本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法，以用于小麦的遗传转化改良。
背景技术：
：：在植物遗传转化中，为了从大量非转化细胞中获得转化体，选择标记基因起着非常重要的作用。目前使用较多的选择标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因。随着越来越多的转基因植物进人环境释放或商品化种植，转基因作物的安全性及其商业化问题在国内、国际争议日益激烈，争议的焦点就是转基因作物中选择标记基因对生态环境和食品安全方面的风险。因此，有效地剔除选择基因已成为作物基因工程改良的关键。位点特异性重组可精确地删除选择标记基因，同时可获得单拷贝转基因植株，有利于转入基因的表达和稳定性，在转基因研究中有着巨大的应用前景(srivastavaetal.,1999)。近年来，位点特异性重组系统已被成功地应用于部分单子叶植物如玉米(zhangetal.,2003；kerbachetal.,2005；lietal.,2010)和水稻(senguptaetal.，2010；akbudaketal.，2011)选择标记基因的删除。美国孟山都公司利用cre/loxp系统获得的无选择标记基因的高赖氨酸转基因玉米品种已商品化(ow，2007)。新的单向重组系统也逐渐被证实可用于植物位点特异性重组。这一系统在完成删除后不能催化整合，因此更加稳定，如cinh/rs重组系统(kholodiietal.，2001)和para/mrs系统(thomsonetal.，2009)。小麦是我国大面积种植的主要粮食作物之一，且在大多数情况下是直接食用的主粮，因此其安全的无标记基因转化体系的建立就尤为关键。然而，小麦位点特异性重组方面的研究相对滞后，目前仅有两个研究小组的4篇研究报道(srivastavaetal.，1999；srivastava1andow，2003；rubtsovaetal.，2008；kempeetal.，2010)。在双子叶植物上成功使用的化学诱导和热激诱导删除系统，化学处理和高温诱导会降低小麦愈伤组织的分化，从而降低转化率，对于再生率相对较低的小麦愈伤组织来说，应用有一定的局限性。以下是发明人给出的参考文献：1)akbudakmaandsrivastavav.improvedflprecombinase,flpe,efficientlyremovesmarkergenefromtransgenelocusdevelopedbycre–loxmediatedsite-specificgeneintegrationinrice.molbiotechnol，2011，doi10.1007/s12033-011-9381-y(online)。2)kempek,rubtsovam,bergerc,kumlehnj,schollmeierc,andgilsm.transgeneexcisionfromwheatchromosomesbyphagephic31integrase.plantmolbiol，2010，72(6):673-687。3)kerbachs,lorzhandbeckerd.site-specificrecombinationinzeamays.theorapplgenet，2005，111:1608–1616。4)kholodiig.2001.theshufflingfunctionofresolvases[j].gene,269:121-130。5)lib,lin,duanx,weia,yangaandzhangj.generationofmarker-freetransgenicmaizewithimprovedsalttoleranceusingtheflp/frtrecombinationsystem.journalofbiotechnology,2010，145:206-213。6)owdw.gmmaizefromsite-specificrecombinationtechnology,whatnext？[j].curropinbiotech，2007，18:115-120。7)rubtsovam,kempek,gilsa,ismagula,weyenjandgilsm.expressionofactivestreptomycesphagephic31integraseintransgenicwheatplants.plantcellrep，2008，27:1821-1831。8)senguptas,chakrabortid,mondalhaanddass.selectableantibioticresistancemarkergene-freetransgenicriceharbouringthegarlicleaflectingeneexhibitsresistancetosap-suckingplanthoppers.plantcellrep，2010，29:261-271。9)srivastavav,andersonodandowdw.single-copytransgenicwheatgeneratedthroughtheresolutionofcomplexintegrationpatterns[j].procnatlacadsci，1999，96:11117-11121。10)srivastava1vandowd.rareinstancesofcre-mediateddeletionproductmaintainedintransgenic.plantmolbio，2003，52(3):661-668。11)thomsonjg,yauyy,blanvillainr,chiniquyd,thilmonyrandowdw.pararesolvasecatalyzessite-specificexcisionofdnafromthearabidopsisgenome[j].transgenicres，2009，18:237-248。12)zhangw,subbaraos,addaep,shena,armstrongc,peschkevandgilbertsonl.cre/loxmediatedmarkergeneexcisionintransgenicmaize(zeamaysl.)plants.theorapplgenet，2003，107:1157-1168。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种利用位点特异性重组系统建立小麦低温诱导删除选择标记基因的无标记转化体系的方法。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：一种利用位点特异性重组系统建立小麦低温诱导删除选择标记基因的无标记转化体系的方法，其特征在于，该方法首先构建低温诱导wcs120启动子驱动的para/mrs位点特异性重组系统植物表达载体；通过农杆菌转化法转化小麦，筛选获得转基因植株；然后进行转基因后代标记基因删除检测和抗旱性检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。其具体的步骤是：步骤1)：低温诱导删除中间载体pxl5523-fwcs的构建用核酸内切酶aatⅱ和ascⅰ双酶切pxl5523载体，去掉花粉特异性启动子lat52，回收载体大片段，用aatⅱ和ascⅰ双酶切t3-fwcs载体，回收fwcs启动子；然后用t4dna连接酶将fwcs启动子连接到切除lat52启动子的pxl5523质粒上，转化后以wcsf1/wcsr1为引物进行菌落pcr检测；扩增体系：2.5μl的10×pcrbuffer+mg2+、2.0μl的dntp、wcsf1/wcsr1引物各1.0μl、模板菌液1.0μl、pfu聚合酶0.2μl，用ddh2o补足至25μl；反应程序：95℃，4min；94℃，45s；58℃，45s；72℃，2min；32个循环；72℃再延伸10min；阳性菌落提质粒后用ascⅰ和aatⅱ进行双酶切鉴定，正确的阳性克隆送测序鉴定，序列正确的命名为pxl5523-fwcs；步骤2)：位点特异性重组植物表达载体pxl5523-fwcs-rda的构建以载体prd29a::pyl5为模板，用含有apaⅰ酶切位点的引物rdn-f3/rdn-r3扩增1.9kb的rd29a-pyl5-nost表达框；pcr反应体系：10×pcrbuffer+mg2+：2.5μl，dntp：2.0μl，rdn-f3/rdn-r3引物：各1.0μl，模板dna：1.0μl，pfu聚合酶：0.2μl，用ddh2o补足至25μl；pcr反应程序：95℃：4min；94℃：45s，65℃；45s，72℃：4min，32个循环；72℃再延伸10min；pcr产物回收加尾后连接peasy-t1载体，重组载体转化大肠杆菌后以rdn-f3/rdn-r3为引物进行菌落pcr鉴定，重组质粒用apaⅰ进行酶切检测和测序验证，测序正确的命名为t1-rda；酶切回收重组质粒t1-rda中的rd29a-pyl5-nost表达框，与经apaⅰ酶切并去磷酸化的载体pxl5523-fwcs连接，转化后用rdn-f3/rdn-r3进行扩增检测，检测呈阳性的菌落提质粒进行apaⅰ单酶切鉴定，酶切得到1.9kb的目的基因片段及载体骨架，正确的克隆送测序，测序正确即命名为pxl5523-fwcs-rda；步骤3)植物表达载体pxl5523-fwcs-rda小麦转化及检测(1)愈伤组织准备小麦成熟种子用浓度为75％的酒精消毒3min～5min，蒸馏水冲洗3～5次，再用浓度为0.1％的升汞消毒10min，之后再用蒸馏水彻底清洗3次，种子经表面消毒后在无菌水中26℃、黑暗条件下浸泡16～20h，然后在无菌条件下剥出种胚，接种在诱导培养基(ms+2.0mg/l的2,4-d+500mg/l的酸水解酪蛋白+30g/l的蔗糖+7.0g/l的琼脂)上，25±1℃暗培养15d；(2)农杆菌转化及筛选a：挑取pxl5523-fwcs-rda重组表达载体转化的阳性农杆菌gv3101单菌落于2ml含有三种抗生素的yeb培养液中28℃，200rpm振荡培养24～48h；b：按照1％的接种量将培养液接种至添加三种抗生素及0.2mmol/l的乙酰丁香酮(as)的yeb液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至菌液od600值为0.6～0.8；c：将培养好的菌液转入无菌离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集沉淀；再用msc培养液(ms+2.0mg/l的2,4-d+0.2mmol/l的as+30g/l的蔗糖)重新悬浮，至菌液od600值为0.6和0.8，用两种不同浓度的菌液分别侵染预培养15d的小麦愈伤组织30min和60min；具体方法为：将小麦愈伤组织放入相应浓度的农杆菌菌液中，室温下不断摇动，使农杆菌与愈伤组织能够充分接触；侵染结束后用无菌滤纸擦干愈伤表面菌液，在共培养基msa(诱导培养基+0.2mmol/l乙酰丁香酮)上，在25±1℃，黑暗条件下共培养3d，共培养结束后用500mg/l的carb溶液清洗愈伤表面的农杆菌，最后用蒸馏水冲洗2～3次，擦干表面液体后转至诱导培养基上23℃黑暗条件下恢复培养2周；d：恢复2周后的愈伤组织转移至筛选培养基上，2周为一个筛选周期，将筛选后存活的愈伤组织转入分化培养基进行分化；分化小苗转至生根培养基生根后进行移栽检测，春化后在温室内培养；步骤4)转基因植株检测(1)目的基因pyl5的检测采用ctab法提取再生小麦叶片dna，以野生型小麦m19基因组为阴性对照，重组质粒pxl5523-fwcs-rda为阳性对照，用pyl5基因检测引物rdn-f5/rdn-r5进行pcr扩增检测；扩增体系：2×estaqmix：10μl，pyl5基因检测引物rdn-f5/rdn-r5：各1.0μl，模板dna1.0μl；用ddh2o补足至20μl；pcr反应程序：94℃：5min；94℃：45s，56℃：45s，72℃：1min，34个循环；72℃再延伸10min；(2)重组酶基因para的检测对目的基因检测阳性转基因植株春化后移栽，用重组酶基因para检测引物paraseqf/nostr进行pcr扩增检测；pcr扩增体系：2×estaqmix：10μl，引物paraseqf/nostr：各1.0μl，模板dna：1.0μl，用ddh2o补足至20μl；pcr扩增条件：94℃：5min；94℃：45s，56℃：45s，72℃：45s，35个循环；72℃再延伸10min；(3)基因删除检测用删除引物p1、p2检测；(4)转基因小麦抗旱性检测对温室培养转基因后代株系种子过夜吸水膨胀后置于培养皿中萌发，将萌发后的幼苗移栽入土中，置于温室中进行培养，光照周期16h/8h，培养温度18℃～20℃，待到幼苗三周龄时进行干旱处理，干旱处理15天，第15天后进行复水。本发明的利用位点特异性重组系统建立小麦低温诱导删除选择标记基因的无标记转化体系的方法，选用单向位点特异性重组para-mrs系统和低温诱导性启动子构建含有抗旱目的基因pyl5的位点特异性删除植物表达载体，利用基因枪转化法和农杆菌转化法对小麦绵阳19的幼胚和成熟胚愈伤组织进行转化，对转基因后代进行标记基因删除检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。对小麦基因工程遗传改良有非常重要意义。附图说明图1是para-mrs位点特异性重组植物表达载体pxl5523t-dna区结构，图中，mrs，重组位点；lat52，lat59，花粉特异性启动子；para，重组酶基因，gfp，绿色荧光蛋白报告基因；pnos，nos基因的启动子；bar，抗除草剂基因。图2是删除检测引物p1、p2在重组载体上的位点示意图。图3是重组质粒pxl5523-fwcs酶切检测图；图4是质粒t1-rda单酶切图；图5是重组质粒pxl5523-fwcs-rda质粒酶切图；图6是农杆菌转化再生植株pyl5基因pcr检测图；图7是农杆菌转化再生植株重组酶基因parapcr检测图；图8是春化后基因枪转化小麦删除检测图；图9是转基因小麦株系r18-27与对照干旱处理前后生长状况图片。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。具体实施方式申请人研究发现，对于黄淮麦区广泛种植的冬性和半冬性小麦来说，其分化后移栽前都需要不同时间低温春化过程，利用wcs120启动子不需要其它处理条件，可在春化过程中诱导删除选择标记基因，不影响转化率。因此，利用小麦wcs120低温诱导启动子和para/mrs位点特异性重组系统建立小麦稳定高效的无标记基因转化体系，对小麦无选择标记基因基因工程改良有非常重要意义。wcs120蛋白是小麦在低温时合成的一种50kd的高丰度蛋白，受低温诱导表达，在常温条件下(25℃)，在小麦中检测不到wcs120基因的mrna，而当温度降至17℃时就可以检测到微量表达，在2℃～4℃的低温条件下，wcs120基因的表达量急剧上升，在第21d时达到峰值，并一直保持高表达量直至低温诱导的第70d，在此之后wcs120基因的表达量会缓慢下降。在我国黄淮麦区广泛种植的小麦属于冬性或半冬性小麦，在其自然的生长过程中都需要冬季的低温诱导才能结实，同样在以其为材料的遗传转化后的移栽过程中也都需要低温春化，因此利用低温诱导的删除系统则在转化过程中不需要其他诸如化学、病原菌诱导等特殊处理，不会影响转化效率，在自然的春化过程中就可以完成对选择标记基因的删除。因此，采取选取小麦低温诱导的wcs120启动子和单向重组para/mrs系统，通过构建低温诱导删除植物表达载体，农杆菌转化法转化小麦，除草剂ppt筛选获得阳性植株后低温春化，诱导标记基因删除，建立小麦低温诱导删除的无标记基因转化体系。以下的实施例给出了一种利用位点特异性重组系统建立小麦低温诱导删除选择标记基因的无标记转化体系的方法，首先构建低温诱导wcs120启动子驱动的para/mrs位点特异性重组系统植物表达载体；通过农杆菌转化法转化小麦，筛选获得转基因植株；然后进行转基因后代标记基因删除检测和抗旱性检测，建立小麦无选择标记基因转化体系，获得无选择标记基因转化植株。具体实施过程如下：1、低温诱导删除中间载体pxl5523-fwcs的构建用核酸内切酶aatⅱ和ascⅰ双酶切pxl5523载体，去掉花粉特异性启动子lat52，回收载体大片段，用aatⅱ和ascⅰ双酶切t3-fwcs载体，回收fwcs启动子。然后用t4dna连接酶将fwcs启动子连接到切除lat52启动子的pxl5523质粒上，转化后以wcsr1/wcsf1为引物进行菌落pcr检测。质粒pxl5523t-dna区结构如图1所示，图中，利用低温诱导wcs120启动子替换重组酶para前的花粉特异性启动子lat52，在lb和左侧mrs位点间插入目的基因表达框，构建重组表达载体。扩增体系：2.5μl的10×pcrbuffer+mg2+、2.0μl的dntp(2.5mmol/l)、wcsf1/wcsr1引物(10μmol/l)各1.0μl、模板菌液1.0μl、pfu聚合酶0.2μl，用ddh2o补足至25μl。反应程序：95℃，4min；94℃，45s；58℃，45s；72℃，2min；32个循环；72℃再延伸10min。阳性菌落提质粒后用ascⅰ和aatⅱ进行双酶切鉴定(图3)，正确的阳性克隆送测序鉴定，序列正确的命名为pxl5523-fwcs。wcsf1/wcsr1引物序列：wcsf1：catcgacgtcacgtcggcctgtatgtacaat(aatⅱ酶切位点)wcsr1：attggcgcgccagcgcgacgcagtatttataggc(ascⅰ酶切位点)2、位点特异性重组植物表达载体pxl5523-fwcs-rda的构建以载体prd29a::pyl5为模板，用含有apaⅰ酶切位点的引物rdn-f3/rdn-r3扩增1.9kb的rd29a-pyl5-nost表达框。其中，质粒prd29a::pyl5中rd29a-pyl5-nost表达框序列如下：atgtaaacgaatattttgtatgttcagtgaaagtaaaacaaattaaattaacaagaaacttatagaagaaaatttttactatttaagagaaagaaaaaaatctatcatttaatctgagtcctaaaaactgttatacttaacagttaacgcatgatttgatggaggagccatagatgcaattcaatcaaactgaaatttctgcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagaggaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattacttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttcgttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagtttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcatgaggtcaccggtgcaactccaacacggctcagacgccactaacggtttccacacgctgcagcctcacgatcagaccgatggtccgatcaagagagtgtgtctcacgcgcggtatgcatgtccctgaacacgttgcgatgcaccacacacacgacgttggtccggaccagtgttgctcctcggtggtgcagatgatccacgcgccgcctgagtccgtgtgggctcttgtgcggcgtttcgataatccgaaggtttacaagaacttcatcagacagtgccgtatcgtccaaggcgatggactacacgtcggcgatctccgggaggtcatggtggtctctggactcccggcggtctcgagcaccgagaggctcgagatcttggacgaggagcgtcacgtgataagctttagtgtcgttggtggggaccacaggctcaagaactaccgatcggtgacgacactacacgcgtcggacgacgaaggtaccgtggtggtggagtcttacatcgttgatgtgccgccgggaaacacggaggaggaaactctaagcttcgttgatactatcgtccggtgcaaccttcagtctctggctcgaagtaccaaccggcaataagctagctagaatctctagagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc。pcr反应体系：10×pcrbuffer+mg2+：2.5μl，dntp(2.5mmol/l)：2.0μl，引物rdn-f3/rdn-r3(10μmol/l)：各1.0μl，模板dna(50ng/μl)：1.0μl，pfu聚合酶：0.2μl，用ddh2o补足至25μl。pcr反应程序：95℃：4min；94℃：45s，65℃：45s，72℃：4min，32个循环；72℃再延伸10min。pcr产物回收加尾后连接peasy-t1载体，重组载体转化大肠杆菌后以引物rdn-f3/rdn-r3进行菌落pcr鉴定，重组质粒用apaⅰ进行酶切检测和测序验证(图4)，测序正确的命名为t1-rda。酶切回收重组质粒t1-rda中的rd29a-pyl5-nost表达框，与经apaⅰ酶切并去磷酸化的载体pxl5523-fwcs连接，转化后用rdn-f3/rdn-r3进行扩增检测，检测呈阳性的菌落提质粒进行apaⅰ单酶切鉴定(图5)，酶切得到1.9kb的目的基因片段及载体骨架，正确的克隆送测序，测序正确即命名为pxl5523-fwcs-rda。rdn-f3/rdn-r3引物序列：rdn-f3：tagggcccatgtaaacgaatattttgtatg；rdn-r3：tggggcccgatctagtaacatagatgac。3、植物表达载体pxl5523-fwcs-rda小麦转化及检测(1)愈伤组织准备小麦成熟种子用75％酒精消毒3～5min，蒸馏水冲洗3～5次，再用浓度为0.1％的升汞消毒10min，之后再用蒸馏水彻底清洗3次，种子经表面消毒后在无菌水中26℃、黑暗条件下浸泡16～20h，然后在无菌条件下剥出种胚，接种在诱导培养基(市售)上，25±1℃暗培养15d。(2)农杆菌转化及筛选a.挑取pxl5523-fwcs-rda重组表达载体转化的阳性农杆菌gv3101单菌落于2ml含有三种抗生素(50mg/l的kan、50mg/l的rif和50mg/l的庆大霉素)的yeb培养液中28℃，200rpm振荡培养24～48h；b.按照1％的接种量将培养液接种至添加三种抗生素(50mg/l的kan、50mg/l的rif和50mg/l的庆大霉素)及0.2mmol/l的乙酰丁香酮(as)的yeb液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至菌液od600值约为0.6～0.8左右。c：将培养好的菌液转入无菌离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集沉淀，再用msc培养液(ms+2.0mg/l的2,4-d+0.2mmol/l的as+30g/l的蔗糖)重新悬浮，至菌液od600值为0.6和0.8，用两种不同浓度的菌液分别侵染预培养15d的小麦愈伤组织30min和60min；具体方法为：将小麦愈伤组织放入相应浓度的农杆菌菌液中，室温下不断摇动，使农杆菌与愈伤组织能够充分接触；侵染结束后用无菌滤纸擦干愈伤表面菌液，在共培养基msa(诱导培养基+0.2mmol/l的乙酰丁香酮)上，在25±1℃，黑暗条件下共培养3d，共培养结束后用500mg/l的carb溶液清洗愈伤表面的农杆菌，最后用蒸馏水冲洗2～3次，擦干表面液体后转至诱导培养基上23℃黑暗条件下恢复培养2周；d：恢复2周后的愈伤组织转移至筛选培养基(ms+2.0mg/l的2,4-d+5.0mg/l的ppt+30g/l的蔗糖+7g/l的琼脂+500mg/l的carb)上，2周为一个筛选周期，将筛选后存活的愈伤组织转入分化培养基(ms基本培养基+30g/l的蔗糖+7g/l的琼脂+1.0mg/l的iaa+1.0mg/l的kt++350mg/l的carb)进行分化；分化小苗转至生根培养基(1/2ms+0.5mg/l的naa+15g/l的蔗糖+5.2g/l的琼脂)生根后进行移栽检测，春化后在温室内培养。4、转基因植株检测(1)目的基因pyl5的检测采用ctab法提取再生小麦叶片dna，以野生型小麦m19基因组为阴性对照，重组质粒pxl5523-fwcs-rda为阳性对照，用pyl5基因检测引物rdn-f5/rdn-r5进行pcr扩增检测。pyl5基因检测引物序列为：rdn-f5：ctaacggtttccacacgctg；rdn-r5：tgtataattgcgggactctaatc。扩增体系：2×estaqmix：10μl，正反pyl5基因检测引物(10μmol/l)：各1.0μl，模板dna：1.0μl，用ddh2o补足至20μl，pcr反应程序：94℃：5min；94℃：45s，56℃：45s，72℃：1min，34个循环；72℃再延伸10min。筛选获得的转基因植株(图6)目的基因pcr检测共检测到的12株转基因阳性植株。(2)重组酶基因para的检测对目的基因检测阳性的12株转基因植株春化后移栽，用重组酶基因para检测引物paraseqf/nostr进行pcr扩增检测。pcr扩增体系：2×estaqmix：10μl，正反重组酶基因para检测引物(10μmol/l)：各1.0μl，模板dna：1.0μl，用ddh2o补足至20μl。pcr扩增条件：94℃：5min；94℃：45s，56℃：45s，72℃：45s，35个循环；72℃再延伸10min。重组酶基因para检测引物序列为：paraseqf：ggtgaagtcgtcgttgcggagaa；nostr：ctttactccaccatctcgtccttat。春化后12株转基因植株有四株重组酶检测为阴性(图7)，说明春化过程中有可能发生了标记基因删除。(3)基因删除检测用图2所示删除引物p1、p2检测。在para重组酶未被诱导表达前由于两个重组位点间的序列太长因而引物p1和p2不能扩增。当转基因小麦经低温春化诱导后，para重组酶在低温诱导启动子fwcs的调控下表达，删除两个重组位点mrs间的序列，只留下一个重组位点mrs，此时p1和p2可以扩增。删除引物：p1：cgggaaacacggaggaggaaact；p2：gtttacccgccaatatatcctgt。对四株重组酶阴性的转基因植株用删除引物检测结果如图8，有三株检测到标记基因的删除。(4)转基因小麦抗旱性检测对温室培养转基因后代株系r18-27种子过夜吸水膨胀后置于培养皿中萌发，将萌发后的幼苗移栽入土中，置于温室中进行培养，光照周期16h/8h(光/暗)，培养温度18～20℃。待到幼苗三周龄时进行干旱处理，具体做法如下：将小麦幼苗(包括实验组、对照组土培苗)干旱处理15天(在温室中暂停浇水15天)，第15天后进行复水。干旱处理前期转基因小麦和对照组小麦在形态上没有明显差别，处理后转基因小麦和对照的生长状况对比如图9所示。干旱处理后期野生型小麦出现明显的枯黄现象，而转基因小麦叶片出现轻度萎蔫，生长状况明显优于野生型小麦，复水5d后对照不能正常生长，而转基因植株复绿后恢复生长，说明转基因植株抗旱性明显提高。核苷酸序列表<110>西北农林科技大学<120>低温诱导位点特异性重组删除的无标记转化方法<160><210>1<211>31<212>wcsf1引物<213>dna<220><400>catcgacgtcacgtcggcctgtatgtacaat<210>2<211>34<212>wcsr1引物<213>dna<220><400>attggcgcgccagcgcgacgcagtatttataggc<210>3<211>30<212>rdn-f3引物<213>dna<220><400>tagggcccatgtaaacgaatattttgtatg<210>4<211>28<212>rdn-r3引物<213>dna<220><400>tggggcccgatctagtaacatagatgac<210>5<211>20<212>pyl5基因检测引物rdn-f5<213>dna<220><400>ctaacggtttccacacgctg<210>6<211>23<212>pyl5基因检测引物rdn-r5<213>dna<220><400>tgtataattgcgggactctaatc<210>7<211>23<212>重组酶基因para检测引物paraseqf<213>dna<220><400>ggtgaagtcgtcgttgcggagaa<210>8<211>25<212>重组酶基因para检测引物nostr<213>dna<220><400>ctttactccaccatctcgtccttat<210>9<211>23<212>删除引物p1<213>dna<220><400>cgggaaacacggaggaggaaact<210>10<211>23<212>删除引物p2<213>dna<220><400>gtttacccgccaatatatcctgt<210>11<211>1944<212>质粒prd29a::pyl5中rd29a-pyl5-nost表达框序列<213>dna<220><400>atgtaaacgaatattttgtatgttcagtgaaagtaaaacaaattaaattaacaagaaacttatagaagaaaatttttactatttaagagaaagaaaaaaatctatcatttaatctgagtcctaaaaactgttatacttaacagttaacgcatgatttgatggaggagccatagatgcaattcaatcaaactgaaatttctgcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagaggaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattacttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttcgttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagtttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcatgaggtcaccggtgcaactccaacacggctcagacgccactaacggtttccacacgctgcagcctcacgatcagaccgatggtccgatcaagagagtgtgtctcacgcgcggtatgcatgtccctgaacacgttgcgatgcaccacacacacgacgttggtccggaccagtgttgctcctcggtggtgcagatgatccacgcgccgcctgagtccgtgtgggctcttgtgcggcgtttcgataatccgaaggtttacaagaacttcatcagacagtgccgtatcgtccaaggcgatggactacacgtcggcgatctccgggaggtcatggtggtctctggactcccggcggtctcgagcaccgagaggctcgagatcttggacgaggagcgtcacgtgataagctttagtgtcgttggtggggaccacaggctcaagaactaccgatcggtgacgacactacacgcgtcggacgacgaaggtaccgtggtggtggagtcttacatcgttgatgtgccgccgggaaacacggaggaggaaactctaagcttcgttgatactatcgtccggtgcaaccttcagtctctggctcgaagtaccaaccggcaataagctagctagaatctctagagatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc当前第1页12当前第1页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