一种洋刀豆中脲酶的结晶提取方法与流程

本发明涉及结晶技术领域，尤其是一种洋刀豆中脲酶的结晶提取方法。

背景技术：

脲酶作为一种重要的生物制剂，广泛分布于植物的种子中，以大豆和洋刀豆中的含量最为丰富。脲酶是一种寡聚酶，能特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，其催化反应速率比无脲酶存在时的非催化反应速率高出1000多倍，广泛应用于农业，医药行业等领域。在畜牧业方面，脲酶在牛羊等反刍动物的尿素氮循环中发挥着关键的作用；在医药行业，脲酶是临床诊断血清中尿素含量试剂盒中的一种重要组分；在食品行业，利用脲酶将尿素分解可检出牛乳粉中0.1％大豆粉含量；此外，在环保要求日益严格的今天，脲酶还可用于处理含有尿素的废水。随着我国经济发展，固定化脲酶技术的飞速进步，对脲酶的需求量也越来越大。

脲酶的研究始于1926年，美国科学家萨姆纳从洋刀豆种子中首次提取出脲酶晶体，该工作也获得了诺贝尔奖的认可。

我国豆类资源丰富，目前国内针对脲酶提取的研究报道主要集中于从大豆，黄豆等植物中提取和纯化脲酶，有研究报道关于黄豆脲酶的提取，是以干黄豆为原料，采用分级沉淀的方法对脲酶进行分离，最后进行sephadexg～150凝胶层析过滤，对蛋白液进行纯化得到酶活较高，纯度较高的脲酶产品，但是该工艺流程复杂，脲酶损失量较高，还涉及凝胶层析过滤技术，工程放大成本较高；还有报道以大豆种皮为原料，经溶剂浸取、硫酸铵分级沉淀及丙酮沉淀等方法获得精制了脲酶，该技术操作简单，脲酶提取率可达到50～60％，但所得产品的纯度不够理想。

与大豆脲酶相比，洋刀豆脲酶的活性更高，但稳定性更差，目前以洋刀豆为原料的提取技术研究还不够成熟，采用常规盐析沉淀方法，虽然脲酶的提取率较高，但产品的纯度非常不理想。而层析色谱，超滤膜等技术，虽然能够同时满足提取率与纯度要求，但流程复杂，操作时间长，生产成本高。中国专利cn85104238a提出了一种脲酶的提取方法，首先对洋刀豆进行浸泡、湿磨，之后在低浓度磷酸盐弱酸性缓冲液中分批提取脲酶，该技术工艺所得脲酶纯度较低，纯化倍数不够高。中国专利cn104480092a公开了一种从刀豆中提取脲酶的方法，通过提取，沉降，中和，经过陶瓷膜微滤，透析，有机膜超滤等一系列过程，但该过程工艺繁琐，设备复杂，操作周期长达45小时，成本高昂，工业生产放大有一定难度。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种洋刀豆中脲酶的结晶提取方法。该方法工艺流程简单，操作时间短，操作条件温和，得到脲酶纯度超过96％，活性好且回收率稳定，具有良好的工业应用前景。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种洋刀豆中脲酶的结晶提取方法，包括如下步骤：

(1)提取：秤取洋刀豆研磨成粉，筛分后加入提取液，室温下将洋刀豆粉末和提取液充分搅拌，使洋刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下离心，收集上清液；

(2)粗沉淀：将所述步骤(1)中的上清液静置冷藏，离心，收集沉淀，得到脲酶粗沉淀；

(3)冷却结晶：将所述步骤(2)的脲酶粗沉淀溶于柠檬酸钠缓冲液中，搅拌至完全溶解，离心，收集上清液，得到蛋白质溶液；向蛋白质溶液中缓慢加入沉淀剂溶液，混合均匀后开始结晶，得到结晶溶液，将结晶溶液离心分离，收集脲酶晶体沉淀，冷冻干燥，得到纯度超过96％的脲酶产品。

优选的，步骤(1)中所述提取液是质量分数为25～35％的丙酮溶液或乙醇溶液，其中溶剂为离子强度是0.025mol/l且ph＝6.0～7.0的柠檬酸钠缓冲溶液；所述提取液与洋刀豆粉末量的比例为：1l提取液：1kg洋刀豆粉末。

优选的，所述步骤(1)中的洋刀豆研磨成粉后，用振动筛进行筛分，以除去颗粒度较大的不溶性杂质，洋刀豆粉末和提取液采用机械搅拌混合，搅拌速率为700rpm，搅拌时长为10～20min。脲酶的提取时间在10～20min为宜，低于10min蛋白质提取不充分，收率较低，还有可能包含过量杂质，不利于后期操作提纯；高于20min，蛋白质总量增加不显著，生产成本提高。所述机械搅拌的搅拌桨采用玻璃材质，防止金属对脲酶活性产生影响；浸提液在8000rpm下离心30min。

优选的，步骤(2)中所述上清液的静置条件是：温度为4～6℃下静置4h；离心条件为4000rpm下离心60min。

优选的，步骤(3)中所述柠檬酸钠缓冲液的ph值为6.0～7.0，离子强度为0.025mol/l；所述沉淀剂溶液的溶剂是ph为6.0～7.0柠檬酸钠缓冲液，离子强度为0.025mol/l，所述沉淀剂溶液中每升柠檬酸钠缓冲液中含有200～300g聚二乙醇和20～40ml2-巯基乙醇，所述沉淀剂溶液中的聚乙二醇为peg4000，peg5000或peg6000。

优选的，步骤(3)中所述加入的沉淀剂溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1，沉淀剂溶液以每分钟加入蛋白质溶液体积1～5％的速率加入到蛋白质溶液中，同时以200rpm的搅拌速率温和混合均匀后开始结晶。在得到的结晶溶液中，聚乙二醇的浓度为100～150g/l，2-巯基乙醇的浓度为10～20ml/l，蛋白质浓度为40～60g/l。结晶溶液中，聚乙二醇沉淀剂浓度保持在每升结晶溶液中含有100～150g聚乙二醇沉淀剂为宜，沉淀剂溶液低于100g时，结晶速率较慢，脲酶产品收率低且不稳定；沉淀剂高于150g时，杂质蛋白质沉淀量增加，产品纯度下降。

优选的，步骤(3)中所述蛋白质溶液中脲酶的浓度为80～120g/l。

优选的，步骤(3)中所述结晶过程为冷却结晶：以4℃为初始温度，保温20～30min后，以5～10℃/h的降温速率降温至-2～0℃，恒温养晶3～4h。

优选的，步骤(3)中所述脲酶粗沉淀溶于柠檬酸钠缓冲液后离心的条件为：2000rpm离心20min，所述结晶溶液的离心条件为：在-2～0℃下，6000rpm下离心60min，冷冻干燥的条件为：-20℃下冷冻干燥3h。

优选的，步骤(3)中所述结晶溶液离心后用0～5℃的体积分数为40％的丙酮溶液洗涤脲酶晶体沉淀，再进行冷冻干燥，所得产品质量更好。

本发明的有益效果是，利用常规结晶方法提取脲酶，通常需要5次以上的重结晶步骤，且一般采用磷酸盐作为缓冲溶液，磷酸盐会对酶的活性有一定影响。因此现有技术中，常将2-巯基乙醇加入到蛋白质的提取剂中，对蛋白质起到稳定的作用，但由于后续提取步骤较多，需要增大剂量，而过多的2-巯基乙醇反而会影响蛋白质的三维结构而影响蛋白质活性。本发明采用冷却结晶方法，以洋刀豆粉为原料，以柠檬酸钠作为缓冲溶液体系，其缓冲能力强，且不影响蛋白质活性，能够保持蛋白质结构稳定。由于本方的整个工艺流程步骤较少，耗时时间较短，无需在提取剂中添加2-巯基乙醇。在结晶过程中，以聚乙二醇为沉淀剂，将2-巯基乙醇直接作为结晶助剂。2-巯基乙醇一方面可以稳定溶液中的脲酶，保持蛋白质的活性，使其在结晶过程中不发生沉淀或者降解；另一方面可以缩短脲酶结晶的诱导期，加速脲酶结晶，抑制溶液中其他杂质蛋白结晶，从而提高脲酶的纯度与提取率。因此，少量2-巯基乙醇即可达到很好的结晶效果，通过1次重结晶就可以得到高纯度的脲酶，且提取率稳定。本方法操作简单，工艺过程时间短，能耗低，解决了操作时间与生产的问题，提取过程均采用常规固液分离手段，是一种有工业应用价值的提取方法。工业化设备可采用在工业结晶领域广泛应用的结晶釜。

采用本发明方法进行冷却结晶提取脲酶，得到的脲酶晶体纯度超过96％，操作时间缩短至15小时以内，脲酶总活性回收率达到60％以上。

附图说明

图1是本发明实施例1～4所得脲酶晶体紫外-可见吸收光谱图；

图2是本发明实施例1～4洋刀豆脲酶sds-page电泳图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

一种洋刀豆中脲酶的结晶提取方法，包括如下步骤：

(1)提取：用天平秤取洋刀豆研磨成粉，用振动筛进行筛分，以除去颗粒度较大的不溶性杂质，筛分后加入提取液，所述提取液与洋刀豆粉末的比例为1l提取液：1kg洋刀豆粉末，所述提取液是质量分数为25％～35％的丙酮溶液或乙醇溶液，其中溶剂为离子强度是0.025mol/l且ph＝6.0～7.0的柠檬酸钠缓冲溶液。室温下将洋刀豆粉末和提取液采用机械搅拌，充分混合，所述机械搅拌的搅拌桨采用玻璃材质，搅拌速率为700rpm，搅拌时长为10～20min，使洋刀豆粉末中脲酶全部浸提，然后将浸提液在室温下8000rpm离心30min，收集上清液；

(2)粗沉淀：将所述步骤(1)中的上清液在4～6℃下静置冷藏4h，4000rpm下离心60min，收集沉淀，得到脲酶粗沉淀；

(3)冷却结晶：将所述步骤(2)的脲酶粗沉淀溶于离子强度为0.025mol/l且ph值为6.0～7.0的柠檬酸钠缓冲液中，搅拌至完全溶解，在2000rpm下离心20min，收集上清液，得到蛋白质溶液，向蛋白质溶液中缓慢加入沉淀剂溶液，所述蛋白质溶液中脲酶的浓度为80～120g/l，沉淀剂溶液以每分钟加入蛋白质溶液体积1～5％的速率加入到蛋白质溶液中，同时以200rpm的搅拌速率温和混合均匀后开始冷却结晶，以4℃为初始温度，保温20～30min后，以5～10℃/h的降温速率降温至-2～0℃，恒温养晶3～4h，得到结晶溶液，所述沉淀剂溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1，所述沉淀剂溶液的溶剂是离子强度为0.025mol/l且ph值为6.0～7.0柠檬酸钠缓冲液，所述沉淀剂溶液中每升柠檬酸钠缓冲液中含有200～300g聚二乙醇和20～40ml2-巯基乙醇，所述聚乙二醇为peg4000，peg5000或peg6000，在得到的所述结晶溶液中，聚乙二醇的浓度为100～150g/l，2-巯基乙醇的浓度为10～20ml/l，蛋白质浓度为40～60g/l，将结晶溶液在-2～0℃下6000rpm离心分离60min，收集脲酶晶体沉淀，用0～5℃的体积分数为40％的丙酮溶液洗涤晶体沉淀，于-20℃下冷冻干燥3h，得到纯度超过96％的脲酶产品。

本发明结晶过程使用结晶釜完成，结晶釜夹层内通入冷却介质。釜内有搅拌桨，结晶料液即所述的蛋白质溶液由釜开口处加入，脲酶在釜内发生结晶，结晶结束后，收集悬浮液离心，得到所述的脲酶晶体沉淀。

实施例1

称取洋刀豆粉末2kg，筛分除去大颗粒杂质，加入2l含有质量分数35％的乙醇溶液，其中溶剂为离子强度是0.025mol/l的ph＝6.0的柠檬酸钠缓冲溶液，常温700rpm下搅拌10min，得到脲酶的浸提液，搅拌桨采用玻璃材质，防止金属对脲酶活性产生影响。将所得浸提液在8000rpm下离心30min，收集上清液。将上清液静置于6℃中冷藏4h后，得到含有脲酶沉淀的悬浮液。将悬浮液在4000rpm下离心，得到脲酶粗沉淀。向所得脲酶粗沉淀中加入2l离子强度为0.025mol/lph＝6.0柠檬酸钠缓冲液，室温下充分搅拌溶解，在2000rpm下离心20min弃去不溶杂质，收集上清液，得到脲酶的浓度为80g/l的蛋白质溶液2l，加入到结晶釜中。

沉淀剂溶液配制：称取400gpeg5000，溶于2l离子强度为0.025mol/lph＝6.0柠檬酸钠缓冲液中，室温充分搅拌至完全溶解后，向其中加入40ml2-巯基乙醇，搅拌均匀。

将配好的沉淀剂溶液以20ml/min的速率加入结晶釜中，与蛋白质溶液在200rpm的温和搅拌条件下缓慢混合，直至加入的沉淀剂溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1。混合均匀后开始结晶，以4℃为初温，保温20min后，以5℃/h的降温速率降温至0℃，恒温3h养晶。

将所得结晶溶液从结晶釜中缓慢倒出，在0℃，6000rpm条件下离心60min，收集沉淀，在-20℃下冷冻干燥3h，得到脲酶产品的比活为317.8u/mg蛋白，活性回收率为61.3％，纯度96.3％，紫外-可见吸收光谱表现出纯蛋白质特性，如图1曲线a所示。sds-page电泳图显示出单一脲酶条带，表明脲酶纯度良好，如图2中2所示。

实施例2

取洋刀豆粉末2kg，筛分除去大颗粒杂质，加入2l含有质量分数25％乙醇溶液，其中溶剂为离子强度是0.025mol/l的ph＝6.5的柠檬酸钠缓冲溶液，常温700rpm下搅拌15min，得到脲酶的浸提液，搅拌桨采用玻璃材质。将所得浸提液在8000rpm下离心30min，收集上清液。将上清液静置于5℃中冷藏4h后，得到含有脲酶沉淀的悬浮液。将悬浮液在4000rpm下离心，得到脲酶粗沉淀。向所得脲酶粗沉淀中加入2l离子强度为0.025mol/lph＝6.5柠檬酸钠缓冲液，室温下充分搅拌溶解，在2000rpm下离心20min弃去不溶杂质，收集上清液，得到脲酶的浓度为100g/l的蛋白质溶液2l，加入到结晶釜中。

沉淀剂溶液配制：称取500gpeg4000，溶于2l离子强度为0.025mol/lph＝6.5柠檬酸钠缓冲液中，室温充分搅拌至完全溶解后，向其中加入60ml2-巯基乙醇，搅拌均匀。

将配好的沉淀剂溶液以50ml/min的速率加入结晶釜中，与蛋白质溶液在200rpm的温和搅拌条件下缓慢混合，直至加入的沉淀剂溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1。混合均匀后开始结晶，以4℃为初温，保温25min后，以8℃/h的降温速率降温至-1℃，恒温3.5h养晶。

将所得结晶溶液从结晶釜中缓慢倒出，在-1℃，6000rpm条件下离心60min，收集沉淀，在-20℃下冷冻干燥3h，得到脲酶产品的比活为320.1u/mg蛋白，活性回收率为65.1％，纯度97.1％，紫外-可见吸收光谱表现出纯蛋白质特性，如图1曲线b所示。sds-page电泳图显示出单一脲酶条带，表明脲酶纯度良好，如图2中3所示。

实施例3

取洋刀豆粉末2kg，筛分除去大颗粒杂质，加入2l含有质量分数25％丙酮溶液，其中溶剂为离子强度是0.025mol/l的ph＝7.0的柠檬酸钠缓冲溶液，常温700rpm下搅拌20min，得到脲酶的浸提液，搅拌桨采用玻璃材质。对所得悬浮液在8000rpm下离心30min，收集上清液。将上清液静置于4℃中冷藏4h后，得到含有脲酶沉淀的悬浮液。将悬浮液在4000rpm下离心，得到脲酶粗沉淀。向所得脲酶粗沉淀中加入2l离子强度为0.025mol/lph＝7.0柠檬酸钠缓冲液，室温下充分搅拌溶解，在2000rpm下离心20min弃去不溶杂质，收集上清液，得到脲酶的浓度为120g/l的蛋白质溶液2l，加入到结晶釜中。

沉淀剂溶液配制：称取600gpeg6000，溶于2l离子强度为0.025mol/lph＝7.0柠檬酸钠缓冲液中，室温充分搅拌至完全溶解后，向其中加入80ml2-巯基乙醇，搅拌均匀。

将配好的沉淀剂溶液以100ml/min的速率加入结晶釜中，与蛋白质溶液在200rpm的温和搅拌条件下缓慢混合，直至加入的沉淀剂溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1。混合均匀后开始结晶，以4℃为初温，保温30min后，以10℃/h的降温速率降温至-2℃，恒温4h养晶。

将所得结晶溶液从结晶釜中缓慢倒出，在-2℃，6000rpm条件下离心60min，收集沉淀，在-20℃下冷冻干燥3h，得到脲酶产品的比活为318.4u/mg蛋白，活性回收率为71.3％，纯度96.5％，紫外-可见吸收光谱表现出纯蛋白质特性，如图1曲线c所示。sds-page电泳图显示出单一脲酶条带，表明脲酶纯度良好，如图2中3所示。

实施例4

取洋刀豆粉末2kg，筛分除去大颗粒杂质，加入2l含有质量分数30％丙酮溶液，其中溶剂为离子强度是0.025mol/l的ph＝6.5的柠檬酸钠缓冲溶液，常温700rpm下搅拌15min，得到脲酶的浸提液，搅拌桨采用玻璃材质。搅拌20min后，对所得悬浮液在8000rpm下离心30min，收集上清液。将上清液静置于4℃中冷藏4h后，得到含有脲酶沉淀的悬浮液。将悬浮液在4000rpm下离心，收集含有脲酶粗沉淀。向所得脲酶粗沉淀中加入2l离子强度为0.025mol/lph6.5＝柠檬酸钠缓冲液，室温下充分搅拌溶解，在2000rpm下离心20min弃去不溶杂质，收集上清液，得到脲酶的浓度为120g/l的蛋白质溶液2l，加入到结晶釜中。

沉淀剂溶液配制：称取600gpeg6000，溶于2l离子强度为0.025mol/lph＝6.5柠檬酸钠缓冲液中，室温充分搅拌至完全溶解后，向其中加入80ml2-巯基乙醇，搅拌均匀。

将配好的沉淀剂溶液以100ml/min的速率加入结晶釜中，与蛋白质上清液在温和搅拌条件下缓慢混合，直至加入的沉淀剂溶液与蛋白质溶液的体积比为1:1。混合均匀后开始结晶，以4℃为初温，保温30min后，以10℃/h的降温速率降温至-2℃，恒温4h养晶。

将所得结晶溶液从结晶釜中缓慢倒出，在-2℃，6000rpm条件下离心60min，收集沉淀，用0℃，40％体积分数的丙酮溶液清洗所得晶体，洗涤后，在-20℃下冷冻干燥3h。得到脲酶产品的比活326.3u/mg蛋白，活性回收率为68％，纯度98.8％，紫外-可见吸收光谱表现出纯蛋白质特性，如图1曲线d所示。sds-page电泳图显示出单一脲酶条带，表明脲酶纯度良好，如图2中4所示。

本发明中蛋白质浓度测定采用公认的商品化bradford蛋白质定量试剂盒，脲酶活性测定采用公认的商品化脲酶活性检测试剂盒，脲酶纯度测定采用技术成熟的凝胶成像仪配合成像软件进行分析处理。

结果表明，利用本发明提供的脲酶提取方法，可以普遍提高脲酶的纯度至96％以上，比酶活达到310u/mg蛋白质以上，紫外吸收光谱呈现纯蛋白特征峰，脲酶活性回收率超过60％。本发明未使用任何极端条件，过程操作简单方便，成本低，污染小，得到的脲酶纯度高，有利于工业生产。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。