专利名称：葡萄糖生物传感器和方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测生物流体如血液中葡萄糖的生物传感器，特别涉及一种用于检测生物流体葡萄糖的电流式生物传感器，更特别的涉及一种高精度的用于检测生物流体中葡萄糖的电流式生物传感器。
背景技术：
众所周知，糖尿病是一种主要的健康问题。根据一般规律，美国糖尿病协会(ADA)建议I型(胰岛素依赖)的多数患者每天进行三次或更多次的糖尿病葡萄糖测试。胰岛素能控制血液中葡萄糖或糖的利用，并且防止高血糖，而血糖过高能导致酮症。但是不合适的胰岛素治疗可能导致低血糖，而低血糖可能导致昏迷甚至致命。
糖尿病患者的长期高血糖症可能导致心脏病、动脉硬化、失明、卒中、高血压和肾衰竭等疾病。胰岛素的注射量与血糖水平相关。因此，准确测定血糖含量对于糖尿病合理治疗来说至关重要。II型糖尿病病人(非胰岛素依赖)也能通过准确监测血糖水平而受益，这些可以通过饮食和锻炼进行控制。
70年代末期，自从家用葡萄糖小条(glucose strips)和手提式检测装置或仪器的推广后，糖尿病治疗大大改进。然而，先前葡萄糖测量系统固有的测试结果精度不高的缺陷，有时可能导致糖尿病的不当治疗。其中不精确的测试结果的一个主要原因与葡萄糖小条采用的化学试剂有关。市售的多数葡萄糖小条是基于使用一种介质和葡糖氧化酶(GOD)或吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)依赖的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)的生物传感器。
相对于非介质型的生物传感器(涉及过氧化氢测量法)，这种基于介质/GOD的生物传感器扩大了葡萄糖线性响应的范围。然而与氧气相关的缺点仍然存在。介质在与酶穿梭电子方面不如氧分子有效。事实上，所有样品溶液中的氧气比酶位的介质更有效。随着液体样品中氧气分压的增加，采用基于介质/GOD的生物传感器的测量法得到的结果显著降低。多个研究小组研究了由于氧气浓度的变化而导致的测试结果不精确的问题(T.Y.Chun，M.Hirose，T.Sawa，M.Harada，T.Hosokawa，Y.Tanaka and M.Miyazaki，Anesth Analg.，75，993-7，1994；J.H.Lee，H.Vu，G.J Kost，Clinical Chemistry，42，S163，1996；K.Kurahashi，H.Maryta，Y.Usuda and M.Ohtsuka，Crit.Care Med.，25，231-235，1997；Z.Tang，R.F.Louie，M.Payes，K.Chang and G.J.Kost，Diabetes Technology &Therapeutics，2，349-362，2000)，在使用葡萄糖小条为危急病人或者血液中氧分压水平不可预知的病人进行床旁(point-of-care)葡萄糖测试，应特别小心。
另外，生物样品中氧气水平变化范围比较宽。一个静脉血样的典型的氧气分压约为32±7mmHg。在某些情况下，它可以低至20mmHg。就动脉血样而言，人们可能期望更高的氧气水平。对于一个正在接受氧气疗法的患者，动脉氧分压水平可能高至700mmHg。因此，由于氧气浓度的不同，基于介质/GOD的生物传感器不能给出一个精确的测试结果。当血糖浓度处于一个低水平时(如葡萄糖含量少于70mg/dL)，这种问题将变得更加严重。
为了消除氧浓度改变对结果产生的干扰或者说是与使用葡萄糖氧化酶有关所谓的“氧气影响”，最近葡萄糖脱氢酶(GDH)被用来替代氧敏感的葡萄糖氧化酶。葡萄糖脱氢酶，它的辅酶是吡咯喹啉醌(PQQ)，与氧气互不影响。因此，葡萄糖传感器的结果不会受样品中氧浓度变化的影响。一些使用这种酶的产品已经被开发并投放了市场，例如，Accu-ChekTM Comfort Roche Diagnostics，IN，USA， TheraSense，Alameda，CA，USA and Bayer Health Care，Mishawaka，IN，USA.
葡萄糖脱氢酶的使用克服了氧气影响的问题。然而，葡萄糖脱氢酶选择性不如葡萄糖氧化酶那么好。它不仅与葡萄糖起反应，而且还与其它糖如半乳糖和麦芽糖起反应。半乳糖和麦芽糖与葡萄糖具有相似的结构。麦芽糖由二个葡萄糖单位组成，半乳糖与葡萄糖在结构上的不同仅在于碳4上羟基位置不同。严重的干涉可以被期望。实际上，GDH基的生物传感器对麦芽糖更敏感并且不能将葡萄糖和半乳糖辨别开(J.D.Newman，C.A.Ramsden，N.D.H.Balazs，Clinical Chemistry，48，2071，2002)。
如果测试小条使用葡萄糖脱氢酶吡咯喹啉醌作为酶的方式，那么从病人身上可能得到一个虚假的较高的葡萄糖读数。为此。在2003年4月18日药物管理局(FDA)提醒医疗保障及医疗补助服务中心和终末期肾脏疾病(ESRD)网络，注意对腹膜透析病人的以含艾考糊精(Icodextrin)的腹膜透析液Extraneal测试而得的葡萄糖读数及因麦芽糖的影响而得的虚假的被提高了的葡萄糖读数的影响。虚假的高血糖读数可能导致病人胰岛素实际注射量比其需求量更多。这样一来，患者的血糖可能降低至不必要的水平，并能导致严重的反应，如失去知觉。
因此，需要找到一种能提供更加精确的血糖读数的葡萄糖测量系统；还需要这种葡萄糖测量系统能减少因流动样品中氧分压改变而造成的不精确结果，提供一种更为精确的血糖读数；更进一步，需要这种葡萄糖测试系统能通过减少因其它糖类而造成的不精确结果，提供一种更为精确的血糖读数；更进一步，需要一种能提供更精确血糖读数的一次性葡萄糖传感器。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能提供葡萄糖糖读数的葡萄糖传感器系统，它减小了流动样品中溶解的氧及麦芽糖和半乳糖对葡萄糖读数的干扰。本发明的另一个目的是提供一种一次性葡萄糖传感器，它能被用于在手指或其它可选择的部位如膀臂、前臂、拇指和大腿的根部的毛细血管血液测试。本发明的另一个目的是提供一种用于静脉血测试和动脉及静脉血测试的葡萄糖传感器。本发明的另一个目的是提供一种仅需少量血样仍能得到精确结果的一次性葡萄糖传感器。
为了达到这些和其它目的，本发明组合二个葡萄糖电极，每一个电极组合了一种不同的用于测量葡萄糖的酶，并选择合适的确定流动样品中葡萄糖含量的电极响应。这两种酶是葡糖氧化酶(GOD)和醌蛋白葡萄糖脱氢酶(GDH)，更具体的是PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)。两个葡萄糖(即工作态)电极对葡萄糖浓度的响应在整个范围呈线性关系。如果样品中氧气分压较低，GOD基工作电极将提供一个较高的响应值，而GDH基工作电极提供一个精确的结果。因此，更优选的响应值应该是由GDH基工作电极得到。在样品中包含麦芽糖或半乳糖的情况下，GDH基工作电极将显示更高的响应值，而GOD工作电极提供一个精确的结果。更优选的响应值来源于GOD工作电极。在葡萄糖电极读数被自动地反馈给预编程序的仪表后选择过程自动完成。
本发明的葡萄糖传感器结合了数项在先发明包含的具体实施例，但不被它们所限制，4层结构和3层结构在美国专利6,767,441、美国专利6,287,451、美国专利6,258,229、美国专利6,837,976和美国专利6,942,770中公开过，在这里均作为参考文献。
在本发明的第一个实施方案中，葡萄糖传感器采用4层碾压结构。
在第一实施方案的一个方面，葡萄糖传感器具有一个板状瘦长本体，它包含一个形成充分平坦的样品室的样品流动通道，连接着板层本体一端的开口和位于另一端的排气孔之间。在流动通道内放着至少两个工作电极和一个参比/计算电极。二个或更多工作电极和参比电极之间的排列对于从传感器得到结果的目的来说不重要。工作电极和参比电极通过彼此分离的导电线路进行电连接。彼此隔离的导电线路在板层本体上与样品入口端的对立端终止且为与数据读取设备建立电连接而暴露出来。
在第一个实施方案的另一方面，板层本体包含一种由塑料材料做成的基质层。在基质层上刻有几个导电线路。导电线路可以通过丝网印刷、蒸镀，或者其它提供一个附于基质层之上的导电层的方式设置在绝缘层上。导电线路可以单独布置在绝缘层之上，也可以先在绝缘层上布置一导电层，然后在导电层上雕刻/刻划成所需数量的导电线路。导电线路的雕刻过程可以通过化学方法完成，也可以采用在导电层上机械上划线方式刻划，或是采用激光将导电层光刻成隔离的导电道路，或采用可以引起彼此隔离的导电线路之间或其中的开裂的任何方式。采用的导电性涂层或层可以是铜、金、氧化锡/金、钯、其它贵金属或其氧化物，或碳薄膜组分。更优选的导电涂层是金薄膜或者氧化锡/金薄膜组分。
在本发明的第一个实施方案更进一步的方面，在基质层和导电线路顶部，板层本体包含一个第一个中间绝缘层，也称试剂容纳或电极区域确定层。试剂容纳层，包含至少两个为两个或者更多的工作电极及一个参比电极准备的开口。每个开口对应和暴露了单条导电线路的一小部分。为工作电极准备的开口大小完全相同。为参比电极准备的开口大小可以与为工作电极准备的开口相同，也可以不同。所有这些开口的设置是为了它们在如上所述的样品流动通道内的位置确定。试剂容纳层也是由绝缘的绝缘体材料加工成的，优选为塑料，它可以通过用冲模机械切割或者用激光切割然后被固定于基质层上。一种胶粘剂，如压敏胶，可以被用来将第一中间绝缘层牢固地粘接在基质层上。也可以通过超声压焊将试剂容纳层粘接在基质层上。试剂容纳层也可以通过经丝网印刷一种绝缘材料或者嫁接一种光感树脂在基质层上而制得。
在第一实施方案的另一方面，在试剂容纳层顶部，板层本体还具有第二绝缘层，也称通道形成层。通道形成层也由塑料绝缘材料加工而成，并且形成了板层本体的样品通道。它在覆盖了试剂容纳层上开口的那一端具有一个U形开口，试剂容纳层的开口端与如上描述的板层本体样品入口相连。一种双涂层的压敏胶带可以被用作通道形成层。
仍然在第一实施方案的另一方面，本发明的板层本体具有一个开有一个排气孔和一个入口凹槽的覆盖层。设置这个排气孔，以便至少排气孔的一部分覆盖了通道形成层U型缺口的根部。当样品流体进入样品入口或者板层本体入口时排气孔允许样品流体通道内的空气排出。凹槽位于样品入口端。样品流体一般通过毛细管作用填装到样品室。在容量很小时，毛细管作用的程度取决于与流体发生毛细管作用的表面的疏水或亲水性。通过使用由一种亲水性的绝缘材料形成覆盖层或者在板层本体的开口端与排气孔之间的朝向样品室的那个覆盖层上，采用亲水性物质涂覆亲水性材料一面上的至少一部分。应该明白，覆盖层的整个一面先涂覆亲水性物质，然后粘接到通道形成层上。
仍然在第一实施方案的另一方面，一个孔装填了用于装载有GOD、介质和其它组分的第一工作电极(W1)的电极材料，一个孔装填了用于装载有PQQ-GDH、介质和其它组分的第二工作电极(W2)的电极材料，以及一个孔装填了用于参比电极(R)的电极材料。工作电极与参比电极在通道中的位置排列方式对于从电化学的传感器得到有价值的结果来说并不是关键。电极在样品流体通道内可能的排列顺序是W1-W2-R，W1-R-W2，R-W1-W2，W2-W1-R，W2-R-W1或R-W2-W1，电极的排列顺序列于板层本体的样品入口到排气孔之间。优选的排列顺序被发现是W1-W2-R；即，样品流体进入板层本体的开口端后，流体将首先覆盖W1，然后W2，然后R。优选的位置消除了由于样品流动性大小不足而导致的稳定性及精确性问题。工作电极和参比电极均各自与隔离的导电线路进行电接触。隔离的导电线路因在板层本体样品入口相对的另一端设置一个的与数据读取设备的电接触而终止、暴露出来。
仍然在第一实施方案的另一方面，工作电极装载有至少一种氧化还原介质和一种酶(GOD或PQQ-GDH)的混合物，也可以有一种或多种表面活性剂，聚合物粘合剂和缓冲剂。参比电极可以装载与工作电极同样的混合物。应该指出的是，参比电极孔中能装载一种氧化还原介质(还原态或氧化态或混合态)，有或者没有至少一种表面活性剂，一种聚合物粘合剂和一种缓冲剂。作为选择，参比电极孔中也可以装载一个Ag/AgCl层(即通过应用Ag/AgCl墨水或喷涂Ag/AgCl层)或其它参比电极材料。
本发明的第二个实施方案，葡萄糖传感器与第一个实施方案具有类似的结构，但它还有一个空白电极，这个空白电极装载一种介质和其它成分，但是没有装载葡萄糖敏感酶。这样的四电极系统不仅拥有第一实施方案的特点，而且还具有消除样品中可氧化物质的干涉的能力，可氧化物质例如维生素C、醋胺酚和尿酸等。
在第二实施方案的一个方面，在基质层有至少四条道路被描述。试剂容纳层包含为三个工作电极和一个参比电极设置的四个孔。
在第二实施方案的一个方面，一个孔装填了用于装载有GOD，一种介质和其它缺乏物的第一工作电极(W1)的电极材料，一个孔装填了用于装载有PQQ-GDH，一种介质和其它缺乏物的第二工作电极(W2)的电极材料，一个孔装填了用于装载有一种介质和其它缺乏物的空白电极(B)的电极材料和一个孔装填了用于参比电极(R)的电极材料。工作电极、空白电极与参比电极在通道中的位置排列方式对于从电化学的传感器得到有价值的结果来说并不是关键。优选的排列顺序被发现是W1-W2-R-B，即，样品流体进入板层本体的开口端后，流体将首先覆盖W1，然后W2，然后R，然后B。
在本发明另一个实施方案中，葡萄糖传感器与第一个实施方案具有类似的结构，但是没有采用试剂容纳层，其余三层与实施方案一中的相同。这种结构的细节在US6,258,229中揭示过。在传感器末端(样品入口端)设置了这个U形通道保险装置。U形通道的长度、厚度和宽度决定了毛细管通道的尺寸或容量。U形通道保险装置在导电层基部延伸的长度和宽度限定了工作电极、参比电极和样品室的面积大小，但是正如上面揭示的，可以具有一个可供选择的化学制品的结构。
在前述施方案的一个方面，工作电极(W1和W2)装载有至少一种酶(GOD或PQQ-GDH)，一种氧化还原介质，一种聚合物粘合剂、一种表面活化剂和一种缓冲剂。参比电极(R)最好被与其中一个工作电极相同的试剂混合物覆盖。
在本发明的第四个实施方案中，葡萄糖传感器基于丝网印刷技术。将导电墨水(即用于工作电极的碳墨水；用于参比电极的Ag/AgCl墨水)印在基质层上，烘干后作为电极。采用一个U形垫片和如前所述的覆盖层加工得到毛细管通道。U形通道保险装置位于传感器末端(样品入口末端)。渠道保险开关设置在传感器末端。U形通道的长度、厚度和宽度决定了毛细管通道的尺寸或容量。
在第四个实施方案的一个方面，工作电极(W1和W2)装载有至少一种酶(GOD或PQQ-GDH)，一种氧化还原介质，一种聚合物粘合剂、一种表面活化剂和一种缓冲剂。参比电极(R)可以或者不被与其中一个工作电极相同的试剂混合物覆盖。
在第四个实施方案的另一个方面，酶、氧化还原介质及其它成份可以与墨水混合，并通过丝网印刷印在基质绝缘层之上。
在本发明的第五个实施方案中，在同一个葡萄糖传感器的小条上有二个通道(通道1和通道2)；每一个通道与上面提及的实施方案中的结构相似。通道1和通道2并排设置或这一前一后设置。二个通道的样品入口彼此不相通；或者这二个通道仅共用同一个样品入口。
在第五个实施方案的一个方面，通道1具有至少一个工作电极和一个参比电极。至少一个的工作电极装载有GOD，介质和其它成份。通道1作为一个葡萄糖传感器独立运行。
在第五个实施方案的另一个方面，通道2具有至少一个工作电极和一个参比电极。至少一个的工作电极装载有PQQ-GDH，介质和其它成份。通道2作为另一个葡萄糖传感器独立运行。
仍然在本发明的另一个实施方案中，一次性小条具有一个传感器本体，该传感器本体具有一个形成测试室的开孔，在测试室内的至少二个工作电极和一个参比电极，和将这至少两个的工作电极和参比电极电连接到仪表设备的电插头。测试室包含至少二种试剂，其中的一种试剂在至少两个工作电极上都装载了，其中一种试剂含有GOD，另一种含有GDH。这种仪表设备必须能提供通过工作电极和参比电极的偏置电压，能检测到因进入一次性小条的开孔中的流动样品存在葡萄糖而产生的电流。
本发明所有的优点将在详细描述、附图和权利要求中更清晰的叙述。
图1显示了测试小条的一个本发明实施方案的透视图。
图2为图1实施例的分解图，显示了测试小条的四个构成层。
图3显示了测试小条的另一个本发明实施方案的透视图。
图4为图3实施例的分解图，显示了测试小条的三个构成层。
图5为本发明另一个实施方案的透视图，显示了四层结构的GOD基传感器小条和一个四层结构的GDH基传感器小条的组合。
图6是在图5中显示的由GOD基传感器小条和GDH基传感器小条构成的复合层的排列的实施方案的分解图。
图7是显示了组合了一个三层结构的GOD基传感器小条和一个三层结构的GDH基传感器小条的本发明实施方案的透视图。
图8是在图7中显示的由GOD基传感器小条和GDH基传感器小条构成的复合层的排列顺序的实施方案的分解图。
图9是显示了组合了一个四层结构的GOD基传感器小条和一个四层结构的GDH基传感器小条，而基质层作为二者共有的传感器的本发明实施方案的透视图。
图10是在图9中显示的由GOD基传感器和GDH基传感器构成的复合层的排列的实施方案的分解图。
图11是显示了组合了一个三层结构的GOD基感应器传感器小条和一个三层结构的GDH基感应器小条，而基质层作为二者共有的传感器的本发明实施方案的透视图。
图12是在图9中显示的由GOD基感应器和GDH基传感器构成的复合层的排列的实施方案的分解图。
图13是显示了具有两个工作电极和一个空白电极的四层结构的组合传感器小条的本发明另一实施方案的透视图，其中所述三个电极名为GOD基电极、GDH基电极和干扰-补偿电极。
图14是在图13中显示的包括一个GOD基电极、一个GDH基电极和一个参比电极的复合层的排列顺序的实施方案的分解图。
图15是显示了具有一个GOD基传感器系统和紧挨着的一个GDH基电极的四层结构的组合传感器小条的本发明实施方案的透视图。
图16是在图15中显示的包括一个GOD基电极系统和一个GDH基电极系统的复合层的排列的实施方案的分解图。
图17是显示了具有一个GOD基传感器系统和紧挨着的一个GDH基电极的三层结构的组合传感器小条的本发明实施方案的透视图。
图18是在图17中显示的包括一个GOD基电极系统和一个GDH基电极系统的组合层的排列的实施方案的分解图。
图19说明本发明另一个实施方案的透视图。
图20和21说明了在不同氧气水平下GOD基电极的电流响应值之间的相关性。
图22和23说明了在不同氧气水平下GDH基电极的电流响应值之间的相关性。
图24说明了在氧气水平为90mmHg的样品中由GOD基电极确定的葡萄糖浓度与由参比仪器测得的葡萄糖浓度之间的相关性。
图25说明了在氧气水平为90mmHg的样品中由GOD基电极确定的葡萄糖浓度与由参比仪器测得的葡萄糖浓度之间的相关性。
具体实施例方式
本发明优选的实施方案如图1-25。本发明的葡萄糖传感器可以采用四层结构(图1)也可以采用三层结构(图3)。四层结构具有与三层结构相同的三层和一个在基质层/底层与通道形成层之间附加的试剂容纳层。
现在转到图1，葡萄糖小条10有一个板层本体12，一个流体取样端14，一个电插头端16和排气孔52。流体取样端14包括一个位于样品进口和排气孔52之间的样品室。电接触端16具有三个分离的导电接头16a、16b和16c。
现在转到图2，板层本体12由一个基质层20，一个试剂容纳层30，一个通道形成层40和一个覆盖层50组成。板层本体12各层都是由电绝缘材料做成的，优选的是塑料。作为举例，优选的的电绝缘材料是聚氯乙烯，聚碳酸酯，聚砜，尼龙，聚氨酯，硝酸纤维，丙酸纤维，醋酸纤维，醋酸-丁酸纤维，聚酯，聚酰亚胺，聚丙烯，聚乙烯和聚苯乙烯。
基质层20具有一个导电层21，导电层21上有三条导电线路22，24和26。导电线路22，24，26可以通过在导电层21上雕刻或刻划者通过丝网印刷把线路22，24和26印到导电层21上而形成。对导电层21的雕刻或刻划可以是对导电层21进行充分的机械雕刻，以制造这三个彼此独立的导电线路22，24和26。本发明优选的雕刻或刻划方式是采用二氧化碳激光、YAG激光或准分子激光。导电层21可以采用任何电导材料做成，例如金子、氧化锡/金子、钯或其它贵金属及其氧化物，或者碳薄膜组分。优选的电导材料是金子或氧化锡/金子。基质层20可用的材料是镀氧化锡/金子的聚酯薄片(Cat.No.FM-1)或镀金子的聚酯薄片(Cat.No.FM-2)，这种材料在Courtaulds Performance Films，Canoga Park，Calif有售。
在采用试剂容纳层30(4层结构)的实施方案中，试剂容纳层30具有三个试剂容纳开口32，34和36。试剂容纳开口32暴露了导电线路22的一部分，试剂容纳开口34暴露了导电线路24的一部分，试剂容纳开口36暴露了导电线路26的一部分，形成了试剂容纳孔。试剂容纳层30由塑料材料做成，优选的是Inc.，ofGlen Rock，PA公司在进行胶粘剂研究时得到的一种医用等级的单面胶带。在本发明中使用，该胶带可接受的厚度在0.001英寸(0.025毫米)到0.005英寸(0.13毫米)之间。有这样一种胶带，名为 (大约0.0025英寸(0.063毫米))，因为它操作简易，与在耐足够数量的化学试剂的能力及促进通过传感器样品室的毛细管作用的能力相关的性能优良，而更为优选。应该明白的是，胶带的使用不是必需的。溶剂容纳层330可以通过塑料片做成，并可以涂覆压敏胶、感光性树脂，采用超声波粘合到基质层20上，或者采用丝网印刷法粘合到基质层20上已达到与使用上述的聚酯带同样的结果。
三个试剂容纳开口32，34，36决定了各自的电极区域W1、W2和R，并且容纳化学试剂而形成两个工作电极(一个GOD基葡萄糖电极和一个GDH基葡萄糖电极)和一个参比电极。通常，电极区域装载有试剂混合物。工作电极区域32，34，36装载的试剂混合物为酶和带有可选的聚合物，表面活化剂和缓冲剂的氧化还原介质的混合物。在电极区域R装载的参比试剂混合物与工作电极装载的试剂混合物相似。
典型地，电极区域R必须装载一种氧化还原试剂或者介质，以使参比电极在使用优选的传导涂覆材料时运行。参比试剂混合物优选的包含氧化态的氧化还原介质或者氧化态和还原态混合的氧化还原介质，至少一种粘合剂，一种表面活化剂和一种抗氧化剂(如果使用氧化还原介质的一种还原态)和一种填充剂。可选的，参比电极(电极区域R)可以装载Ag/AgCl层(即运用Ag/AgCl墨水或喷涂一层Ag或Ag/AgCl的层)或其它不需要氧化还原介质而正常运行的参比电极材料。
试剂容纳开口的尺寸最好尽可能小，以便使葡萄糖传感器的样品室尽可能短，而仍能容纳足量的化学试剂以运行正常。优选的试剂容纳开口的形状是圆形，优选的直径为大约0.03英寸(0.76毫米)。三个试剂容纳开口32，34，36并排排列且彼此之间的间隔为大约0.025英寸(0.625毫米)。圆形的试剂容纳开口仅仅是为例证目的，应该明白试剂容纳开口的形状是没有严格要求的。
工作电极与参比电极在通道内的位置排列是对于从葡萄糖传感器得到有用的结果来说是不严格的。在样品流动室内可能的电极排列方式可以是W1-W2-R，W1-R-W2，R-W1-W2，W2-W1-R，W2-R-W1或R-W2-W1，被列作电极的排列会出现在板层本体12的样品入口18到排气孔52之间。优选的位置排列被发现是W1-W2-R； 即流动样品进入板层本体12的取样端14，然后流动样品将首先覆盖W1，然后是W2，然后是R。这样一种排列对于当样品量不足或者部分不足时取得有用的结果是有益的。
工作电极和参比电极都与彼此隔离的导电线路进行电接触。为与位于板层本体12的样品进口18的相反端的数据读取设备产生一个电连接，彼此隔离的导电线路终止且暴露出来。
在采用试剂容纳层30(4层结构)的实施方案中，通道形成层40具有一个位于流体取样端14的U形保险装置42。保险装置42的长度满足当通道形成层40被碾压到试剂容纳层上时，电极区域W和R在由保险装置42确定的空间内。U形保险装置42的长度、宽度和厚度确定了毛细管通道的容积。通道形成层40的厚度能影响样品流体流进被具有样品流体毛细管作用的流动样品室的速度。通道形成层40由塑料材料做成，优选的是Inc.，ofGlen Rock，PA公司在进行胶粘剂研究时得到的一种医用等级的双面胶胶带。本发明中使用的胶带可以接受的厚度为大约0.001英寸(0.025毫米)到大约0.010寸(0.25毫米)之间。一种这样的胶带是Arcareo7840(大约0.0035英寸(0.089毫米))。U形保险装置42可以通过激光或模切制的。更优选的U形保险装置的尺寸为大约0.05英寸宽(1.27毫米)和大约0.0035英寸厚(0.089毫米)。长度是取决于在层2上开口的数量。
被碾压在通道形成层40上的覆盖层50，具有与葡萄糖传感器10的流体取样端14隔离开了的排气孔，以确保在样品室17中流动样品将完全覆盖电极区域W1，W2和R。排气孔52设置在覆盖层50上，以便它与U形保险装置42大致排成一行。优选地，排气孔52将会暴露U形保险装置42的一部分并且部分覆盖了U形保险装置42的根部。排气孔优选的形状是尺寸为大约0.08英寸(2毫米)×大约0.035英寸(0.9毫米)的长方形。优选的，在流体取样端14处，顶层也具有一个凹槽54，以促进流动样品载入样品室17。其优选的形状为半圆形，大约位于通道入口的中间。优选的半径大小为0.028英寸(0.71毫米)。覆盖层50采用的材料优选为聚酯薄片。为了促进毛细管作用，期望聚酯薄片具有面向毛细管通道的高亲水性表面。3M的透明薄片(Cat.No.PP2200或PP2500)是用作本发明中覆盖层的优选材料。
图3说明了一个3层结构的实施方案，与4层结构的实施方案一样，葡萄糖传感器10具有一个板层本体12，一个流体取样端14，一个电接触端16和一个排气孔52。流体取样端14在样品入口18和排气孔52之间包括一个样品室17。电接触端16具有三个彼此隔离的导电接头16a，16b和16c。
由图4可知，板层本体12由一个基质层20，一个通道形成层40和一个覆盖层50组成。如前面所注解的，板层本体12各层均由绝缘材料做成，优选为塑料。与4层结构的实施方案不同，在三层结构的实施方案中没有隔离的试剂容纳层。通道形成层40也描述了这样的区域，以工作电极和参比电极上三种独特的滴剂或小滴的方式，在这个区域内将预定数量的试剂混合物各自放置在导电线路上。
图5显示了一个GOD基葡萄糖传感器10和一个GDH基葡萄糖传感器300的组合体。GOD基葡萄糖传感器10和一个GDH基葡萄糖传感器300均由四层结构组成，两个传感器的基质层被碾压在一起形成一个完整的葡萄糖传感器组合体。每个传感器包括一个板层本体12，312，流体取样端14，314，一个电接触端16，316和一个排气孔52，352(没有被显示)。流体取样端14，314在样品进口18，318和排气孔52，352之间包括各自的样品室(没有被显示)。
现在转到图6，每个传感器10，300具有一个基极层20，320，一个试剂容纳层30，330，一个通道形成层40，340和一个覆盖层50，350。试剂容纳层30，330各自包含试剂容纳开口32，34和332，334。通道形成层40，340各自包含U形保险装置42，342。典型的，用一种胶粘剂把传感器10和300粘结在一起。优选的，采用一个双面涂有胶粘剂的附加层(未示)以利于传感器10和传感器300的装配。
图7显示了一个GOD基葡萄糖传感器10’和一个GDH基葡萄糖传感器300’的另一个组合体实施方案。GOD基葡萄糖传感器10和一个GDH基葡萄糖传感器300均由三层结构组成，两个传感器的基质层被碾压在一起形成一个完整的葡萄糖传感器组合体。每个传感器包括一个板层本体12，312，流体取样端14，314，一个电接触端16，316和一个排气孔52，352(没有被显示)。流体取样端14，314在样品进口18，318和排气孔52，352之间包含各自的样品室(没有被显示)。
现在参阅图8，每个传感器10’，300’具有一个基质层20，320，一个试剂容纳层30，330，一个通道形成层40，340和一个覆盖层50，350。通道形成层40，340各自包含U形保险装置42，342。
图9图示了一个GOD基葡萄糖传感器和一个GDH基葡萄糖传感器的组合体200，这个组合体200具有一个7层结构的板层本体212。这个组合体包括一个GOD基葡萄糖传感器210和一个GDH基葡萄糖传感器210’。板层本体212包括一个流体取样端214，一个电接触末端216和排气孔252，252’(没被显示)。流体取样端14包括二个样品流动通道(没被显示)；一个位于样品进口218和排气孔252之间，另一个位于样品进口218’和排气孔252’之间(没被显示)。
图10显示了一个图9中实施方案板层本体212的分解图。板层本体212包括一个居中的具有导电涂层221，221’的基质层220，在基质层的两面上具有用于每个传感器的工作电极和参比电极的导电线路。居中的基质层220包括一个试剂容纳层230，230’，通道形成层240，240’和覆盖层250，250’。试剂容纳层230，230’分别包括试剂容纳开口232，234和232’，234’。通道形成层240，240’各自包含U形保险装置242，242’。
图11说明了一个GOD基葡萄糖传感器和GDH基葡萄糖传感器的组合体400，组合体400包含一个5层结构板层本体412。组合体400包括一个GOD基葡萄糖传感器410和一个GDH基葡萄糖传感器410’。板层本体412包括一个流体取样端414，一个电接触端416和排气孔452，452’(没被显示)。流体取样端414包括二个样品室(没被显示)；一个位于样品进口418和排气孔452之间，另一个位于样品进口418之间和排气孔452’之间(没被显示)。
图12显示了一个图11中实施方案板层本体412的分解图。板层本体412包括一个居中的具有导电涂层421，421’的基质层420，在基质层的两面上刻有用于每个传感器的工作电极和参比电极的导电线路。居中的基质层420包括通道形成层440，440’和覆盖层450，450’。通道形成层440，440’分别包含U形保险装置442，442’。
值得注意的是，在任何组合传感器系统中，进口凹槽可以被合并到基极层和试剂藏品里，以利于流动样品的一部分在GOD基的和GDH基的葡萄糖传感器的样品室中的装载。
图13也说明了本发明的另一种实施方案，显示了带有干扰物校正的GOD基和GDH基组合式葡萄糖传感器图13显示的GOD基和GDH基组合式葡萄糖传感器600包含一个板层本体612，一个流体取样端614，一个电接触端616和排气孔652。传感器600也可以一个可选的进口凹槽654。流体取样端614包括位于样品进口618和排气孔652之间的流动样品室617。
图14显示了一个图13中实施方案板层本体612的分解图。板层本体612包括一个基质层620，一个试剂容纳层630，一个具有一个U形保险装置642通道形成层640，和一个具有可选的进口凹槽654的覆盖层650。基质层620具有一个导电层626，在导电层626上至少具有四个导电线路622，624，626和628。试剂容纳层630至少具有四个试剂容纳开口632，634，636和638。试剂容纳开口632暴露了导电道路622的一部分试剂容纳开口634暴露了导电道路624的一部分试剂容纳开口636暴露了导电道路626的一部分，试剂容纳开口638暴露了导电道路628的一部分；所有的试剂容纳开口均各自形成电极孔。
这四个试剂容纳开口632，634，636和638分别确定了电极区域W1、W2、R和B，填充有形成一个第一工作电极，一个第二个工作电极，一个参比电极和一个空白电极的化学试剂。通常，电极区域W1装载有包含一种葡萄糖氧化酶和一种氧化还原介质(优选为氧化态的氧化还原介质)GOD基试剂。电极区域W2装载有包含一种PQQ-GDH和一种氧化还原介质(优选为氧化态的氧化还原介质的GDH基试剂。可以在电极区域B和电极区域R中装载一种与GOD基试剂混合物或GDH基试剂混合物类似但不含基于葡萄糖的酶的参比试剂基质。
典型地，电极区域R必须装载一种如氧化还原耦/氧化还原试剂的参比试剂。可选的，电极地区R可以装载Ag/AgCl层(即通过应用Ag/AgCl墨水或喷涂一层Ag或Ag/AgCl)或其它参比电极材料。电极地区B可以装载任何不含基于葡萄糖的酶的试剂混合物。
除了测量在电极区域B和参比电极之间的流动样品电阻以补偿血液血球密度的传感器读数之外，可氧化的干扰物如维生素C，尿酸和醋胺酚，命名了一些，(也能导致在电化学生物传感器输出中不精确读数的物质)，也可以被测量以补偿传感器显示的干扰物的读数。干扰物的影响可以通过把由W2(第二工作电极)和W1(第一工作电极)上的电流响应值分别减去在B(空白电极)上的电流响应，计算得到在血样中干扰物的浓度而被消除。这个通过维持从B到W2和B到W1的表面面积分率不变而得到。
现在转到图15，说明了本发明另一个实施方案，实施方案为一个GOD基的传感器系统和一个GDH基的传感器系统并行组合体的4层结构。图15显示一个GOD基和GDH基的组合式葡萄糖传感器700，其包含一个板层本体712，一个流体取样端714，电接触端716和排气孔752。传感器700也可以包括一个可选的入口凹槽754。流体取样端714包括位于样品进口718和排气孔752之间的第一样品室717a和第二样品室717b。应该说明的是，样品入口718可以是可选的彼此接近的两个进口(每个对应一个流体样品通道)，并且排气孔752也可以是对应着每一个流体样品通道的隔离的排气孔的组合。在叙述的实施方案中，样品室的一个结合了GOD基的传感器系统，另一个样品室结合了GDH基的传感器系统。
图16显示了一个图15中实施方案的板层本体712的分解图。本层本体712包括一个基质层720，一个试剂容纳层730，一个具有形成样品室717a的第一条分叉742a和形成样品室717b的第二条分叉742b的叉形保险装置742的通道形成层和具有可选的进凹槽754的覆盖层750。基质层720包含一个在其上刻有至少四条导电线路722，724，728和729的导电层721。导电层721也可以包括附加的导电线路726，727以提供给干扰物和/或血流比容计的补偿电极。
试剂容纳层730包含至少四个试剂容纳开口732，734，738和739。试剂容纳开口732暴露了导电线路722的一部分，试剂容纳开口734暴露了导电线路724的一部分，试剂容纳开口738暴露了导电线路728的一部分，试剂容纳开口739暴露了导电线路729的一部分；所有各自形成电极试剂孔。
为了包括干扰物和/或血流比容计补偿，试剂容纳层730将包括另外的将暴露其它导电线路一部分的试剂容纳开口，导电线路例如导电性道路726和727，作为举例。
图17说明本发明另一实施方案，说明了本发明另一个实施方案，实施方案为一个GOD基的传感器系统和一个GDH基的传感器系统并行组合体的3层结构。图17显示一个GOD基和GDH基的组合式葡萄糖传感器800，其包含一个板层本体812，一个流体取样端814，电接触端816和排气孔852。传感器800也可以包括一个可选的入口凹槽854。流体取样端814包括位于样品进口18和排气孔852之间的第一样品室817a和第二样品室817b。如前所述的4层结构的实施方案，应该说明的是，样品入口818可以是可选的彼此接近的两个进口(每个对应一个流体样品通道)，并且排气孔852也可以是对应着每一个流体样品通道的隔离的排气孔的组合。在说明的实施方案中，样品室中的一个结合了GOD基的传感器系统，另一个样品室结合了GDH基的传感器系统。
图18显示了一个图17中实施方案的板层本体812的分解图。本层本体812包括一个基质层820，一个具有形成样品通道817a的第一条分叉842a和形成样品通道817b的第二条分叉842b的叉形保险装置842的通道形成层840和具有可选的进凹槽854的覆盖层850。基质层820包含一个在其上被刻有了至少四条导电线路822，824，828和829的导电层821。导电层821也可以包括附加的导电线路826，827以提供附加的电极系统。
现在转到图19，说明了显示了一个基本的一次性葡萄糖传感器900的本发明另一个实施方案。一次性传感器900包括一个板层本体912，一个样品接受孔914和电接触端916。本层本体912包括一个基质层920和覆盖层950。，当覆盖层950与基质层920结合在一起时，它包含一个形成样品接收孔914的样品开口952。基质层920包含至少三条电子线路922，924和926，电子线路的第一部份暴露于用于连接仪表设备的导电连接端916，导电线路的第二部分被样品接收孔914暴露。
被样品接收孔914暴露的电子道路922，924和926形成了至少一个第一工作电极W1，一个第二工作电极W2和至少一个参比/计算电极R1。优选的，设置一个隔离物以隔离W1和W2。一种第一试剂混合物960包含至少葡萄糖氧化酶并被布置在第一工作电极W1上。一种第二试剂混合物962包含至少葡萄糖脱氢酶并被布置在第二工作电极W2。参比/计算电极R1可以包含任何早先揭示的参比电极材料。在本发明的发明实施中，样品接收孔914用作样品进口和接收一种流动样品如血液以确定葡萄糖的样品室。
应该明白的是，这里所揭示的任何发明方案中的导电线路可以由任何非腐蚀性的金属做成。碳积例如，作为举例，碳浆糊或碳墨水也可以被用作导电线路，所有的这些都是本领域内一般技术人员所了解的。
酶本发明的葡萄糖小条包括至少二种能氧化葡萄糖的葡萄糖敏感酶。一种是不能与其它糖如麦芽糖和半乳糖反应的葡萄糖氧化酶。第二种是氧气不敏感的葡萄糖脱氢酶。在本发明中，葡萄糖氧化酶被添加到试剂混合物1中(下面揭示的)，用于第一工作电极。在本发明中，PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)被添加到试剂混合物2中(下面揭示的)，用于第二个工作电极。
氧化还原介质本发明的葡萄糖传感器包含氧化还原介质。优选的氧化还原介质包括那些能使能选择性氧化葡萄糖的酶的还原态氧化的物质。期望介质的还原态能在工作电极上以所提供的电势条件下以电化学方式被氧化。进一步期望介质在基体中是稳定的。仍然期望介质能适当地产生参比作用。介质可以选自，但不限定于，各种金属络合物和有机氧化还原化合物。可接受的氧化还原介质的例子是铁氰酸钾(K3Fe(CN)6)，二茂铁(ferrocene)及其衍生物，10-(3-二甲氨基丙)吩嗪(promazine)，四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)，甲基蓝(methyl blue)，1，4-苯醌(1，4-benzoquinone)，1，4-二(二甲氨基)苯(1，4-bis(N，N-dimethylamino)benzene)，4，4’-dihydrobiphenyl。本发明中优选的介质是铁氰酸钾(K3Fe(CN)6)。铁氰酸钾在试剂混合物中的浓度优选为1％到15％(W/W)。
聚合物被用作可选胶粘剂的聚合物应该具有足够的耐水性、稳定性，应能将电极区域(工作电极，空白电极和参比电极)(参比电极是一个基于氧化还原介质的参比电极时)中试剂中的任何化学药品粘结导电表面层上。优选的，将两种聚合物添加到本发明的试剂混合物中。优选聚合物中的一种是聚氧化乙烯(PEO)。它的分子量范围是从数千到数百万。优选的，分子量大于1百万。更优选的，分子量是大约4百万。这样产品可以从Scientific Polymer Products，NY，USA(MW4,000,000，Cat No.344)购得。PEO在试剂混合物的重量含量优选为0.04％到2％(W/W)。第二种聚合物优选为甲基纤维素，它的商品名为Methocel 60 HG(Cat.No.64655，Fluka Chemicals，Milwaukee，WI，USA)。Methocel 60 HG在试剂混合物中的重量含量优选为0.05％到5％(W/W)。
表面活化剂表面活化剂必须使用，只不过是为了促进试剂混合物在工作电极、空白电极和参比电极开口处的分布，还有当样品进入样品室时迅速溶解干的化学试剂。选择适当数量和类型的表面活性剂，以确保先前提及的性能和避免对酶造成变质影响。表面活化剂可以选自，但不限制于，各种阴离子型，阳离子型，非离子型和两性离子型表面活性剂，如聚氧乙烯醚，非离子活性剂20，胆酸钠，氯化十六烷基吡啶，CHAPs。优选的表面活化剂是聚氧乙烯醚。更优选的是t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，其商品名为Triton X-100。Triton X-100在试剂混合物中的重量含量优选为0.01％到2％(W/W)。
缓冲剂随意地，一种缓冲剂可以与氧化还原介质一起存在于本发明的传感器小条干燥形态物中。提供的缓冲剂的量要足够，以便充分维持试剂混合物的PH值合适的缓冲剂的例子包括柠檬酸，磷酸盐，碳酸盐和类似物。在本发明中，20mM的柠檬酸盐缓冲剂PH值大约为6，被用于配制试剂混合物。
相应地试剂混合物1包含0.75％(W/W)的Methocel60 HG，0.4％(W/W)的聚氧化乙烯，0.4％(W/W)的Triton X-100，8％(W/W)的铁氰酸钾，1.5％(W/W)的葡萄糖糖氧化酶和20mM的柠檬酸盐缓冲剂(PH6)。试剂混合物2包含0.75％(W/W)的Methocel 60 HG，0.4％(W/W)的聚氧化乙烯，0.4％(W/W)的Triton X-100，8％(W/W)的铁氰酸钾，0.2％(W/W)的葡萄糖脱氢酶-PQQ和20mM的柠檬酸盐缓冲剂(PH6)。
试剂混合物1被用作第一工作电极(W1)，且试剂混合物2被用作第二电极。简单起见，试剂混合物2被用作参比电极(例如，在本发明第一实施方案中所讨论的3电极系统)。对于包括一个空白电极的4电极系统来说，还需要一种附加的试剂混合物。这种附加的试剂混合物具有与试剂混合物1和试剂混合物2相似的组分，但是没有添加任何葡萄糖敏感酶。
为了说明怎样制作和测试本发明葡萄糖小条的过程，如果没被陈述否定，3-电极系统(第一实施方案)用作示例。
试剂混合物的准备试剂混合物1的准备分二步步骤1往100ml的20mM的柠檬酸盐缓冲剂(PH6)中添加0.75g Methocel 60 HG，0.4g聚氧化乙烯，0.4g Triton X-100。搅拌溶液直至溶解。
步骤2往上述溶液中添加8g铁氰酸钾，1.5g GOD(葡糖氧化酶)。搅拌溶液直至溶解。得到的溶液准备分配。
试剂混合物2的准备也分二步步骤1往100ml的20mM的柠檬酸盐缓冲剂(PH6)中添加0.75g Methocel 60 HG，0.4g聚氧化乙烯，0.4g Triton X-100。搅拌溶液直至溶解。
步骤2往上述溶液中添加8g铁氰酸钾，0.2g GDH-PQQ(葡萄糖脱氢酶-PQQ)。搅拌溶液直至溶解。得到的溶液准备分配。
制作葡萄糖传感器本发明的各种实施方案的装配相对简单易懂。通常地，对于4层构造来说，基质层和试剂容纳层被碾压在一起，接着将合适的试剂混合物分配进每个试剂容纳开口。在烘干试剂混合物后，将通道形成层碾压到试剂容纳层上，然后将覆盖层碾压到通道形成层上。对于3层结构来说，基质层和通道形成层被碾压在一起，接着以独特的滴剂/小滴形式分配合适的试剂混合物进各自的导电表面区域上的U形通道内(或在叉形保险装置的并行的两个分叉小腿内)。在烘干试剂混合物后，然后将覆盖层碾压到通道形成层上。
更特别地，将镀金聚酯薄片的切成图2中图示的形状，形成传感器10的基质层20。采用激光(先前揭示的)在镀金聚脂薄片上刻痕。如图2图示的，薄片采用激光刻痕以在样品流动端14形成3个电极，在电接触端16形成三个接触点22，24和26。刻线非常薄，但足以制造三条彼此隔离的电子线路。可选地，沿着基质层20的外沿加工一条电子线路28以避免能导致源于完工的传感器10的噪声信号的潜在的静电问题，但这不是必需的。
然后将一片单面胶带按所需尺寸和形状剪切，形成试剂容纳层30，以便覆盖基质层20的导电层21的主要部分，仅暴露在图1中所示的一小块电接触区域。
在将试剂容纳层30附到基质层20上之前，通过激光或者诸如冲模-冲压机装配的机械方法在试剂容纳层30上打孔得到三个尺寸完全相等的圆形孔32，34和36，以制得电极孔32，34和36。电极孔32，34和36优选的孔尺寸为具有一个大约0.030英寸(0.76毫米)的典型直径值。如图2所描述的，电极孔32，34和36互相并行排列且间距为大约0.025英寸(0.63毫米)。圆形孔仅仅是为了说明目的。应该明白的是，对孔的形状没有严格要求，假如孔的尺寸大到足以容纳足够的化学试剂而能确保电极正常运行，而不是小到只能考虑一个相当小的样品室。如前面上面所陈述的，形成在孔32，34和36中的电极的优选的排列是W1(工作电极1)，W2(作电极2)和R(参比电极)。试剂容纳层30)然后被附到基质层20上，以这样一种方式限定电极孔W1、W2和R的范围。将大约0.05到0.09μL的试剂混合物1分配进入电极区域W1。如上所述，优选的，试剂混合物1是酶、稳定剂、胶粘剂、表面活化剂和缓冲剂的混合物。同样地，将大约0.05到0.09μL的试剂混合物2分配进入电极区域W2和电极区域R.
在添加试剂后，接着进行烘干。试剂烘干操作可以在从室温到大约80℃之间的温度范围内进行。烘干试剂所需时间取决于烘干过程在什么温度下进行。
烘干以后，将一片从“胶粘剂研究所(Adhesive Research)”购得的双面的胶带加工成包含U形通道42的通道形成层40。然后将通道形成层40层压到试剂容纳层30上。如前面所提及的，通道形成层40当作隔板并由此确定了样品室的尺寸。它的宽度和长度被优化以使流动样品相对快速移动。
使用透明薄片(Cat.No.PP2200 or PP2500，从3M公司可购得)做成顶层或覆盖层50。采用先前提到的激光或冲模冲压机的方式加工一个长方形排气孔52。排气孔52位于离样品进口18大约0.180英寸(4.57mm)处。将覆盖层50排好且层压到通道形成层40上，完成了图1中图示的传感器10的组装。
对葡萄糖传感器进行测试当一个流动样品被应用于本发明的单一小条时，流动样品通过取样端开口进入通道，流经W1、W2和R和终止于排气孔开口。
使用电化学分析仪(Mode1812，CH Instruments，Austin，TX，USA)采用计时电流法(i-t曲线)测量葡萄糖小条的电流响应。氧浓度(pO2)采用气压计(Precision Gas Mixer，PGM-3，Medicor，Inc.，SaltLake City，UT，USA)调节。一旦血样进入小条，在工作电极和参比电极之间施加一个0.3-0.5伏特的电势。采用YSI葡萄糖分析仪(Model 2300 Stat Plus，YSI Inc.，Yellow Spring，OH，USA).测量同一个血样中的葡萄糖浓度。
上面描述的实施方案是建立在电流分析基础之上的。但是那些在本技术领域掌握熟练技术的工作者，将会认识到本发明的传感器也可以采用库仑法，电势测量法，伏安法和其它电化学技术确定样品中分析组分的浓度。
下面的实例用于说明本发明独特的特征。
实例1示范在不同氧分压水平下的电流响应。
用连接有一台电化学分析仪(Mode1812，CH Instruments，Austin，TX，USA)的根据本发明的葡萄糖小条对具有不同氧分压水平和葡萄糖含量的血样进行测试，发现第一个工作电极(即GOD基电极)的电流响应值随着血样中氧气浓度的降低而升高或者随血样中氧气浓的升高而降低。为了说明氧气因素的影响，测试的血样分别具有三种氧气水平，即30，90，220mmHg。
图20显示了在氧分压水平分别为30和90mmHg下不同葡萄糖浓度时，第一工作电极(即GOD基电极)的电流响应的测量值。两种氧气水平下在葡萄糖浓度测试范围内，电流响应值与葡萄糖浓度呈线性相关。但是，正如所预期的，氧气分压水平为30mmHg时的电流响应值明显高于氧气分压水平为90mmHg时的电流响应值。通过换算电流响应值对葡萄糖浓度的变化。得出氧气分压水平从30变化到90mmHg，以GOD基工作电极测得的葡萄糖浓度的差异平均为24.3mg/dL。
图21显示了在氧分压水平分别为90和220mmHg下不同葡萄糖浓度时，GOD基电极的电流响应的测量值。氧气水平为220mmHg时在葡萄糖浓度测试范围内，电流响应值与葡萄糖浓度呈线性相关。但是，正如所预期的，氧气分压水平为220mmHg时的电流响应值明显低于氧气分压水平为90mmHg时的电流响应值。通过转换电流响应值对葡萄糖浓度的变化，得出氧气分压水平从30变化到90mmHg，以GOD基工作电极测得的葡萄糖浓度的变化量大约为15.0mg/dL。
图22显示了在氧分压水平分别为30和90mmHg下不同葡萄糖浓度时，第二工作电极(即GDH基电极)的电流响应的测量值。两种氧气水平下在葡萄糖浓度测试范围内，电流响应值与葡萄糖浓度也呈线性相关。正如所预期的，因为GDH基电极固有的特性，在葡萄糖浓度测试范围内，氧气分压水平为30mmHg与氧气分压水平为90mmHg时的电流响应值没有明显的差异。
图23显示了在氧分压水平分别为90和220mmHg下不同葡萄糖浓度时，第二工作电极(即GDH基电极)的电流响应的测量值。氧气水平为220mmHg时在葡萄糖浓度测试范围内，电流响应值与葡萄糖浓度呈线性相关。正如所预期的，因为GDH基电极固有的特性，在葡萄糖浓度测试范围内，氧气分压水平为90mmHg与氧气分压水平为220mmHg时的电流响应值没有明显的差异。
实例2使用葡萄糖小条的葡萄糖浓度与参比分析仪的葡萄糖读数之间的相关性。
葡萄糖小条的二个工作电极(W1和W2)使用参考分析仪(YSI葡萄糖分析仪)在氧气分压水平为90mmHg时进行校准。以由两个工作电极得到的葡萄糖浓度(C1和C2)对由YSI葡萄糖分析仪得到的相应读数绘图。图24和图25分别显示了相互关系图。关系式及回归常数如下GOD基电极C1＝0.9426 CYSI+8.6829，R2＝0.9981 (1)GDH基电极C2＝1.0351 CYSI+1.1208，R2＝0.9977 (2)显然，有两个工作电极得到的浓度结果与参考分析仪具有很好的相关性。作为结果，另一个也能被用作在平均氧气分压90mmHg水平上的葡萄糖传感器。
实例3效果选择电极响应-氧气影响的示范因为一个真实的血样的氧气水平是未知的，应该利用GDH，因为它实际上不受氧气的影响，可以更好的用于确定葡萄糖浓度。然而，如上所述，GDH基工作电极能受到其它糖的干涉，例如，半乳糖和麦芽糖，明显地提高了响应值而造成葡萄糖读数不精确(见下述)。在这种情况下，GOD基工作电极具有它的优势。因此，需要一个预设值或者边界值以确定选择那个工作电极。
如上所述，氧气分压从30变化到90mmHg时，采用GOD基工作电极测得的葡萄糖浓度平均改变值为大约24.3mg/dL。这个值被选择为预设值或者边界值，根据这个值来确定选择那个电极响应值来确定样品中葡萄糖浓度。例如，如果C1与C2的绝对差或者|C1-C2|等于24.3mg/dL，那么优选的葡萄糖浓度为C2，即浓度依据GDH基的工作电极确定。否则，优选的葡萄糖浓度等于C1，即浓度依据GOD基工作电极确定。那意味着如果没有其它糖如半乳糖和麦芽糖明显的干扰，本发明优选的传感器葡萄糖读数总是依据GDH基工作电极确定。应该指出预设值或者边界值“24.3”不是一个固定的值。它仅被用作例证目的。这个值取决于电极的构造和试剂混合物的组成。它也取决于测量方法必然的测试误差。
当葡萄糖小条与预编程序的测试设备连接时，在依据两种工作电极确定的响应值之间选择的过程自动进行。
为了示范本发明葡萄糖小条具有的能消除溶解的氧气的影响的识别特性，采用本发明的葡萄糖小条对氧气分压水平为30mmHg葡萄糖浓度在69到565mg/dL之间的七个不同浓度水平的血样进行测试。依据两个工作电极(W1和W2)确定的葡萄糖浓度结果(C1和C2)列于表1中。对照参比分析仪器(YSI葡萄糖分析仪)的平均百分比误差(MPE)也列于表中。优选的葡萄糖浓度(C)是根据预设值或者边界值(24.3)确定的，它和结果值的优选的MPEs一起列于表中。注意浓度(C1和C2)是使用在氧气水平为时的校准关系式计算得到的。
表1氧气分压为30mmHg时的测试结果
如表1所示，优选平均值MPE(3.9％)相对于依据于GOD基工作电极的平均值MPE(13.3％)具有明显地提高且与依据于GDH基工作电极的平均值MPE(2.9％)相当。在整个葡萄糖浓度范围内，依据于GDH基工作电极的MPEs是可以接受的，表明没有了氧气的影向。但是，由于氧气的影响，依据于GOD基工作电极的MPEs更高，尤其在葡萄糖浓度较低时。本发明的传感器通过在两个工作电极中进行选择，极大地减少了氧气的干扰。
实例4选择电极响应-麦芽糖、乳糖干扰的示范应为了说明本发明的葡萄糖测量方法具有的消除乳糖、麦芽糖干扰的有识别能力的的特点，两个葡萄糖浓度水平的氧分压水平为90mmHg的血样被各自添加多种浓度的乳糖、麦芽糖。得到的血样采用本发明的葡萄糖小条进行测试。结果归纳于表2和表3中。
表2三乳糖样品的测试结果
列表2列举了绝对浓度差|C1-C2|，还有优选葡萄糖浓度C和结果的MPEs.优选的葡萄糖浓度是依据预设值或者边界值(24.3)得到的。优选的平均值MPE(1.8％)比依据于GDH基工作电极的平均值MPE(43.5％)小很多且与依据于GOD基工作电极的平均值MPE(2.1％)相当。
表3添加了麦芽糖的样品的测试结果
列表3列举了绝对浓度差|C1-C2|，还有优选葡萄糖浓度C和结果的MPEs.优选的葡萄糖浓度是依据预设值或者边界值(24.3)得到的。优选的平均值MPE(2.4％)比依据于GDH基工作电极的平均值MPE(59.2％)小很多且与依据于基GOD工作电极的平均值MPE(2.1％)相当。
如所预期的，GDH基工作电极受到了来自于乳糖、麦芽糖的严重干扰，而这些化合物对GOD基工作电极没有影响。当样品中含有乳糖或/和麦芽糖时，使用依据GOD基工作电极的响应值时更优选的。通过在两个工作电极中进行选择，本发明的传感器的这个独特的特性极大地减少了这些干扰糖的影响。
上述例子说明了与本发明葡萄糖小条的使用有关联的氧气及干扰糖的干涉效应。一份真实的样品可能同时存在氧气和乳糖/麦芽糖问题。这些问题也可以通过使用这个选择特性和本发明葡萄糖传感器的两个工作电极解决。
尽管在这里描述了本发明优选的实施方案，但是上述的描述仅仅是说明性的。在这里揭示的发明将会被那些在各自技术领域训练有素的人进一步改进，但是所有的这些改进被认为处于定义于权利要求中的本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种葡萄糖生物传感器，其包括设有流动样品进口及一个电接触端的板层本体；流动样品进口；连接在所述的流动样品入口及排气孔之间的基本平坦的样品室，所述的测试室适合通过所述的流动样品进口收集流动样品；GOD基葡萄糖电极；GDH基葡萄糖电极；和参比电极，其中所述的GOD基葡萄糖电极、所述的GDH基葡萄糖电极和所述的参比电极都置于所述的样品室内。
2.如权利要求1所述的葡萄糖生物传感器，其中所述的GOD基葡萄糖电极进一步包含氧化还原介质。
3.如权利要求2所述的葡萄糖生物传感器，其中所述的GOD基葡萄糖电极进一步包含一种或多种选自粘结剂、缓冲剂和表面活性剂的材料。
4.如权利要求1所述的葡萄糖生物传感器，其中所述的GDH基葡萄糖电极进一步包含氧化还原介质。
5.如权利要求4所述的葡萄糖生物传感器，其中所述的GDH基葡萄糖电极进一步包含一种或多种选自粘结剂、缓冲剂和表面活性剂的材料。
6.一种更精确的测定样品中葡萄糖的系统，包括加入了一定量的葡萄糖氧化酶的第一葡萄糖感应电极；加入了一定量的PQQ葡萄糖脱氢酶的第二葡萄糖感应电极；参比电极；和在采用所述的第一葡萄糖感应电极的第一种葡萄糖测量和采用所述的第二葡萄糖感应电极的第二种葡萄糖测量之间进行选择的方法。
7.如权利要求6所述的系统，其中所述的第一种葡萄糖感应电极进一步包含氧化还原介质。
8.如权利要求7所述的系统，其中所述的第一种葡萄糖感应电极进一步包含一种或多种选自粘结剂、缓冲剂和表面活性剂的材料。
9.如权利要求6所述的系统，其中所述的第二种葡萄糖感应电极进一步包含氧化还原介质。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述的第二种葡萄糖感应电极进一步包含一种或多种选自粘结剂、缓冲剂和表面活性剂的材料。
11.如权利要求6所述的系统，其中所述的选择方法包括一种能确定所述的第一种葡萄糖测量和第二种葡萄糖测量之间差值的系统，并在将所述的差值与预定值比较后根据所述的差值从所述的第一种葡萄糖测量结果和第二种葡萄糖测量结果之间选择其一。
12.一种更精确的确定血样中葡萄糖浓度的方法，所述的方法包括采用加入了葡萄糖氧化酶的葡萄糖电极对所述的血样进行第一次所述的葡萄糖浓度测量；采用加入了PQQ葡萄糖脱氢酶葡萄糖电极对所述的血样进行第二次所述的葡萄糖浓度测量；计算所述的第一次测量结果及所述的第二次测量结果之间的差值；并且根据所述的计算得到的差值从所述的第一次测量结果及所述的第二次测量结果之间选择其一。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述的选择步骤进一步包含在将所述的差值与预定值比较后根据所述的差值从所述的第一次葡萄糖测量结果和第二次葡萄糖测量结果之间选择其一。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的选择步骤进一步包括如果所述的计算的差值大于大约24mg/dL则选择所述的第一次测量结果。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述的选择步骤进一步包括如果所述的计算的差值小于或等于大约24mg/dL则选择所述的第二次测量结果。
16.一种一次性使用的葡萄糖传感器，其包括一个具有一个形成测试室的开放孔的传感器本体；布置在所述的开放孔内的一个GOD基葡萄糖电极，一个GDH基葡萄糖电极和参比/计算电极；和在所述的感应器本体一端的电接触端。
全文摘要
本发明公开了一种包含一个加入了一定数量的葡萄糖氧化酶的第一种葡萄糖感应电极、一个加入了一定数量的PQQ－葡萄糖脱氢酶的第二种葡萄糖感应电极、参比电极和在用第一种葡萄糖感应电极测定的第一种测量值与用第二种葡萄糖感应电极测定的第二种测量值之间选择其一的选择方法的更精确地测量样品中葡萄糖浓度的系统。
文档编号G01N27/49GK1991368SQ20061016587
公开日2007年7月4日 申请日期2006年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者小华·蔡, 传畅·杨, 裴建宏, 安迪·沃 申请人:诺尔生物医药有限公司