测定血液中葡萄糖的方法和检测条的制作方法

专利名称：测定血液中葡萄糖的方法和检测条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在样品中测定待分析物的量的方法和检测条。尤其是，本发明涉及测定血液中葡萄糖的量的方法以及在这样的方法中所采用的样品检测条。
背景技术：
对各种类型液体中的化学和生化成分进行定量对于医学来说变得越来越重要，特别是对于有颜色的含水生物液体例如全血和尿液，以及生物衍生物例如血浆和血清。该能力在测定有害物质、麻醉剂、治疗药物的作用影响时以及在诊断中都是十分重要的。在一些应用中，人能够在实验室环境之外完成检测并得到快速而精确的结果是很重要的。例如，糖尿病患者需要在一天之中几次检测他们自己血液样品中的葡萄糖从而调控他们的饮食和药物。其检测结果必须快速而精确。
测定血液中葡萄糖的检测试剂盒对于本领域技术人员来说是已知的。这样的检测试剂盒通常包括一个检测条，在检测条上包含一种或更多在葡萄糖存在时发生反应从而在检测条上引起颜色变化的化学物质。检测条上的颜色变化可通过已知的光学检测方法来检测。虽然可以检测的变化有样品的吸收率，透射率或反射率，但是用于葡萄糖测定通常采用的是反射率的变化。一般来说，当样品中葡萄糖浓度升高时，检测条将产生更浓的颜色或变得更暗。较暗的检测条将产生较低的反射率，因此较低的反射率将显示出样品中含有较多的葡萄糖。
血液样品中红细胞的存在会通过在进行葡萄糖读取时向探测器反射与之相同的波长的光，或通过阻断光的透射以使得对应于葡萄糖的颜色发展情况不能被读取，或通过光的散射而干扰反射率的读取。这样，一些检测试剂盒要求在将样品施加到检测条之前要将样品中的红细胞过滤或裂解。
涉及血液中葡萄糖比色测定的一系列专利包括US4935346，US5049487，US5049394，US5179005以及US5304468，它们全部转让给了加利福尼亚州芒廷维市的生命扫描有限公司，在此全部引入作为参考。其中公开的方法包括从一个惰性双面多孔基质的表面上进行反射率的读取。基质包含一种试剂，当待分析的液体被施加到第一表面上并在基质上移动至第二表面时该试剂与待分析物反应生成光吸收性反应产物。为了补偿红细胞比容变化的干扰和由对应于给定的葡萄糖浓度所产生的颜色层析引起的变化，第二表面反射率的检测采用两个独立的波长。由穿过惰性基质的液体湿润了第二表面而引起的反射率的起始下降触发定时电路。该方法不需要从血清或血浆中分离红细胞。
转让给Boehringer Mannheim GmbH的标题为“采用PQQ依赖型脱氢酶比色测定待分析物的方法”的美国专利US5487708公开了一种待分析物的比色测定方法，该方法利用PQQ依赖型脱氢酶的氧化作用在电子受体存在的情况下从富电子的芳香族亚硝基化合物中通过使亚硝基化合物还原为亚氨基化合物并通过检测颜色的形成而测定亚氨基化合物。
标题为“具有降低的红细胞比容敏感性的血液葡萄糖检测条”的美国专利US5789255也转让给了生命扫描有限公司，在此引入作为参考。该专利公开了一种试剂检测条，它包含各向异性的膜，在样品面具有相对大的孔径而在检测面具有相对小的孔径。检测样品被施加于样品面并通过膜到达检测面，而相对大的红细胞被从血液样品中过滤出来。膜上充满了检测试剂，该试剂包含能与葡萄糖和氧气反应从而产生过氧化氢的成分，能与过氧化氢反应的颜色指示剂以及能减少红细胞对葡萄糖浓度检测影响的丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物被认为具有相对高的分子量并且能影响样品的粘度和流动。
在这些采用光学检测方法的检测葡萄糖的先有方法中，已经认识到检测系统必须调整以使得反射表面不透明。已知的是反应表面越不透明，对红细胞的存在就越不敏感。在一些这样的方法中，不透明性是通过在基质的反射表面掺入散射核来调节的。这样的已知散射核包括二氧化钛，硅藻土，金属粉末，矿物以及这些和其他材料的各种组合物。其他已知能影响不透明性的因素包括孔径尺寸，孔结构以及支持基质的表面面积。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种不需要从全血样品中分离或裂解红细胞的液体样品检测方法。
本发明的又一个目的是提供这样一种使用非常少量的，特别是小于1微升的液体样品就能进行检测的方法。
本发明的另一目的是提供这样一种对从样品到样品的红细胞比容的变化不敏感的检测方法。
本发明还有一个目的是提供一种适合用于本发明方法中的检测条。
上述目的都体现在本发明中，其中测定样品中葡萄糖的方法包括采用一个双面检测条，在该检测条中采用了一种或更多聚合物来改变进行光学读取的表面的不透明性。在优选的实施例中，聚合物也可以通过将检测试剂保持在反应点和/或读取点而控制反应产物的层析。根据本发明，在全血样品中测定葡萄糖浓度的方法包括(a)提供一个具有样品面和反应面的检测条，检测条适合于在样品面上接受样品并将它输送给反应面，所述检测条载有检测试剂，而所述的检测试剂包括变化颜色来指示样品中存在葡萄糖的颜色指示剂系统，所述的检测条进一步包含至少施加于反应面上的聚合物，所述的聚合物提高了检测条反应面的不透明性；(b)施加血液样品至检测条的样品面；以及(c)检测反应面的颜色变化从而测定血液中葡萄糖的浓度。
检测条优选含有由选自聚醚砜和改性聚醚砜的材料制成的多孔膜。一种或更多施加于多孔膜的聚合物优选地选自丙烯酸胶乳聚合物和聚苯乙烯硫酸钠。
附图简述结合附图本发明将更容易理解，其中

图1A是根据本发明制造的检测条的透视图；图1B是根据本发明制造的检测条可替换实施例的分解图；图1C是适合用于本发明的检测条的另一个可替换实施例的分解图；图2是根据本发明制备的检测条检测水溶液和全血中葡萄糖时采用具有大和小孔径的膜所取得的结果图；图3显示的是根据本发明的毛细管填充形式的检测条对于水溶液和全血中不同浓度葡萄糖作出的响应；图4显示的是根据本发明制成的检测条上不同端点的响应，在该检测条上的反应化学物呈条带状分布。
发明详述本发明的方法包括测定样品中的葡萄糖，其中通过已知的步骤即将样品放置在检测条的第一面上，允许样品中的任何葡萄糖与检测条中的试剂反应，以及在样品穿过检测条后对检测条的反面进行光学检测。根据本发明，检测条上具有一种或更多聚合物，它们能够以某种方式改变检测条的不透明度以使得葡萄糖的测定对于样品中存在的红细胞更加不敏感。在图1A-C的每一幅图中，层的厚度是为了清楚的示例而不代表检测条产品中层的实际厚度。
图1A是适合用于本发明的方法中的检测条10的透视图。如图1A所示，检测条10包含一个与多孔膜11连接的手柄13。由于本发明的方法不需要在进行光学检测之前从样品中过滤掉红细胞，所以检测条中X、Y、Z方向上孔的结构可以是不变的，当然也可以采用具有各向异性孔径尺寸梯度的膜。多孔膜11具有一个第一面12，它被称为检测面或样品面，以及一个第二面14，它被称为反应面。样品通过手柄13中的洞17被沉积到多孔膜11的检测面12上。样品穿过膜的孔到达多孔膜11的反应面14。随后，将反应面14的光学检测值例如反射率与葡萄糖浓度关联起来从而确定样品中存在的葡萄糖量。
根据本发明，多孔膜11的反应面14采用检测试剂组合物16来处理，该组合物包含一个能改变颜色从而指示样品中葡萄糖存在的颜色指示剂系统，试剂组合物16还进一步包含能影响多孔膜11的反应面14的不透明性的聚合物。试剂组合物16所包含的聚合物可以通过诸如浸渍、涂覆和剥离(stripping)等方式施加到检测条上。在如图1A所示的实施例中，组合物作为涂层16施加在检测条10的反应面14上。在另一个实施例中，组合物首先通过例如浸渍的方式而施加到面12，穿过检测条而在面14上重新构建。那些本领域技术人员可以优化组合物应用过程的参数来实现预期的包括聚合物的组合物层16。试剂组合物中的聚合物也能影响待分析物在检测条上的层析。可以通过已知的方式在组合物16上添加一个光学上清晰的窗口18，包括采用层压压合手段或采用压力敏感粘合剂19粘合。窗口18可以由聚酯或任何其他光学上合适的材料制成。
图1B显示的是根据本发明所制造的检测条的一个可替换实施例。在这个实施例中，检测条20包含手柄13，从手柄上切割出一个洞15。圆盘25包含带有一个样品面22和一个反应面24的多孔膜21。被施加到反应面24的检测试剂组合物26包含能改变颜色从而指示出样品中葡萄糖存在的颜色指示剂系统，以及改变多孔膜21的反应面24不透明性的聚合物。圆盘25适合安放在洞15中，光学上清晰的窗口28被施加在圆盘25以及手柄13的接受部分。可以看到，这个实施例与图1A中的实施例或前述的先有专利例如US5789255中所显示和描述的现有装置相比需要较少的处理后的多孔膜材料。可以想到的是圆盘25可以呈条状或其他合适的几何形状。
图1C显示了适合用于本发明的检测条的又一个实施例。在这个实施例中，检测条30包含手柄33。条带35包含具有一个样品面32和一个反应面34的多孔膜31。多孔膜31的反应面34上提供有组合物36，该组合物含有检测试剂，而检测试剂中包含能改变颜色从而指示样品中葡萄糖存在的颜色指示剂系统和能改变多孔膜31的反应面34不透明性的聚合物。带有毛细通道38的间隔物37通过粘合剂而施加到检测条33的一部分和条带35上，这样一来毛细通道38就排列在条带35的一部分上。盖子以任意的方式放置在间隔物37上以便于防止仪器被污染。窗口布置在检测条的相反一面上。
在所示出的每个实施例中，多孔膜支持着试剂组合物，该组合物在葡萄糖存在时发生反应而产生能够被光学检测器检测的反应产物从而实现定量测定葡萄糖。反应的化学类型既可以是还原反应也可以是氧化反应。适合用于本发明的还原化学体系可以是，例如PQQ-GDH或NAD-依赖型GDH体系。己糖激酶还原体系与葡萄糖氧化酶氧化体系一样也可以使用。对于NAD依赖型GDH体系来说，合适的介质包括而不限于那些在US5520786中所公开的内容。这样的介质包括选自取代或非取代3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪和3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪的化合物。合适的指示剂包括但不限于WST-4以及在US5126275和US5322680中所公开的一般的2-噻唑基四唑盐类化合物。前述的每项专利转让给了本发明的受让人，在此全部引入作为参考。
在本项工作的过程中，发现US5520786中所报道的用于电极基的NAD依赖型GDH体系中的介质也可以用于如上所述的光基NAD依赖型GDH体系和光基PQQ-GDH还原体系中。至少由于两个理由使得这个结果令人感到惊奇。首先，介质对于不同的酶是特异性的。不是所有在NAD-GDH体系中工作的介质都能在PQQ-GDH体系中正常工作。其次，US5520786所公开的介质是有颜色的。虽然这在如US5520786所公开的电极基体系中不成问题，但是人们可以预测到这些介质不能被用在如这里所公开的光基体系中。然而申请人发现，由于这些介质在反应过程中从有色变成无色，因此它们并不干扰在末端点的检测。本领域技术人员可以想象得到一般优选的是检测颜色的产生，这样能给出较好的检测精度，但是颜色的消失也是能够检测的。这样，采用带有US5520786所公开的介质的PQQ-GDH还原体系是在本发明的范围之内的，并且除此之外本文还公开了采用一种或更多聚合物来控制不透明性。适合于这样的体系的指示剂包括四唑指示剂例如WST-4，可以从Dojindo实验室得到，或者是四唑盐指示剂例如上述的US5126275和US5322680所公开的那些。
适合用于本发明方法中的多孔膜材料包括商品化材料例如多孔聚醚砜膜，如那些来自Pall公司的以Supor和Presense商标名出售的材料；以及改性多孔聚醚砜膜，例如来自Pall公司的以Predator商标名出售的材料。那些本领域技术人员将会认识到其他的多孔膜也可以作为本发明检测条中的膜。
适合用作施加于膜上的聚合物材料包括，举例来说，丙烯酸胶乳聚合物例如来自UnionCarbide公司的以UCAR商标名出售的材料，聚苯乙烯硫酸钠聚合物例如来自Polysciences公司的材料，以及其组合物。
具体实施例方式
实施例1根据本发明所制备的检测条对水溶液和全血中葡萄糖的剂量响应通过小孔和大孔的检测条膜同时确定。多孔膜采用买自Pall公司的Supor牌聚醚砜膜，具有0.2和5.0微米的均匀(各向同性)孔径。每个多孔膜采用含有如表1所示组分的试剂对膜的光滑反应面进行浸渍处理。
表1

膜在高速气流烘箱中40-50℃下至少干燥5分钟。膜被切割成圆盘状并适合于以上结合图1B中实施例描述的检测条。采用来自AdhesivesResearch的Arcare7843压力敏感粘合剂将透明的聚酯薄膜窗口施加到涂覆过的反应面。检测条采用反应面朝下来定向。随后，500纳升或者是葡萄糖水溶液或者是掺入葡萄糖的全血检测样品被施加到检测条中每个圆盘的粗糙的样品面。葡萄糖溶液用0.15M的HEPES钠调节pH至7.5。水溶液和全血样品中的葡萄糖浓度为0mg/dL，50mg/dL，100mg/dL，250mg/dL以及600mg/dL。全血样品被掺入至可显示的水平并且采用Yellow Springs公司的2300型STAT Plus葡萄糖检测器来检测血浆葡萄糖。在每个样品检测条上每个样品溶液重复检测两次。每个检测条在680nm处的反射率采用2002年4月19日申请的共同未决专利S.N.60/373583中所描述的仪器在透明的聚酯薄膜窗口处进行检测。这个仪器采用了直径大约为0.030英寸的小阅读面积反射率读取探头。所检测的反射率值R通过公式K/S＝(1-R)2/2R而转化成K/S线性曲线。如图2所示，每个水平的葡萄糖所检测到的反射率对于水溶液和全血，以及对于检测圆盘的不同孔径尺寸来说都是基本上相同的，这表明对于根据本发明制成的检测条来说剂量响应基本上既不依赖于膜的孔径尺寸也不依赖于样品中是否存在全血。
实施例2本实施例证明了当样品的施加方式采用如图1C所示的侧面流动毛细管形式而不是上述实施例1中所采用的流动通过技术时浸渍试剂膜技术是可行的。来自Pall公司“Presense”商标牌的0.8微米孔径聚醚砜膜的样品采用实施例1中所描述的方法进行处理。处理好的膜的条带以图1C所示的方式被装配在毛细管流动检测条上。每个检测条上添加了600-800纳升的样品，样品为葡萄糖水溶液或者是在40％红细胞比容的全血中的葡萄糖样品。水溶液样品中葡萄糖的浓度为0，50，100，250和500mg/dL。全血样品中的葡萄糖浓度换算成血浆值为0，50，100，200，400和600mg/dL。
在680nm处的反射率采用实施例1中所描述的仪器在30-秒端点检测，检测值采用如上所述方式线性化。结果如图3所示。可以看到对于相应的水溶液和全血样品所得到的结果，产生的线形曲线具有基本上相同的斜率和截距，这说明采用本发明的检测条所获得的反射率值不依赖于全血样品中的红细胞比容。
实施例3检测条采用Pall公司Presense牌的0.8微米孔径聚醚砜多孔膜材料制备。所用的试剂组合物如表1所示。试剂组合物在多孔膜反应面上的施加方式是通过剥离(stripping)而不是浸渍。随后，检测条通过Arcare7843压力敏感粘合剂而固定上透明的聚酯窗口，检测条带有成薄片状并与试剂的条带层合，如同上述实施例1中所述。检测条通过使反应面朝下而定向。500纳升掺有葡萄糖的全血检测样品随后被施加至每个检测条粗糙的样品面上。
葡萄糖全血样品使用Yellow Springs公司的检测器测定为血浆葡萄糖值为0，50，100，200，400和600mg/dL。在每个样品检测条上每个样品溶液重复检测两次。
每个检测条的反射率采用实施例1中所述的具有直径大约为0.030英寸的小阅读面积反射率读取探头的仪器在680nm处进行检测。所检测的反射率值R通过公式K/S＝(1-R)2/2R而转化成K/S线性曲线。反射率的检测在10，20，30和40秒进行。结果如图4所示。可以看到所检测到的反射率与全血样品中葡萄糖的剂量成正比并且在整个葡萄糖浓度范围可以获得迅速而稳定的端点，这说明剥离可以产生根据本发明的有效的检测条。
实施例4本实施例说明在US5520786中所报道的在光基PQQ-GDH还原体系中的介质的可用性。制备如下试剂表2

将大约为1微升的等份试剂组合物放置到预先切割好的由0.8微米厚的Presence牌聚醚砜膜以及0.2和5.0微米厚的Supor牌聚醚砜膜构成的检测条上。在室温下空气干燥后，加入500nL等份的0，50，200mg/dL的葡萄糖水溶液样品。颜色发生改变，同样地可以观察到颜色的均匀性和颜色改变的速度。可以观察到对于葡萄糖样品的可见的剂量响应。含有0.1％Silwet L-7600表面活性剂的类似配方并且最终配方的pH为近似7.0的等份样品也被放置在微升试管中(即，小体积，50微米路径长度)，并且可以观察到加入0至500mg/dL全血葡萄糖的剂量响应。可以观察到大约25-5％反射率的范围。这些结果说明3-(3，5-二羧基苯基亚氨基)-3H-吩噻嗪对于PQQ-GDH法测定水溶液和全血样品中的葡萄糖来说是有效的介质。
实施例5本实施例说明在本发明上下文中的NAD依赖型体系中采用例如那些在US5126275和US5322680中所公开的四唑盐类指示剂的可行性。除了以40mM的2-(4-二氟甲基-5-氯噻唑-2-基)-3-[2-(3-三甲基氨丙氧基)苯基]-5-(3，4-亚甲二氧基苯基)四唑二甲基硫酸盐四唑盐指示剂取代了WST-4四唑盐之外，试剂按实施例1表1所描述的来制备。试剂组合物被用来涂覆0.8微米Presense牌聚醚砜膜的光滑面并随后装配至毛细管填充形式中。对0至600mg/dL全血葡萄糖的剂量响应被大约30至10％反射率来体现。
可以意识到的是这里所公开的方法和检测条在葡萄糖测定系统中比先有技术具有明显的优势。这些先有葡萄糖测定系统一般都要求采用两个不同的波长对样品进行光学读取以便于修正样品中红细胞(红细胞比容)所带来的干扰。本检测条提供的结果不依赖于膜的孔径尺寸，而且基本上不依赖于样品中的红细胞比容。由于本系统基本上不依赖于红细胞比容，就不需要用两个不同的波长检测反射率，也无需采用修正系数。这就意味着采用本发明的系统的光学检测装置可以比先有系统更加简单并且更加廉价，因为它只需要一套光学系统而不是两套。本发明的系统也不需要复杂的算法来调节红细胞比容或层析。本发明也不需要先有系统中的用来调节反射表面不透明性的散射核。同样地，由于样品不需要进行任何预步骤来分离红细胞，因此可以采用更小体积的样品，典型的为大约1微升或更小。上面对本发明进行了描述和举例说明。本领域技术人应该认识到本发明在不超出本发明的精神和保护范围的情况下可以有其它的修改和变化。
权利要求
1.一种测定全血样品中葡萄糖浓度的方法，该方法包括(a)提供具有一个样品面和一个反应面的检测条，该检测条适合于在样品面上接受样品并将它输送至反应面，所述的检测条载有检测试剂，所述的检测试剂包含能改变颜色来指示样品中葡萄糖存在的颜色指示剂系统，所述的检测条还至少在反应面上带有一种聚合物，所述聚合物提高检测条反应面的不透明性，(b)将血液样品施加至检测条的样品面，以及，(c)测定检测面的颜色变化从而确定血液中葡萄糖的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述的聚合物选自丙烯酸胶乳聚合物、聚苯乙烯硫酸钠聚合物和它们的组合。
3.权利要求1的方法，其中所述的多孔膜是由选自聚醚砜和改性聚醚砜的材料制成的。
4.权利要求1的方法，其中检测试剂包括选自PQQ-GDH体系、NAD依赖型GDH体系、己糖激酶还原体系以及葡萄糖氧化酶氧化体系的化学体系。
5.权利要求1的方法，其中指示剂系统选自四唑化合物和四唑盐化合物。
6.权利要求5的方法，其中指示剂系统包含2-噻唑基四唑盐化合物。
7.权利要求1的方法，其中试剂包含的介质化合物选自取代或非取代的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪和3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪。
8.权利要求1的方法，其中所述检测条中的微孔孔径范围是大约0.2至5.0微米。
9.权利要求8的方法，其中所述检测条是各向同性的。
10.权利要求8的方法，其中所述检测条是各向异性的。
11.一种用于检测包含红细胞的全血样品中葡萄糖浓度的检测条，包括(a)具有一个样品面和一个反应面的多孔膜，该膜适合于在样品面上接受样品并将它输送至反应面，(b)由膜负载着的检测试剂，所述检测试剂包含能改变颜色来指示样品中葡萄糖存在的颜色指示剂系统，以及(c)至少在膜的反应面上的一种聚合物，所述聚合物提高膜的反应面的不透明性。
12.权利要求11的检测条，其中所述聚合物选自丙烯酸胶乳聚合物、聚苯乙烯硫酸钠聚合物、及其组合。
13.权利要求11的检测条，其中所述多孔膜是由选自聚醚砜和改性聚醚砜的材料制成。
14.权利要求1 1的检测条，其中检测试剂包含选自PQQ-GDH体系，NAD依赖型GDH体系，已糖激酶还原体系以及葡萄糖氧化酶氧化体系的化学体系。
15.权利要求11的检测条，其中指示剂系统选自四唑化合物和四唑盐化合物。
16.权利要求15的检测条，其中指示剂系统包含2-噻唑基四唑盐化合物。
17.权利要求11的检测条，其中试剂包含的介质化合物选自取代或非取代的3-苯基亚氨基-3H-吩噻嗪和3-苯基亚氨基-3H-吩噁嗪。
18.权利要求11的检测条，其中所述检测条中的微孔孔径范围是大约0.2至5.0微米。
19.权利要求18的检测条，其中所述检测条是各向同性的。
20.权利要求18的检测条，其中所述检测条是各向异性的。
全文摘要
用于检测全血中葡萄糖浓度的试剂检测条，它至少在一面上具有能提高其不透明度的聚合物，从而降低了红细胞比容对葡萄糖测定的影响。
文档编号A61B5/00GK1527045SQ200410033020
公开日2004年9月8日 申请日期2004年2月3日 优先权日2003年2月4日
发明者K·L·马福尔特, K L 马福尔特 申请人:拜尔健康护理有限责任公司