；其传播范围十分广，绵羊、山羊、牛、水牛、骆驼等家畜均可感染该病毒；其致死率十分高，尤其是年幼的动物，一旦感染，病死率接近100％。人也会感染rvfv，且多数症状轻微，可自愈，但是，也有部分患者出现重症，其中，5-10％的患者的视网膜会产生退行性病变，重者可导致单眼或双眼永久性失明；<1％的患者会出现出血热，其中，50％的患者会死亡；<1％的患者会出现脑炎，出现此症状的患者虽死亡率不高，但通常会留下严重的后遗症，如偏瘫等。就时间上来说，1930年，科学家danbney等在肯尼亚大裂谷的一次绵羊疾病暴发调查中首次分离到rvfv，自此，人们发现rvf疫情会在动物和人类中定期暴发，造成重大损失。例如，1977-1978年，rvf疫情在埃及暴发，当时共计有20万人感染，其中包括18,000例重症患者及600例死亡病例；而自2000年到2018年6月，全球共向世界卫生组织(who)通报了4830例重症rvf病例，其中包括967例死亡病例，死亡率约为20.0％。就地域上来说，通常，rvfv在非洲地区流行。但是，2000年9月，阿拉伯半岛(沙特阿拉伯和也门)也暴发了rvf疫情，这也是首个非洲以外地区报道该疫情；2016年，我国也出现一例输入病例，该患者从安哥拉返回中国。就传播方式上来说，rvfv主要通过蚊虫叮咬传播。已知的可传播本病的蚊子种类多达30种，分布在北极以外的其它各个大陆，因此，rvfv继续向世界扩散的风险非常高。目前，针对动物的rvfv感染的有效预防手段是疫苗。在兽用疫苗方面，肯尼亚和南非使用rvfv的减毒活疫苗，埃及和南非使用福尔马林灭活疫苗。通常，减毒活疫苗仅在绵羊免疫中有效，不能保护牛，且副作用较高，经常引起母羊流产；福尔马林灭活疫苗虽具有更高的安全性，但存在成本高、免疫不持久的问题。而其它种类疫苗仍在研究阶段，包括：dna疫苗、基因工程改造株、vlps等。针对人群的rvfv感染的有效预防手段主要仍是通过免疫家畜、切断传染源。此外，非洲地区的高危人群可接种福尔马林灭活疫苗，但是由于成本问题，不可能大范围接种。人患病后，病毒唑(ribavirin)可能会有治疗效果，但目前临床数据不多。因此，亟需研究出有效的rvfv感染治疗药物，尤其是可治愈重症患者的治疗。在这方面，抗体显示出巨大潜力。技术实现要素：为解决上述问题，本发明对rvfv疫苗进行了研究，发现单独的gn或是gn与gc一起的疫苗形式可有效产生rvfv的中和抗体，也就是说，针对gn或gc的抗体极有可能中和rvfv的感染，成为治疗rvfv感染的药物。因此，本发明以杆状病毒表达的rvfv糖蛋白gn和gc作为抗原，从一例裂谷热康复患者的pbmcs中筛选到可以结合rvfv糖蛋白gn和gc的记忆b细胞，且通过单一b细胞测序、体外中和以及体内保护等实验，鉴定出8株高效中和rvfv感染的gn人源单克隆抗体(r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19、r22)以及一株gc人源单克隆抗体(r5)。本发明的人源单克隆抗体具有非常高的体外中和活性(ic50可低至1.93±0.6pm，达到pm级)，可以有效治疗被rvfv感染的小鼠，预防rvfv对小鼠的感染，具有极高的临床治疗和预防rvfv感染的应用价值。本发明的技术方案如下：本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链以及轻链；所述重链包含重链可变区以及重链恒定区；所述轻链包含轻链可变区以及轻链恒定区；所述抗体或抗原结合片段命名为r4，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r12，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:3所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r13，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:6所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r15，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r16，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:9所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:10所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r17，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:11所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:12所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r19，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:13所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:14所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r22，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:15所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:16所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为r5，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:17所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:18所示。在本发明的一种实施方式中，所述r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19、r22以及r5的重链恒定区的氨基酸序列如seqidno:19所示。在本发明的一种实施方式中，所述r4、r12、r13、r15、r16、r17以及r5的轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno:20所示；所述r19以及r22的轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno:21所示。在本发明的一种实施方式中，所述r4、r12、r13、r15、r16、r17以及r5的重链与轻链均通过ecori和xhoi连接；所述r19和r22的重链通过ecori和xhoi连接，轻链通过saci和xhoi连接。本发明提供了编码上述抗体或抗原结合片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码重链的核苷酸序列以及编码轻链的核苷酸序列；所述编码重链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列；或所述编码重链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、连接序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、连接序列。在本发明的一种实施方式中，所述编码重链的核苷酸序列不包含连接序列时，所述编码重链的核苷酸序列之间可通过pcr相连。在本发明的一种实施方式中，所述编码重链的核苷酸序列包含连接序列时，所述连接序列可为酶切位点序列。在本发明的一种实施方式中，所述编码重链的核苷酸序列包含连接序列时，所述编码重链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、ecori酶切位点序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、xhoi酶切位点序列。在本发明的一种实施方式中，所述编码轻链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列；或所述编码轻链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、连接序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、连接序列。在本发明的一种实施方式中，所述编码轻链的核苷酸序列不包含连接序列时，所述编码重链的核苷酸序列之间可通过pcr相连。在本发明的一种实施方式中，所述编码轻链的核苷酸序列包含连接序列时，所述连接序列可为酶切位点序列。在本发明的一种实施方式中，所述编码轻链的核苷酸序列包含连接序列时，所述编码轻链的核苷酸序列分为编码r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19以及r22轻链的核苷酸序列以及编码r5轻链的核苷酸序列；所述编码r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19以及r22轻链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、saci酶切位点序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、xhoi酶切位点序列；所述编码r5轻链的核苷酸序列依次包含cmv启动子序列、ecori酶切位点序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、xhoi酶切位点序列。在本发明的一种实施方式中，所述前导序列的氨基酸序列如seqidno:22所示。本发明提供了含有上述核苷酸序列的质粒。在本发明的一种实施方式中，所述质粒为病毒质粒。本发明提供了含有上述质粒的宿主细胞。本发明提供了上述抗体或抗原结合片段或上述核苷酸序列或上述质粒或上述宿主细胞在制备治疗和/或预防裂谷热病毒的药物方面的应用。本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有有效预防剂量的上述抗体或抗原结合片段。在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物还含有医药学上可接受的载体。本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有上述抗体或抗原结合片段或上述核苷酸序列或上述质粒或上述宿主细胞。有益效果：(1)本发明通过筛选rvf康复病人的gn和gc特异结合的记忆b细胞，获得8株结合gn的人源高中和活性抗体：r4，r12，r13，r15，r16，r17，r19和r22，以及1株结合gc的人源中和活性抗体：r5；(2)本发明的8株gn-特异性抗体具有非常高的体外中和活性，其中，r15和r16两株gn-特异性抗体的ic50可达到pm级，且体内检测结果表明，这8株gn-特异性抗体可以有效治疗被rvfv感染的小鼠、预防小鼠rvfv的感染；同时，本发明的1株gc-特异性抗体r5在高剂量下也可以中和rvfv感染；(3)本发明的8株gn-特异性人源抗体以及1株gc-特异性人源抗体在临床治疗和预防rvfv感染方面有极高的应用价值。附图说明图1：rvfvgn蛋白纯化分子筛与sds-page结果。图2：rvfvgc蛋白纯化分子筛与sds-page结果。图3：r12轻链与r13轻链与胚系基因比对结果。图4：r16轻链与r17轻链与胚系基因比对结果。图5：r4纯化的分子筛层析结果。图6：r5纯化的分子筛层析结果。图7：r12纯化的分子筛层析结果。图8：r13纯化的分子筛层析结果。图9：r15纯化的分子筛层析结果。图10：r16纯化的分子筛层析结果。图11：r17纯化的分子筛层析结果。图12：r19纯化的分子筛层析结果。图13：r22纯化的分子筛层析结果。图14：抗体与rvfvgn和gc结合的动力学曲线。图15：抗体对rvfv的中和曲线。图16：抗体对感染rvfv小鼠的治疗效果。图17：抗体预防小鼠感染rvfv的效果。图18：rvfv抗体对gn四聚体与huh7细胞结合的阻断作用。图19：rvfv抗体对rvfv病毒粒子与vero细胞结合的阻断作用。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的pfastbac1载体、pcaggs载体购自优宝生物；下述实施例中涉及的大肠杆菌dh10bac感受态细胞、hek293t细胞、hi5昆虫细胞购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；下述实施例中涉及的昆虫sf9细胞购自北纳生物。实施例1：rvfvgn与gc蛋白的表达与纯化将编码rvfvgn(氨基酸序列如seqidno:23所示)与gc(氨基酸序列如seqidno:24所示)蛋白的基因分别连接到pfastbac1载体中，其中，gn与gc蛋白基因的n端连接有昆虫细胞膜蛋白gp67信号肽序列，用于抗体的分泌；c末端连接有his标签，便于纯化和b细胞的染色；所有编码基因均进行了昆虫细胞密码子优化。将含有目的基因的pfastbac1载体转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，在含有氨苄霉素，卡那霉素和四环霉素以及blue-gal的平板上，进行蓝白斑筛选重组的杆状病毒。白色菌斑经过m13上下游引物pcr鉴定后，阳性的克隆摇菌，通过异丙醇沉淀的方法提取重组的bacmid。用重组的bacmid转染昆虫sf9细胞，在无血清的培养基中培养3天，观察细胞形态变化和增殖情况。当sf9细胞明显膨胀，出现少量死亡细胞，且不在增殖时收取病毒液上清，此为p1代。继续扩增杆状病毒至p4代后，感染hi5昆虫细胞，用于gn和gc的表达。将含有目的蛋白的hi5细胞培养上清通过离心和过滤(0.22μm)去除细胞碎片后，与histrapff(gehealthcare)镍螯合柱结合，再以不同浓度的咪唑洗脱层析柱，分别收集洗脱蛋白，通过sds-page结果判断含有目的蛋白的样品。收集含有目的蛋白的洗脱峰，浓缩后，进行分子筛层析，根据蛋白大小确定出峰位置，结合sds-page的结果判断的蛋白的大小和纯度(sds-page与分子筛结果见图1-2)。实施例2：rvfvgn与gc蛋白特异性记忆b细胞的分离在病人的知情同意下，采集30ml的血液，分离pbmcs。将分离的pbmcs以107个/ml的密度与终浓度100nm的rvfvgn和rvfvgc蛋白于冰上孵育结合半小时，然后用pbs洗2次，再与下列抗体冰上孵育半小时：anti-humancd3/pe-cy5，anti-humancd16/pe-cy5，anti-humancd235a/pe-cy5，anti-humancd19/apc-cy7，anti-humancd27/pacificblue，anti-humancd38/apc，anti-humanigg/fitc以及anti-his/pe，然后用pbs洗2次。经facsariaiii分选收集pe-cy5-apc-apc-cy7+pacificblue+fitc+pe+的细胞，直接收集到96孔板内，1细胞/孔。实施例3：单一b细胞pcr及序列分析将实施例2获得的细胞通过superscriptiiireversetranscriptase(invitrogen)逆转录，55℃反应60min。将此逆转录产物作为模板，用hotstartapplus酶(qiagen)进行pcr，扩增抗体可变区序列(pcra)，反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s，55℃(重链/κ链)/50℃(λ链)，30s，72℃，90s，35个循环，72℃，7min。将此作为模板再进行1轮pcr(pcrb)，条件如下：95℃，5min；95℃，30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)，30s，72℃，90s，35个循环，72℃，7min。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离pcr产物，条带大小在400-500bp的切胶回收后送测序公司测序，测序结果用imgt在线软件进行分析。分析正确的可变区序列与相应的重链/κ链/λ链的恒定区通过搭桥pcr连接，克隆至表达载体pcaggs中，得到含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒；其中，重链与λ链以ecori和xhoi连接，与κ链以saci与xhoi连接。人源抗体设计策略如下：重链：cmvpromoter-ecori-leadersequences-重链可变区-ch-xhoi；轻链(κ)：cmvpromoter-saci-leadersequences-轻链可变区-cl(κ)-xhoi；轻链(λ)：cmvpromoter-ecori-leadersequences-轻链可变区-cl(λ)-xhoi；得到了9个抗体：r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19、r22以及r5，其中，r4的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2所示；r12的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:3所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示；r13的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:6所示；r15的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示；r16的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:9所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:10所示；r17的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:11所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:12所示；r19的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:13所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:14所示；r22的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:15所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:16所示；r5的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:17所示且轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:18所示；ch区氨基酸序列如seqidno:19所示；cl(κ)区(即r4、r12、r13、r15、r16、r17以及r5的轻链)氨基酸序列如seqidno:20所示；cl(λ)区(即r19以及r22的轻链)氨基酸序列如seqidno:21所示；leadersequences的氨基酸序列如seqidno:22所示。将r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19、r22以及r5的轻链序列分别与胚系基因进行比对，其中，r12轻链与r13轻链与胚系基因比对结果见图3，r16轻链与r17轻链与胚系基因比对结果见图4。如图3所示，序列分析显示，r12轻链与r13轻链具有相同的序列一致性最高的胚系基因，即iglv5-37*01和lj3*02，并且，r12轻链和r13轻链具有相同cdr3序列；如图4所示，序列分析显示，r16和r17轻链具有相同的序列一致性最高的胚系基因，即iglv3-21*03和lj1*01，但是，由于序列v与j基因在序列插入和缺失中的模式不同，r16轻链和r17轻链的cdr3序列和数目不同。实施例4：抗体的表达及纯化用含10％fbs的dmem培养293t细胞，用实施例3得到的含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒共转染293t，转染4-6小时后给细胞换液成无血清的dmem继续培养3天，收集上清，并补加dmem，再培养4天，收集上清。收集的上清经过5000rpm离心30min后，与含有20mm磷酸钠(ph8.0)等体积混合，经过0.22μm滤膜过滤后，与proteina预装柱结合(5ml，gehealthcare)，以10mm甘氨酸(ph3.0)洗脱结合的蛋白，收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析，目的峰通过sds-page确定，得到纯化后的抗体r4、r12、r13、r15、r16、r17、r19、r22以及r5(分子筛层析结果如图5-13)。实施例5：抗体的性能检测(1)表面等离子共振技术检测抗体与rvfvgn和gc的结合能力表面等离子共振分析利用biacoret100(biacoreinc.)进行，具体步骤如下：将anti-humanigg的抗体以氨基偶联的方式固定在cm5芯片的通道(flowcell,fc)1与fc2，固定量控制在10000响应值(responseunits，ru)左右，将通道调至fc2，然后以抗体捕获的方式结合实施例4得到的纯化后的抗体，此时，液流速度控制在10μl/min，进样1min，抗体捕获量在100ru左右。以10mmhepes，150mmnacl，ph7.4溶液倍比稀释zikv-e蛋白，流速调至30μl/min，通道调至fc2-fc1的模式后，从低浓度开始逐一上样rvfvgn蛋白或gc，其中，结合动力学常数的计算是利用biaevaluationsoftwaret100(biacore，inc.)软件进行(抗体与gn或gc结合的动力学曲线如图14所示，抗体对rvfvgn和gc的亲和力如表1所示)。表1抗体对rvfvgn和gc的亲和力(2)中和试验将实施例4得到的纯化后的抗体以3倍倍比稀释，与8x103pfu的rvfv(vero扩增)混合，37℃共孵育60分钟，然后将混合液加入到已铺满vero细胞的24孔板中，300μl/孔，37℃孵育1小时后，每孔补充培养基(dmem,10％fbs)1ml，继续培养48小时后染色。收集细胞，用含4％多聚甲醛，0.05％的soponin的pbs处理细胞，冰上避光静置30min。然后以solution溶液(pbs，1％bsa，0.01％soponin)洗涤细胞2次，与2μg/ml的r4抗体冰上孵育30min后，solution溶液洗涤细胞2次，再与1:200稀释的anti-humanigg避光冰上孵育30min，solution溶液洗2次后，用facscanto检测细胞阳性比例，根据不同浓度下阳性比例，计算抗体对rvfv的中和能力(抗体对rvfv的中和曲线如图15所示，抗体对rvfv的体外中和能力如表2)。表2抗体对rvfv的体外中和能力abic50(mean±sd，pm)r4312±146r521600±21600r1212.3±10.7r13375±210r153.53±1.67r161.93±0.6r1716.9±15.9r19341±131r22481±3.93(3)动物保护试验rvfv感染可致balb/c小鼠死亡，下面以同型抗体作为阴性对照，应用预防和治疗两种方法检测实施例4得到的纯化后的抗体治疗rvfv感染的效果。治疗效果：将小鼠以4-5只分组，每只小鼠腹腔注射1x103pfu的rvfv，感染24小时后，再分别通过腹腔注射单一剂量的抗体，剂量为10mg/kg，记录14天内小鼠的存活与体重变化，体重变化超过20％的小鼠处死，其中，z3l1组注射的是同型抗体(结果如图16所示)。预防效果：将小鼠以4-5只分组，每只小鼠腹腔注射单一剂量的抗体，剂量为10mg/kg，24小时后，再分别通过腹腔注射1x103pfu的rvfv，记录14天内小鼠的存活与体重变化，体重变化超过20％的小鼠处死，其中，z3l1组注射的是同型抗体(结果如图17所示)。(4)抗体作用机制检测在gn的c端引入生物素化标签，通过hek293t细胞表达，再经过histrapff(gehealthcare)镍螯合柱和分子筛层析柱纯化。纯化的gn蛋白经过bira的反应，在生物素化标签上加上biotin分子。biotin分子与streptavidin有极高的结合能力。向gn-biotin加入streptavidin/pe后gn会标记上pe荧光素，同时形成四聚体。10μg/mlgn的四聚体先与终浓度为0.6mg/ml的抗体孵育，然后与huh7细胞结合，再与终浓度为5μg/ml的anti-higg/apc结合，最后经过流式分析(分析结果如图18所示)。5×104pfu的rvfv病毒与终浓度为200μg/ml的抗体37℃孵育1小时后，置冰上冷却，再与提前预冷的2×105的vero细胞冰上孵育30min。pbs清洗后，用0.5％的多聚甲醛冰上固定30min，然后与终浓度为5μg/ml的anti-higg/apc结合(结合结果如图19所示)。综上所述，本发明通过筛选rvf康复病人的gn和gc特异结合的记忆b细胞，获得8株结合gn的人源高中和活性抗体：r4，r12，r13，r15，r16，r17，r19和r22，以及1株结合gc的人源中和活性抗体：r5。虽然8株gn-特异性抗体与gn的结合常数较低(表1)，但是却具有非常高的体外中和活性(表2)，其中，r15和r16两株gn-特异性抗体的ic50达到pm级，且体内检测结果表明，分离到的8株gn-特异性抗体可以有效治疗被rvfv感染的小鼠(图16)，同时，这8株抗体也可以有效预防rvfv的感染(图17)，进一步的实验表明，rvfv的gn特异性抗体可以阻断gn与易感细胞的结合(图18)，并且病毒水平的实验也揭示gn特异性抗体可以阻断rvfv病毒粒子与易感细胞的结合(图19)。因此，gn特异性抗体通过结合到rvfv病毒粒子上的gn，阻断病毒与细胞的结合，从而发挥抑制病毒感染的功能。虽然gc-特异性抗体r5的中和活性较弱(表2)，但在高剂量下仍可以中和rvfv感染。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>中国科学院微生物研究所<120>一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用<160>24<170>patentinversion3.3<210>1<211>116<212>prt<213>人工序列<400>1glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servalthrvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530alametasntrpvalargglnalaproglyhisglyleuglutrpmet354045glytrpileasnthrasnthrglyasnprothrtyralaglnalaphe505560thrglyargphevalpheserleuaspthrservalserthralatyr65707580leuglnileserserleulysalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglutrpglytrppheaspprotrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserser115<210>2<211>116<212>prt<213>人工序列<400>2glnservalleuthrglnproproservalserglyalaproglygln151015argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyalagly202530tyraspvalhistrptyrglnglnleuproglythralaprolysarg354045leuiletyrglyasnasnasnargproserglyvalproaspargphe505560serglyserlysserglythrseralaserleualailethrglyleu65707580glnalagluaspglualaasptyrtyrcysglnsertyraspserser859095leuserpheservalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly100105110glnprolysala115<210>3<211>121<212>prt<213>人工序列<400>3glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysvalserglytyrthrleuthrgluleu202530sermethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpmet354045glyglypheasparggluaspglygluthriletyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrgluaspthrserthraspthralatyr65707580mettyrleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaileaspproileargtyrasntrpasntyrglyasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>4<211>120<212>prt<213>人工序列<400>4leuprovalleuthrglnproproserserseralaserproglyglu151015seralaargleuthrcysthrleuproseraspileservalserser202530tyrasniletyrtrptyrglnglnlysproglyserproproargphe354045leuleutyrtyrtyrseraspserasplysglyglnglyserglyval505560proserargpheserglyserlysaspalaseraspasnthrglyile65707580leuleuileserglyleuglnsergluaspglualaasptyrtyrcys859095metiletrpproserasnalatrpvalpheglyglyglythrlysleu100105110thrvalleuglyglnprolysala115120<210>5<211>125<212>prt<213>人工序列<400>5glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln151015thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserilesersergly202530glytyrtyrtrpsertrpileargglnhisproglylysglyleuglu354045trpileglytyriletyraspserglyserthrtyrtyrasnproser505560leulysserargvalthrileservalaspthrserlysasnglnphe65707580serleulysleuserservalthralaalaaspthralaleutyrtyr859095cysalaserleuprotyrcysserglyargilecysargproargthr100105110asptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser115120125<210>6<211>120<212>prt<213>人工序列<400>6leuprovalleuthrglnproproserserseralaserproglyglu151015seralaargleuthrcysthrleuproseraspileasnvalglyser202530tyrasniletyrtrptyrglnglnlysproglyserproproargtyr354045leuleutyrtyrtyrseraspserasplysglyglnglyserglyval505560proserargpheserglyserlysaspalaseralaasnthrglyile65707580leuleuileserglyleuglnsergluaspglualaasptyrtyrcys859095metiletrpproserasnalatrpvalpheglyglyglythrlysleu100105110thrvalleuglyglnprolysala115120<210>7<211>118<212>prt<213>人工序列<400>7glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu151015thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserileserthrtyr202530tyrtrpsertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile354045glytyriletyrtyrserglyserthrasntyrasnproserleulys505560thrargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu65707580lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala859095argserasptyrglyaspleuilepheasptyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserser115<210>8<211>110<212>prt<213>人工序列<400>8leuprovalleuthrglnproproservalservalserproglygln151015thralaserilethrcysserglyasplysleuglyasplystyrval202530cystrptyrglnglnlysproglyglnserprovalleuvaliletyr354045glnaspserlysargproserglyileprogluargpheserglyser505560asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet65707580aspglualaasptyrtyrcysglnalacysaspserserthrvalphe859095glyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnprolysala100105110<210>9<211>130<212>prt<213>人工序列<400>9gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasnala202530trpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glyargilelysserlysthrtyrglyglythrthrasptyralaala505560provallysglyargphethrvalserargaspaspserlysasnthr65707580leutyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr859095tyrcysthrthrvalleuglyproglyserglytyraspserpheglu100105110asppheargalapheaspiletrpglyglnglythrmetvalthrval115120125serser130<210>10<211>113<212>prt<213>人工序列<400>10sertyrgluleuthrglnproproservalservalalaproglylys151015thralaargilethrcysglyglyasnasnileglyserlysserval202530histrptyrglnglnargproglyglnalaprovalleuvalvaltyr354045aspaspseraspargproserglyileprogluargpheserglyser505560asnserglyasnthralathrleuthrileserargvalglualagly65707580aspglualaasptyrtyrcysglnvaltrpaspserserserasphis859095argvalpheglythrglythrlysvalthrvalleuglyglnprolys100105110ala<210>11<211>119<212>prt<213>人工序列<400>11glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasptyr202530tyrmetsertrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045sertyrileserproglyglyserthriletyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaserseralaaspvaltyrasntrppheaspprotrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>12<211>114<212>prt<213>人工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