一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有热稳定特性的新型ι-卡拉胶酶cgiv及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

卡拉胶是由1,4-α-d-吡喃半乳糖和1,3-β-d-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。根据是否含有3,6-内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量的不同，目前工业上生产和使用的卡拉胶主要为ι-型、ι-型和λ-型三种，其二糖单元分别含有1个、2个和3个硫酸基。卡拉胶寡糖作为一种富含硫酸基的硫酸酯化糖类物质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、降血脂、免疫调节和抗凝血等生物活性。

卡拉胶降解酶是一种糖水解酶，通过断裂卡拉胶的β-1,4糖苷键将大分子卡拉胶降解为寡糖的酶。ι-卡拉胶酶是指专一性降解ι-卡拉胶的卡拉胶酶，传统的ι-卡拉胶酶是从海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然ι-卡拉胶酶产量低，发展基因工程的ι-卡拉胶酶势在必行。并且大多数报道的ι-卡拉胶酶热稳定和热恢复性较差，容易失活，无法达到工业化应用的要求。因此，寻找具有特殊性质的ι-卡拉胶酶具有重要意义。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶cgiv及其应用。本发明提供的ι-卡拉胶酶基因来源于海洋细菌vibriosp.sy01，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号cctccno：m2018769，保藏单位地址：武汉大学，保藏日期：2018年11月12日。本发明提供的ι-卡拉胶酶与已有ι-卡拉胶酶的氨基酸相似度仅为88％。最适反应温度为40℃；具有热稳定特性，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h。酶解主产物为ι-卡拉胶二糖和四糖。

一方面，本发明提供一种新型ι-卡拉胶酶cgiv，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

seqidno.1：

mikasdfytdkikeakktvnytgykvnnkddqddsknlqkaiddltaikkggvinipegkyyfkniilksnvhividekatiyatypgsdknfmimsfgefgthyvsvrakkgmytvdlsvsknknvrmfqvnnsenykgqqrenilddntkfngitlgyckyngkyvmpengvikncriekahygygliqsqastnvyyeniwgdggvtlrletdnlkmndlqvggnhnihgkniycqngnaashythemqnghvemdgvesvncgfavrigkgyvskkqkvanlkpgtyanqavesklgrgcaqgtyrewnggtrwaarvtqkdacldkakleygiepgsfgtvkvsnikstygttaqvkskhfkympcperklirvclalmvsphsiqnghveaenveavncvnakgkggapkgywnveitnvesvgyphqskdilyeqdavknckegk

另一方面，本发明还提供一种ι-卡拉胶酶cgiv对应的核酸序列，如seqidno.2所示。

seqidno.2：

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另一方面，本发明还提供一种新型ι-卡拉胶酶cgiv的制备方法。

另一方面，本发明还提供了所述ι-卡拉胶酶cgiv在水解卡拉胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述ι-卡拉胶酶cgiv在制备ι-卡拉胶寡糖中的应用。

另一方面，一种水解ι-卡拉胶的方法，所选用的ι-卡拉胶酶为cgiv。

优选：所述水解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为40℃。

有益效果：

1.本发明的ι-卡拉胶酶cgiv为结构与功能新颖的ι-卡拉胶酶，归属于多糖水解酶第82家族(gh82)，其氨基酸序列与已有的ι-卡拉胶酶序列相似度为88％。

2.本发明提供了一种制备ι-卡拉胶酶cgiv的方法，即利用基因工程的技术方法，将cgiv的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经摇瓶发酵后，发酵液酶活力达到37.9u/ml。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达88.6％，蛋白质纯度高达98.2％。

3.本发明的ι-卡拉胶酶cgiv具有优良的理化性质，具有热稳定特性，在50℃的活性半衰期长达0.7h，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h。降解产物分析，该酶降解主产物为ι-卡拉胶二糖和四糖。

综上所述，本发明所述的ι-卡拉胶酶cgiv具有良好的工业化应用前景。

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏日期：2018年11月12日；

保藏编号：cctccno：m2018769。

附图说明

图1为本发明ι-卡拉胶酶cgiv蛋白质分离纯化图(m，蛋白质标准品；1，纯化所得ι-卡拉胶酶cgiv)；

图2为本发明ι-卡拉胶酶cgiv的最适反应温度；

图3为本发明ι-卡拉胶酶cgiv的温度稳定性；

图4为本发明ι-卡拉胶酶cgiv在30℃的活性半衰期；

图5为本发明ι-卡拉胶酶cgiv在40℃的活性半衰期；

图6为本发明ι-卡拉胶酶cgiv在50℃的活性半衰期；

图7为薄层层析(tlc)法检测本发明ι-卡拉胶酶cgiv的酶解产物(m，ι-卡拉胶寡糖dp2、4糖dp4标准品；0，酶解前底物；1，酶解后产物)。

具体实施方式

实施例1ι-卡拉胶酶cgiv序列分析

本发明所述ι-卡拉胶酶cgiv的产酶基因cgiv来源于海洋细菌vibriosp.sy01，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号cctccno：m2018769。包含有1359个碱基序列，编码452个氨基酸序列。利用nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)中的保守结构域分析conserveddomain(cdd)和多重序列比对basiclocalalignmentsearchtool(blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶(gh82)家族的保守区。已经报道的ι-卡拉胶酶中，与cgiv氨基酸序列相似度最高的为来源于flavobacteriumsp.的gh82家族的ι-卡拉胶酶(genbankapx55175)，两者之间的氨基酸序列相似度(identity)为88％。

实施例2ι-卡拉胶酶cgiv的重组表达

将实施例1中ι-卡拉胶酶cgiv基因序列以限制性内切酶ncoi和xhoi为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：seqidno.3：pcgivf：

5’-catgccatggatgattaaagcatctgatttc-3’(ncoi)

反向引物：seqidno.4：pcgivr：

5’-ccgctcgagtttaccttgtttacagttttttac-3’(xhoi)

pcr扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。pcr反应所用dna聚合酶为primerstarhs购自大连宝生物公司。

pcr产物用限制性内切酶ncoi和xhoi进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的pcr产物。pet22b(+)质粒dna(美国invitrogen公司)，同样用限制性内切酶ncoi和xhoi进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、dna用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的pcr产物和pet-22b(+)质粒载体参照dna连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌dh5α菌株(美国invitrogen公司)，涂布在luria-bertani(lb)培养基固体平板上(含有50μg/ml氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至lb液体培养基中(含有50μg/ml氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pet22b-cgiv。重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为bl21(de3)/pet22b-cgiv，保存在-80℃备用。

实施例3ι-卡拉胶酶cgiv的发酵及纯化制备方法

将实施例2中构建的大肠杆菌bl21(de3)/pet22b-cgiv转接至lb液体培养基中(50μg/ml氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至od600＝0.6。加入终浓度为0.1mm的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，在20℃诱导24h。ι-卡拉胶酶活性利用dns法测定，具体方法为：100μl酶液加入900μl0.3％ι-卡拉胶底物(20mm磷酸盐缓冲液，ph＝7.0)，在40℃下反应10min，加入750μldns试剂终止反应，沸水中煮沸10min，用分光光度计测定a520的数值。对照组加入样品后直接加入750μl的dns试剂并沸水煮沸10min后检测。酶活力定义为：每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶用量定义为一个酶活力单位(u)。经检测，发酵液中ι-卡拉胶酶的酶活力为37.9u/ml。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；上样于镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mm咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mm的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到88.6％。纯化所得酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，如图1所示，纯化所得cgiv的分子量约为45kda，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得ι-卡拉胶酶的蛋白纯度达到98.2％。

实施例4温度对ι-卡拉胶酶cgiv的影响

为了检测卡拉胶酶最适反应温度，0.3％的卡拉胶底物分别置于0-70℃保温10min后加入将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶(溶解于ph7.0的磷酸盐缓冲液)，用dns法检测酶活性，根据od520的数值确定酶促反应的最适反应温度，以酶活性最高时的活性定义为100％。如图2所示，ι-卡拉胶酶cgiv的最适反应温度为40℃。

将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶1ml在不同温度(0-70℃)下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度(40℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图3所示，ι-卡拉胶酶cgiv温度稳定性较好，在40℃下孵育1h，仍然可保持87.3％的活性，在50℃下孵育1h，仍然可保持37.2％的活性。

实施例5ι-卡拉胶酶cgiv的热稳定性测定

将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶cgiv分别在30℃、40℃、50℃孵育不同时间，分别检测剩余的酶活力，以孵育前的活力作为100％，利用origin软件计算酶活力在不同温度下丧失一半的时间，即活性半衰期(t1/2)。如图4所示，cgiv在30℃下保持良好的稳定性，活性半衰期(t1/2)长达42h；如图5所示，cgiv在40℃下的活性半衰期(t1/2)为6.5h；如图6所示，cgiv在50℃下的活性半衰期(t1/2)为0.7h。通过半衰期检测发现，本发明所提供的ι-卡拉胶酶cgiv具备良好的热稳定性，在运输和发生催化过程中，具备良好的应用前景。

实施例6ι-卡拉胶酶cgiv酶解产物薄层层析分析

将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶cgiv纯酶(20u)与0.1％的ι-卡拉胶在40℃下孵育6h，然后在高效薄层层析板(hptlc)检测。具体为：tlc把预先在100℃烘箱中活化2h的hptlc层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰乙酸:水＝2:1:1)的展缸中20min，吹干层析板，浸入显色剂(苯胺二苯胺)中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图7所示，与标准品迁徙率比较发现，ι-卡拉胶酶cgiv酶解主产物为二糖(dp2)和四糖(dp4)。

序列表

<110>青岛大学

<120>一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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