一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用的制作方法

本发明涉及一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用，属于生物技术领域。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶(ec3.1.2.21，β-glucosidase)属于水解酶类，主要水解糖苷或寡糖中的β-1,4-糖苷键，同时释放出末端非还原性的葡萄糖或其它糖苷配体。根据氨基酸序列及空间结构的相似性，被归类于糖苷水解酶1家族(gh1)、3家族、5家族、9家族、30家族以及116家族(http://www.cazy.org/)。gh1家族β-葡萄糖苷酶具有宽泛的底物催化特性，可兼具β-半乳糖苷酶、β-木糖酶、β-甘露糖酶等酶活力，因而具有重要的工业应用价值。

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,gos)是一种重要的益生元，是具有天然属性的功能性低聚糖，并已被广泛应用于婴幼儿奶粉、发酵乳、糖果、面包等食品中。低聚半乳糖的组成为gal-(gal)n-glc/gal(n＝0-6)，结构式如下式ⅰ所示。

目前gos的生产主要以乳糖为原料，gh2和gh42家族的β-半乳糖苷酶为催化剂，反应过程中，酶将乳糖水解，再将生成的半乳糖基转移到糖基受体上通过转糖苷作用生成gos。商业用β-半乳糖苷酶催化合成的gos多为β(1→6)和β(1→4)键型，β(1→3)较少。研究发现，相比β(1→6)及β(1→4)键型gos，β(1→3)型gos具有更好的益生元活性。

作为β-半乳糖苷酶的有益补充，具有转糖苷活性的gh1家族β-葡萄糖苷酶在gos制备方面显示出独特的优势。已有来自halothermothrixorenii和thermotoganaphthophila的β-葡萄糖苷酶被用于gos的合成，除了生成β(1→6)及β(1→4)键型gos外，β(1→3)键型的gos亦可有效合成。另外，相比gh2和gh42家族的β-半乳糖苷酶，gh1家族β-葡萄糖苷酶分子量小，更易于重组表达及制备。但是，目前应用于低聚半乳糖合成的gh1家族β-葡萄糖苷酶较少。

技术实现要素：

本发明是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，提供了一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用。

本发明具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶，名称为bgld1，其原始来源于中国南海西沙群岛海底沉积物，具有如下氨基酸序列之一：

(1)序列表中的seqidno：2；

(2)序列表中的seqidno：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

本发明所述β-葡萄糖苷酶的编码基因，名称为bgld1，具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中的seqidno：1；

(2)seqidno：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)编码序列表中seqidno：2蛋白质序列的多核苷酸序列。

本发明具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶的表达菌株，其分类命名为：escherichiacolibl21(de3)/pet22b(+)-bgld1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2019年2月25日，保藏编号：cctccno：m2019111。

本发明还提供了含有所述β-葡萄糖苷酶的编码基因的重组表达载体，其构建方法包括如下步骤：

步骤1：以含有所述β-葡萄糖苷酶编码基因的bacillussp.细菌基因组dna为模板，以p1和p2为引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，所述引物为：

p1：5′-ttccatatggcaattatacaatttcca-3′

p2：5′-ccgctcgagataatacatatcaaagaagc-3′

步骤2：将步骤1所得pcr扩增产物和peasy-t3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有所述β-葡萄糖苷酶编码基因(bgld1)的peasy-t3重组质粒；

步骤3：用ndei和xhoi双酶切步骤2所得的peasy-t3重组质粒和表达质粒载体，然后用t4dna连接酶连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有所述β-葡萄糖苷酶的编码基因bgld1的工程表达菌株。

所述表达质粒载体为pcold、pet15、pet22b(+)或pet28等。

所述宿主菌为e.colibl21(de3)、e.colidh5α、e.colijm109或e.colirosetta等。

下面以表达质粒载体pet22b(+)、宿主菌e.colibl21(de3)为例，具体介绍含有本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)以包含海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的bacillussp.细菌基因组dna为模板，以p1和p2为引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述引物为：

p1：5′-ttccatatggcaattatacaatttcca-3′

p2：5′-ccgctcgagataatacatatcaaagaagc-3′

(2)将步骤(1)所得pcr扩增产物和peasy-t3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因(bgld1)的peasy-t3重组质粒；

(3)用ndei和xhoi双酶切步骤(2)所得的peasy-t3重组质粒和pet22b(+)质粒，然后用t4dna连接酶将酶切后的bgld1与pet22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化e.colibl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明基因bgld1的工程菌株e.colibl21(de3)/pet22b(+)-bgld1。

本发明具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶的应用，是通过转糖苷作用合成低聚半乳糖。

具体是以350g/l的乳糖为底物，加入25u/mlbgld1(以pnpglu为底物测定)，35℃、ph值6.0条件下反应7h，gos产量最高，达到118g/l。其中β-(1→4)键型的二糖和β-(1→3)键型的三糖分别约为gos总量的40％。

与现有的海洋细菌β-葡萄糖苷酶相比，本发明具有的优点为：

1、本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶具有β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶等多种活性；

2、本发明的β-葡萄糖苷酶在ph5.5-6.5范围内具有好的稳定性，35℃半衰期为120小时；

3、本发明的β-葡萄糖苷酶具有较高的转糖苷活性，可用于低聚半乳糖的合成，合成的低聚半乳糖具有多种键型，主要为β(1→3)和β(1→4)糖苷键。

附图说明

图1为本发明pcr扩增产物的电泳图谱。m为分子量标准；1为pcr扩增产物。

图2为本发明表达载体pet22b(+)/bgld1质粒的鉴定电泳图谱。中m为分子量标准；1为经过ndei/xhoi双酶切的pet22b(+)；2为经过ndei/xhoi双酶切的pet22b(+)/bgld1。

图3为以pnpglu为底物时测定的bgld1催化的最适ph和ph稳定性。a为最适ph，b为ph稳定性。

图4为以pnpglu为底物时测定的bgld1催化的最适稳定和温度稳定性。a为最适温度，b为温度稳定性，c为45℃下bgld1温度稳定性，d为35℃下bgld1温度稳定性。

具体实施方式

下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。

(一)含有本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的表达菌株的构建

1、含有本发明海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的阳性克隆的筛选及鉴定

从中国南海赵述岛附近浅海区：水温30℃，ph7.9，水深4-5米(北纬16°58′，东经112°16′)海底沉积物，分离微生物并提取基因组，取海底沉积物1g，与50mltys液体培养基中，30℃，120rpm，活化2h。取上清稀释不同的倍数涂布于含有0.1％(w/v)七叶苷和0.25％(w/v)柠檬酸铁铵的tys固体平板上，倒置于16℃、28℃、37℃培养箱培养24h后观察平板上菌落生长情况。产β-葡萄糖苷酶的菌株周围的培养基会变成棕黑色，按照菌落形态的不同和阳性反应圈的大小，选择生长快、棕黑色圈直径与菌落直径之比较大者为初选菌株。用灭菌的牙签挑取阳性克隆于10μl无菌水中，搅拌均匀，用接种环蘸取菌液，于新鲜的培养基上划线纯化。挑取纯化后的单克隆于5mltys液体培养基中30℃，200rpm，培养24h。用移液枪吸取0.1ml稀释液涂布于含有0.1％(w/v)七叶苷和0.25％(w/v)柠檬酸铁铵的tys固体平板上，37℃恒温箱中培养1-2天。菌落周围培养基的颜色仍会变成棕黑色的即为β-葡萄糖苷酶复筛阳性克隆。保种：吸取850μl菌液，与150μl灭过菌的甘油(装于1.5mlep管中)混合均匀，-70℃保存。

按照试剂盒提供的说明抽取产β-葡萄糖苷酶阳性克隆菌株基因组，扩增16srrna基因。细菌16srrna基因的扩增采用通用引物序列，以阳性菌株基因组为模板。细菌16srrna基因通用引物序列：

正向引物(27f)：5′agagtttgatcctggctcag3′

反向引物(1492r)：5′acggctaccttgttacgactt3′

pcr扩增程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，30sec，退火50℃，30sec，延伸72℃，120sec，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的pcr产物用1％琼脂糖电泳检测，在1600bp左右出现条带的初步认为是阳性克隆。将所得pcr扩增产物和peasy-t3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，将转化产物均匀涂于含amp抗性及iptg和x-gal的筛选平板上，37℃过夜培养。根据蓝白斑筛选方法，挑白色克隆于5ml含amp抗性的lb培养基的试管中，37℃培养8h。按照axygen质粒小量制备试剂盒的说明书抽提菌液质粒，以质粒为模板进行pcr，鉴定是否阳性克隆。阳性重组子质粒送往上海生工测序，得到16srrna序列，运用ncbi中的blast程序与数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中的细菌16srrna序列进行相似性比对；根据文献报道，若未知菌株的16srrna序列与数据库中的已知序列相似性大于99％，则初步认为该未知菌株与数据库中的已知菌株同属。经序列比对后确定产β-葡萄糖苷酶的阳性菌株与bacillussp.alg07同源性99％，将产β-葡萄糖苷酶的阳性菌株命名为bacillussp.d1。

2、海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶基因的扩增

分析bacillussp.alg07全基因组注释信息，获知wp_072578138.1编码β-葡萄糖苷酶，以此设计pcr扩增引物，以bacillussp.d1菌株基因组为模板，pcr扩增获得本发明的β-葡萄糖苷酶全长基因编码序列。

设计一对寡核苷酸引物p1和p2，其序列为：

p1：5′-ttccatatggcaattatacaatttcca-3′

p2：5′-ccgctcgagataatacatatcaaagaagc-3′

在引物的5′和3′端分别引入ndei和xhoi酶切位点，以bacillussp.d1菌株基因组的dna为模板，扩增β-葡萄糖苷酶基因bgld1。pcr反应程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，1min，退火50℃，30sec，延伸72℃，2min，共进行30个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的pcr产物用1％琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如seqidno:1所示，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

3、表达载体的构建

将步骤2中得到pcr扩增产物，与质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ngpeasy-t3质粒载体，50ngpcr扩增产物，补水至5μl，25℃连接5min。连接产物热激转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，将转化产物均匀涂于含amp抗性及iptg和x-gal的筛选平板上，37℃过夜培养。根据蓝白斑筛选方法，挑白色克隆于5ml含amp抗性的lb培养基的试管中，37℃培养8h。按照质粒小量制备试剂盒的说明书抽提菌液质粒，以质粒为模板进行pcr鉴定获得含有β-葡萄糖苷酶基因(bgld1)的peasy-t3重组质粒。

用ndei和xhoi双酶切所得的peasy-t3重组质粒和pet22b(+)载体，然后用t4dna连接酶将酶切后的bgld1与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ngpet22b(+)载体，50ngbgld1酶切片段，3μl10×ligationbuffer，1μlt4dna连接酶(takara)，补水至30μl，16℃连接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌e.colibl21(de3)，得到的转化子测序验证后获得含有本发明基因bgld1的工程菌株e.colibl21(de3)/pet22b(+)-bgld1。

上述菌株e.colibl21(de3)/pet22b(+)-bgld1已送至中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection，cctcc)保藏，保藏日期：2019年2月25日，保藏编号：cctccno：m2019111。

(二)含本发明的β-葡萄糖苷酶基因工程菌的表达与蛋白纯化

将(一)中获得的基因的工程菌株e.colibl21(de3)/pet22b(+)-bgld1接种于含有氨苄青霉素的200mllb液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至od600达到0.6，加入终浓度为0.2mm的iptg进行诱导，并于16℃、120rpm条件下继续培养20小时；4℃、8000g离心收集菌体，超声破碎，ni-nta柱层析进行纯化。

以pnpglu为底物，纯化的海洋细菌β-葡萄糖苷酶蛋白bgld1的最适ph为6.0，酶在ph5.5-6.5范围内有较高的稳定性，能够维持原酶活力的50％以上。以pnpgala为底物，海洋细菌β-葡萄糖苷酶bgld1的最适ph为6.5。bgld1在35℃-65℃范围内均能显示催化活性，其最适温度为60℃，35℃时酶的半衰期为120小时。

(三)含本发明海洋细菌β-葡萄糖苷酶比活力的检测

1、以pnpglu为底物测定酶活力

反应体系为500μl，将缓冲液和50μl100mmpnpglu(去离子水配制，终浓度为10mm)在60℃下预热5min后加入酶液，反应10min后加入500μl1mna2co3终止反应。实验组做3个平行实验，对照组以缓冲液代替酶液。以对照组调零，测定405nm下的光吸收值。酶活力(u)定义为：每分钟产生1μmolpnp所用的酶量。

2、以多糖为底物测定酶活

反应体系为500μl，将缓冲液和25μl5mm多糖(缓冲溶液配制，终浓度为5mm)在60℃下预热5min后加入酶液，反应10min后将反应体系放置沸水浴中煮沸5min，使酶充分失活，按照葡萄糖测定试剂盒操作说明进行操作，实验组3个平行，对照组以去离子水代替葡萄糖溶液。以对照组调零，测定505nm下的光吸收值。

表1bgld1各底物比酶活

(四)海洋细菌来源具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶转糖苷活性

以柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲溶液配制350g/l的乳糖溶液，加入25u/mlbgld1(以pnpglu为底物测定)，35℃、200rpm反应24h，hplc检测产物生成。gos产量在反应7h时最高，达到118g/l。其中β-(1→4)键型的二糖和β-(1→3)键型的三糖分别约为gos总量的40％。

seqidno:1

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seqidno:2

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sequencelisting

<110>安徽大学

<120>一种具有低聚半乳糖合成能力的β-葡萄糖苷酶及其表达菌株和应用

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