专利名称：一种测定葡萄糖含量及葡萄糖氧化酶活性的比色分析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定葡萄糖含量和评价葡萄糖氧化酶酶活性的比色分析法，属于分 析化学领域。
背景技术：
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD, EC 1.1.3.4)是生物医学和生物化学研究领域 中一种重要的天然酶，它在有水环境中能催化分子氧对p-D-葡萄糖的氧化反应，生成葡 糖酸内酯，后者将进一步水解生成葡萄糖酸和过氧化氢。长期以来，葡萄糖氧化酶具有 很好的商业价值和研究价值，它不仅能用在食品加工和饮料生产中去除产品中的葡萄糖 或氧，得到葡萄糖酸，而且可用于检验各种样品中D-葡萄糖的含量，如人和动物的血液、 尿液以及发酵工业中的原料液等。此外，它还可作为模型生物大分子，在酶的固定化、 生物传感器、组织工程、药物控制释放、免疫分析等领域有非常广泛的应用。
目前，建立快速、准确、有效地测定GOD催化活性的分析方法和评价体系一直是研 究工作者努力追求的目标。1998年，Aravind Subramanian等人应用费顿试剂法来评价 GOD的活性(Aravind Subramanian, Stephen丄Kennel, Patrick I. Oden, et al. Enzyme Microb. Technol. 1999, 24， 26-34)。在他们的工作中，他们将定量的硫酸亚铁溶解于一 定浓度的乙酸钠缓冲溶液中，作为费顿试剂，利用GOD催化葡萄糖所产生的过氧化氢来 氧化溶液中的Fe"离子，产生红色的Fe^离子。由于FeS+离子在340nm处有光谱吸收， 于是可建立吸光度-Fe^离子浓度的关系，从而得以用比色法来确定FeS+离子的含量，并 可反推出酶促反应中生成的过氧化氢的量。然而，这样的方法具有很大的缺点首先， 亚铁离子极容易被空气中的氧气缓慢氧化，从而对检测的灵敏性产生不利影响；其次， 尽管可采取每天配制新鲜费顿试剂和调整溶液pH值为4.0的办法来减缓Fe^在空气中 的氧化，但这样就导致适用pH值范围窄，操作耗时耗力，操作可重复性差；另外，由于 过氧化氢氧化Fe^常需要数十分钟才可完全反应，因此分析速度比较慢，导致测试效率 低下。2002年，A. Naqvi等人应用邻苯二胺法来研究GOD固定化酶的催化性能(A. Naqvj, P. Nahar, R.P. Gandhi, Anal. Biochem. 2002, 306: 74-78)。在测定前，他们须配制新鲜 的含有定量过氧化氢和邻苯二胺的柠檬酸-磷酸钠缓冲溶液，组成底物-染料溶液。在测定 GOD催化能力时，他们将定量标准底物-染料溶液加入至GOD与葡萄糖的反应液中，最 后记录490nm处的吸光度。遗憾的是，这种方法还没有被很好的改进而建立起可靠的GOD活性评价体系，而只停留在定性分析的基础上。原因在于，邻苯二胺见光和遇到空 气容易很快变色，不易长时间地存放。另外，这种染料本身容易和葡萄糖形成黑色的络 合物，严重影响结果分析。由于这些局限性，他们的分析仅限制在pL级的微小孔板内。 目前，利用电化学分析方法来分析GOD的催化活性可有效地避免以上分析方法的局限 性，并具有其探测下限浓度低、数据可靠等优点；但不利因素在于，它的适用范围不宽(比 如无法对含有复杂成分的液体样品进行葡萄糖含量分析)，需要实验室建立配备有完善的 电化学分析仪器，对电解液的导电性和离子特性要求苛刻，此外，还对实验操作人员的 专业技能和数据处理能力提出较高的要求。由此可见，电化学法并不是一种适合于广泛 应用的酶活性检测技术。
为了克服已有的GOD测定体系的缺点，设计出操作简便、灵敏准确、快速可靠的检 测方法，拓宽检测体系的适用范围，必须对已有评价体系进行重新调整，改变不合理的 因素。正是出于这样的目的，我们发明了一种可定性和定量的测定葡萄糖浓度和葡萄糖 氧化酶活性的方法，通过反复实验，建立了较为实用的酶分析评价体系。
发明内容
本发明的目的是采用 一种新的比色分析法，利用GOD催化葡萄糖产生出的过氧化氢 快速地和显色剂进行反应，快速生成特定颜色的染料化合物。为了实现这个目标，我们 选用4-氨基安替比林和苯酚组成显色剂，引入辣根过氧化物酶来催化过氧化氢氧化显色 剂生成醌亚胺的反应。所生成的粉红色或红色醌亚胺染料在510nm处具有明显的光谱吸 收，利用紫外-可见分光光度计即可实现快速测定。
本发明具有以下特点
1、 本发明所采用的新型比色法具有快速灵敏的特点，对过氧化氢浓度的测定通过对醌亚 胺染料的吸光度来实现，由于以辣根过氧化物酶作催化剂，反应迅速，变色时间在5秒 左右，比以往的比色法具有更短的反应时间。
2、 在本发明的方法中，整个操作环境十分友好，不使用有毒物质，溶液不对人体产生任 何伤害，而且反应条件温和，测试样品的适用范围宽，不仅可以在10 5(TC下进行测试， 而且pH值适用范围可以为3 9， 一般不受样品中其他成分和杂质的影响。
3、 在所建立的评价体系中，所用的显色剂4-氨基安替比林和苯酚以及辣根过氧化物酶方 便易得，价格便宜，测试中消耗样品量少，因此非常经济有效。
4、 本方法建立的评价体系，对检测仪器的要求仅限于紫外-可见分光光度计，不需要苛 刻的操作条件和复杂的操作过程，适合广大企业、学校、医院、研究单位普遍使用。本技术发明是通过以下措施实现的
GOD酶活性分析的原理如下图所示。整个过程包括两个步骤第一步，在水溶液中
和GOD的存在下，1mol葡萄糖和1mol分子氧反应生成1mol的葡萄糖酸和1mol的过 氧化氢；第二步，在辣根过氧化物酶存在时，所产生的过氧化氢进一步和半mol量的4-氨基安替比林和苯酚反应，生成醌亚胺和2倍mol量的水。
其中，GOD代表葡萄糖氧化酶，HRP代表辣根过氧化物酶。在第一步反应中，GOD 只能专一地催化溶液中的p-D-葡萄糖的氧化反应，而不对a-D-葡萄糖有任何的催化效果。 不过，a-D-葡萄糖和p-D-葡萄糖之间存在这可逆的转化平衡，随着溶液中(3-D-葡萄糖的 消耗，不断有a-D-葡萄糖转化成p-D-葡萄糖。因此，该反应不对样品中葡萄糖的构型有 特定要求。为了科学地表述，将参与反应的葡萄糖写成p-D-葡萄糖。
无论是测定葡萄糖的含量，还是测定葡萄糖氧化酶的活性，都是建立在测定第一步 催化产物过氧化氢的量的基础上。在本发明中，两步反应都是在两只不同试管(或聚丙烯 离心管)中进行的，在试管中放置磁力搅拌转子，然后将试管放置于恒温水浴中，进行温 和的搅拌。
在反应前，首先配制0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液IOOOmL，然后用该缓冲液配制 50mmol/L的p-D-葡萄糖溶液50mL，浓度为0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液50mL，以 及浓度为0.05mg/mL的辣根过氧化物酶溶液25mL。然后以二次蒸馏水配制200mL的 4-氨基安替比林溶液和200mL的苯酚溶液各250mL。其中，为了定量测定第一步反应的 催化产物过氧化氢的量，以1.0mL4-氨基安替比林标准溶液，1.0mL苯酚标准溶液，0.5mL 辣根过氧化物酶溶液的混合液组成标准分析液，用于进行第二步显色反应和生成红色染 料的吸光度测定。
在用移液管定量移取葡萄糖溶液和GOD溶液到同一个反应试管里之后，反应液在一 定温度(通常是25'C下)下磁力搅拌反应一定时间。然后，在规定的时间内，用洁净的移液管吸取反应液2.5mL，加入以1.0mL4-氨基安替比林标准溶液，1.0mL苯酚标准溶液， 0.5mL辣根过氧化物酶溶液所组成的标准分析液，均匀搅拌，可以观察到溶液在5秒左 右的时间内迅速变色。然后在1分钟内快速测定生成的红色醌亚胺染料的吸光度，也就 是说，在510nm处连续测量三次吸光度，并取平均值。
如果是为了测量待测样品中葡萄糖的含量，让GOD的量远远过量，并将反应时间设 定为足够长，然后再进行显色反应和吸光度测定；如果是为了测定GOD的催化活性，让 葡萄糖的量远远过量，并将反应时间定为15min。在反应进行到第15分钟时，完成取样 和显色反应，并迅速开始吸光度的测定。另夕卜，如果测定环境条件(pH值和温度)对GOD 的催化活性的影响，则将根据情况配制特定pH值的磷酸盐缓冲溶液和各反应试剂的标准 溶液，并将第一步反应在设定温度的恒温水浴中进行。
图1本发明实施例中所测定的过氧化氢浓度-醌亚胺染料吸光度的标准曲线，测试条
件为室温(25t:)， pH值为7.0。
图2本发明实施例中测定的自由GOD酶催化活性随溶液pH值变化的关系曲线。 图3本发明实施例中测定的自由GOD酶催化活性随环境温度变化的关系曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明 实施例1
测定待测样品中葡萄糖的含量。将待测样品配成一定浓度的水溶液(pH-7.0)。取 1.0mL待测样品溶液，转移到洁净的试管中，同时加入4.0mL浓度为0.1mg/mL的GOD 标准溶液，然后在磁力搅拌下于25'C的恒温水浴中反应2.0h。用三只洁净的移液管分别 量取1 .OmL 4-氨基安替比林标准溶液，1 .OmL苯酚标准溶液，以及0.5mL辣根过氧化物 酶标准溶液， 一起混合于另一只洁净试管。再用移液管移取2.5mL上述葡萄糖和GOD 的反应液，搅拌30s后进行吸光度测量。用UV-2010型紫外-可见分光光度计测定，以 pH-7.0的0.1mol/L浓度的磷酸盐缓冲溶液为参比液，波长扫描范围为600-400nm，读 取测定溶液在510nm处的吸光度为最后结果。根据图1所示的标准曲线，计算出特定吸 光度所对应的过氧化氢的浓度，通过所得的结果进行简单的体积换算，即可得到1.0mL 中待测样品中葡萄糖的含量。
实施例2
测定葡萄糖在pH=7.0和25。C时的催化活性。取1.0mL0.01mg/mL的GOD溶液，移注到洁净的试管中，再加入4.0mL50mmol/L的(3-D-葡萄糖溶液，在磁力搅拌下于25
'C下反应15分钟。在反应结束前，提前3分钟开始配好标准分析溶液，即量取1.0mL4-
氨基安替比林标准溶液，1.0mL苯酚标准溶液，以及0.5mL辣根过氧化物酶标准溶液，
一起混合于另一只洁净试管。在第14分钟到时，迅速量取2.5mL的葡萄糖-GOD反应液，
与之混合。搅拌30s后，快速的在UV-2010型紫外-可见分光光度计测定所生成的红色醌
亚胺染料的吸光度，记录下510nm处测得的吸光度数值。利用图1所示的标准曲线，计
算特定吸光度下对应的过氧化氢的浓度。最后，酶的活性通过公式(1)计算
，的冊所生成的仏A的物质的量(mo/) GO"的活性-15分钟，附g酶-("
最后酶的活性的单位为mol H202/min mg酶。 实施例3
测定葡萄糖在pH-5.0和37。C时的催化活性。首先配制0.1mol/L的pH=5.0的磷酸 盐缓冲溶液1000mL,然后以此缓冲液为溶剂，分别配制50mmol/L的J3-D-葡萄糖溶液 50mL，以及浓度为0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液50mL。测定酶活性前，取1.0mL浓 度为0.1mg/mL的GOD标准溶液于洁净的试管中，加入4.0mL50mmol/L的(3-D-葡萄糖 溶液，按照实施例2所描述的方法进行操作，最后即可测定酶在pHN5.0和37'C时的催 化活性。
权利要求
1.一种测定葡萄糖含量及葡萄糖氧化酶(GOD)催化活性的方法，其特征是由两个反应步骤组成，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是具体方法为首先配制0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液1000mL,然后用该缓冲液配制50mmol/L的卩-D-葡萄糖溶液50mL，浓度为0.1mg/mL 的葡萄糖氧化酶溶液50mL，以及浓度为0.05mg/mL的辣根过氧化物酶溶液25mL;然后 以二次蒸馏水配制200mL的4-氨基安替比林溶液和200mL的苯酚溶液各250mL;标准分 析溶液由1.0mL4-氨基安替比林标准溶液，1.0mL苯酚标准溶液，以及0.5mL辣根过氧化 物酶溶液组成，分析第二步反应所生成的醌亚胺染料的吸光度前，吸取2.5mL第一步反应 的反应液，与标准分析溶液混合后均匀搅拌30s即可实施吸光度测定。
全文摘要
本发明涉及一种测定葡萄糖含量及葡萄糖氧化酶活性的比色分析法，具有高效、快速、灵敏的比色法，可用于测定样品中葡萄糖的含量或分析葡萄糖氧化酶的活性。该评价体系的特点是方法简单实用、反应体系温和、环境友好、样品耗量少、分析重复性好。此外，分析所需的条件不高，在一般的实验室中只要利用普通的紫外-可见分光光度计可实现准确分析。与传统的邻苯二胺法、费顿法以及电化学法相比，该法可有效地避免烦琐的操作步骤，减少了时间和人力的消耗，而且有效减小了环境因素对酶活性检测灵敏度的影响。因此，本发明所涉及的新型的葡萄糖氧化酶分析法可广泛应用于食品制造、酿酒与饮料、医学检测与化验、生物化学研究等领域。
文档编号G01N33/50GK101655493SQ20081021009
公开日2010年2月24日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者侯晓晖, 刘白玲, 荣 罗, 陈华林 申请人:中国科学院成都有机化学有限公司