一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其制备方法与流程

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其制备方法。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,god)的系统名称为β-d-葡萄糖氧化还原酶(e.c.1.1.3.4)，最先于1904年在黑曲霉和灰绿青霉中发现。它能够催化β-d-葡萄糖被氧气氧化成葡萄糖酸-δ-内酯进而被水解成葡萄糖酸，并生成过氧化氢。因此，god具有脱氧和防腐的功能而应用在食品保鲜方面。god还具有消除肠道病原菌、解除肠道霉菌毒素中毒、改善肠道酸性消化环境、保护肠道上皮完整的功能，广泛应用在畜牧业和养殖业。由于god专一氧化葡萄糖的特性，在生物传感器、医学检验等领域是重要分析用酶。但目前我国生产的god酶活和纯度较低，因此仍主要依赖于进口。

野生菌株中god活力较低，利用基因工程进行改造成为一种有效的手段。上个世纪外国学者kovacevic等与guo等在毕赤酵母中成功表达黑曲霉god。pulciv等人也将青霉god的基因成功克隆到酵母中并实现表达。随着god需求的增加我国god研究也逐渐增多。周亚凤等人将黑曲霉god基因克隆到酵母中并高效表达。高庆华等也将青霉god基因克隆到酵母中并表达。大肠杆菌一直作为外源蛋白表达的首选系统，但很少应用在god外源表达表达方面。现有报道中仅witts等及顾磊等人尝试在大肠杆菌中表达黑曲霉god。细菌与大肠杆菌的同源性更高，可能更适合在大肠杆菌中表达，但此类的研究此前未见报道。本研究以海洋细菌cgmccno.17228为出发菌株。采用e.colibl21(de3)为表达宿主，构建god高产大肠杆菌工程菌株，实现god在大肠杆菌中的高效表达，并对重组god酶学性质进行分析。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种产低温葡萄糖氧化酶(god)的基因工程菌。

本发明的第二目的在于提供一种重组表达载体。

本发明的第三目的在于提供一种宿主细胞。

本发明的第四个目的在于，提供一种低温葡萄糖氧化酶的生产方法，通过发酵生产上述所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌获得低温葡萄糖氧化酶。

本发明的第五个目的在于提供一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌用于发酵生产低温葡萄糖氧化酶的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是将菌株cgmccno.17228的低温葡萄糖氧化酶基因导入大肠杆菌bl21构建获得。

一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌的构建方法；以cgmccno.17228为出发菌株，经比对获得菌株cgmccno.17228的低温葡萄糖氧化酶基因，通过基因合成获得基因，并构建表达载体pet28a-god，将表达载体倒入大肠杆菌bl21构建获得所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌e.colibl21/pet28a。

进一步的，所述的构建方法包括如下步骤：

步骤一、获得目的序列：柠檬酸杆菌cgmccno.17228为出发菌株，测序的cdna，与现有低温葡萄糖氧化酶基因比对得到原始低温葡萄糖氧化酶基因。

步骤二、克隆载体构建：对出发菌株的低温葡萄糖氧化酶基因进行基因全长合成并构建于克隆载体pmd-9-t，命名pmd-9-t-god。

步骤三、目的基因扩增：用下述引物以pmd-9-t-god为模板进行pcr扩增。pcr产物于1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定纯度和分子量的大小。pcr产物经dna回收试剂盒回收。

5'端引物序列p1为：5'-atgaagtccactattatcacctcca-3'，

3'端引物序列p2为：5'-ctaggcacttttggca-tagtcttca-3'

步骤四、重组质粒pet28a-god的构建：pcr克隆菌株cgmccno.17228的低温葡萄糖氧化酶基因，连接到pet28a(+)中构建重组质粒pet28a-god。用酶ndei、xbai同时酶切低温葡萄糖氧化酶基因和载体pet28a(+)，将酶切回收产物用t4dna连接酶连接起来，构成重组质粒pet28a-god。

步骤五、重组菌株e.colibl21/pet28a的构建：将步骤四获得的重组质粒pet28a-god电转化导入到大肠杆菌bl21中，阳性转化子，即为所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌e.colibl21/pet28a。

本发明还提供重组葡萄糖氧化酶酶学性质，包括：最适作用温度和温度稳定性。

本发明的有益效果为：本发明采用基因工程方法，在对cgmccno.17228进行基因工程改造以构建产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌，以cgmccno.17228为出发菌株，将其低温葡萄糖氧化酶基因克隆到大肠杆菌bl21可以构建一种能大幅提高低温葡萄糖氧化酶产量、缩短发酵时间的基因工程菌，从而解决了现有野生菌株活力低，发酵时间长等缺点，具有广泛的工业应用前景。

说明书附图

图1为目的基因克隆pcr电泳检测结果图；

图2为重组质粒pet28a-god的酶切鉴定图；

图3为目的蛋白低温葡萄糖氧化酶的sds-page检测结果图；

图4为纯化后的低温葡萄糖氧化酶的sds-page检测结果图；

图5温度对重组葡萄糖氧化酶活力影响，其中a为最适温度曲线图，b为稳定性曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

步骤一、获得目的序列

以菌株cgmccno.17228为出发菌株，挑取出发菌株的单菌落于8ml种子培养基25℃下160r/min振荡培养48h，以2％的接种量接种到含有100ml种子培养基的250ml摇瓶中，160r/min，25℃摇床中培养48h。取2ml的菌液8000r/min离心，去掉上清液，用pbs洗涤两次，再次离心收集菌体。利用基因组大量提取试剂盒(powermaxtmsoildnaisolationkit)提取基因组dna，所提dna送到北京百迈克生物科技有限公司进行dna质量检测，并使用illuminahiseqx10高通量测序平台进行双端测序(pe150)，得cdna。对测序数据过滤低质量后，利用velvet软件进行初步组装得到最终基因组框架图(draftgenome)。根据genbank公布低温葡萄糖氧化酶的基因序列通过blast比对确定目的基因。低温葡萄糖氧化酶工程菌菌株的构建如seqidno:1所示，genbank号为mk054202。

所述的出发菌株的保藏信息为：一种产葡萄糖氧化酶海洋细菌(citrobactersp.)8-ⅲ菌株，该菌株已于2019年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为cgmccno.17228。

所述的种子培养基：葡萄糖2％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、胰蛋白胨1％，ph7.0。

步骤二、克隆载体构建

交由synbiotechnologies公司对出发菌株的低温葡萄糖氧化酶基因进行基因全长合成并构建于克隆载体pmd-9-t，命名pmd-9-t-god。

步骤三、目的基因扩增

5'端引物序列p1为：5'-atgaagtccactattatcacctcca-3'，

3'端引物序列p2为：5'-ctaggcacttttggca-tagtcttca-3'

用引物以pmd-9-t-god为模板进行pcr扩增。

pcr反应体系为50μl：基因组dna100ng，引物各0.2μmol/l，dntps250μmol/l，5×q5high-fidelitydnapolymerasebuffer10μl，q5high-fidelitydnapolymerase0.5μl。

pcr反应条件：98℃5min；98℃30s，65℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃10min。

pcr产物于1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定纯度和分子量的大小，如图1所示，pcr产物经dna回收试剂盒回收。

步骤四、重组质粒pet28a-god的构建

将pet28a(+)用ncoi，xhoi进行双酶切，与目的基因连接，重组质粒命名为pet28a-god。通过1％琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行检验，结果见图2。该表达质粒的构建方式删除了pet28a(+)质粒载体上的全部标签，可用来构建无标签的基因表达工程菌。

步骤五、重组菌株e.colibl21/pet28a的构建

将该重组质粒pet28a-god电转化导入到大肠杆菌bl21中，阳性转化子，即为所述的产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌e.colibl21/pet28a。

步骤六、重组菌株e.colibl21/pet28a产低温葡萄糖氧化酶

将产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌e.colibl21/pet28a接种于10ml含卡那霉素的lb液体培养基中，160r/min，25℃，过夜培养。取上述菌液按2％接种量接种于100ml含卡那霉素的发酵培养基中，160r/min，25℃培养4h，加入iptg诱导表达。收集菌体发酵液10000r/min，4℃，离心20min，弃上清。沉淀菌体以ph7.4的pbs洗涤，重复洗涤3次。洗涤后用10ml的pbs重悬。将重悬液超声裂解15min(开3s，间隔5s，功率200w)。将裂解液10000r/min，4℃，离心20min，上清液为粗酶液，通过sds-page分析目标蛋白表达情况，如图3所示，加入iptg后成功诱导外源蛋白的表达，以没有装载葡萄糖氧化酶的e.colibl21/pet28a菌体作为对照，在e.colibl21/pet28a菌体裂解液全菌、上清液和沉淀的约46kda位置清晰可见出现一条蛋白带，该蛋白带分子量大小与重组葡萄糖氧化酶的理论分子量(46kda)相一致，由此推测该蛋白带为诱导表达的葡萄糖氧化酶。此外，由图3中的泳道2可见菌体裂解后的可溶部分也检测到god蛋白条带，说明克隆菌株不仅能有效表达葡萄糖氧化酶，而且重组葡萄糖氧化酶为可溶性表达。

所述的lb培养基：酵母提取物0.5％、氯化钠1％、蛋白胨1％，ph7.0。

所述的发酵培养基：葡萄6％糖、蛋白胨0.3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.07％、氯化钾0.05％、硝酸钠0.4％，ph6.5。

步骤七、蛋白纯化

粗蛋白用ni²⁺-nta柱(novagen)进行亲和层析纯化，洗脱的蛋白液4℃保存，蛋白样品经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测，同时以空载体和未诱导作对照记录并分析结果(见图4)，目标蛋白被150mmol/l和200mmol/l咪唑溶液洗脱下来，大小在46kda左右，且洗脱液中杂蛋白较少。

步骤八、重组葡萄糖氧化酶酶学性质测定

将适当稀释的酶液分别在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃下进行反应，并按照邻联茴香胺连续分光光度法进行酶活测定。以酶活最高者为100％计算相对酶活，从而确定该酶的最适作用温度。将适当稀释的酶液分别放到0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃下保温1h，每隔30min取样，在冰上放置5min后进行酶活测定。以未进行热处理的酶液的酶活为100％计算相对酶活，确定重组god的热稳定性(见图5)。

在没有培养基优化的情况下，发酵60h的低温葡萄糖氧化酶的酶活达到5.5u/l，远高于出发菌株柠檬酸杆菌cgmccno.17228生产低温葡萄糖氧化酶的酶活，同时总发酵时间低于柠檬酸杆菌cgmccno.17228，具备工业化生产能力。此外，重组葡萄糖氧化酶在低温(25℃以下)酶活较高并且稳定性良好，体现出低温酶特性，在的低温检测和食品保鲜领域有良好的应用前景。

序列表

<110>大连大学

<120>一种产低温葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1292

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccatgagcgaggacatcttcgacgcgattatcgttggcgcaggtctggcaggtagcgttg60

cagcactggttctggcacgcgaaggcgcacaagttctggttattgaacgcggcaactctg120

caggcgcaaaaaacgttaccggcggtcgtatgtacgcacatagcctggaacgcattattc180

cgggttttgcggaacaggcaccgattgaacgtatcatcacccacgagaaactggcgttca240

tgaccgataaaggcgcgatgaccattgactactgtaatggcgaagaagcggcaagtagcc300

aagtcagctacagcgttctgcgcagcaaatttgacgcctggctgatggaacaagcagaag360

aagcaggcgcacaactgattaccggtattcgtgtcgataacgtcgttcagcgcgaaggta420

aagttgttggcgttgaagcagacggcgatattctggaagcgaaagttgttattctggcgg480

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cggaaatggcagttagcattgcacgcgacctgtttaccgttgacggttctgctccggttc1200

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acggtctgaaaggcgttaccgttctgctcgag1292

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgaagtccactattatcacctcca25

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctaggcacttttggcatagtcttca25