一种提高lunasin多肽在大豆中表达量的方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种提高lunasin多肽在大豆中表达量的方法以及其在功能食品中的应用。

背景技术：

lunasin是在大豆中分离获得的一种含有43个氨基酸的多肽化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化和降胆固醇等特性。研究发现，lunasin在天然原料中含量较低，单纯从天然原料中提取、分离纯化等来获得lunasin，成本较高。鉴于其重要的实用价值，如何高效大量的获得lunasin是需要攻克的难题。

随着生物技术的不断发展，基因工程和植物遗传转化技术使这一设想成为可能，将lunasin基因整合到大豆的基因组中，通过基因的过表达来提高大豆中lunasin多肽提取物的含量，利用大豆自身的表达系统生产lunasin多肽。大豆作为世界上重要的粮食作物之一，在食品、营养和医药等方面都发挥重要作用，通过基因工程技术获取优良的转基因大豆的手段日趋成熟。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高lunasin多肽在大豆中表达量的方法，其将lunasin基因整合到大豆基因组中，这样不仅避免了繁琐的分离纯化加工工程，而且还可以直接为人们日常生活食用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种提高lunasin多肽在大豆中表达量的方法，包括以下步骤：

1)大豆lunasin基因克隆和植物表达载体构建：

提取大豆新鲜组织的rna，反转录cdna，以cdna为模板，进行pcr扩增，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳获得lunasin基因片段，回收目的片段，并连接到t载体；得到的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，然后进行测序验证；酶切，连接，将克隆载体中的lunasin基因片段连入dts1001表达载体中，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；对重组质粒进行酶切验证，测序；

2)将lunasin基因转入大豆基因组：

将包含lunasin基因的重组质粒通过电击转化农杆菌，测序鉴定后选取阳性菌株转化大豆，提取大豆基因组，pcr鉴定验证阳性转基因大豆，胶回收进行测序。

优选地，上述技术方案中，所述引物包含上游引物和下游引物，其中：

上游引物:cgagctcatgtccaaatggcagcaccagc；

下游引物:ggggtacctcagtcgtcgtcatcatcatc。

优选地，上述技术方案中，所述方法还包括：3)转基因大豆中lunasin的表达检测。

优选地，上述技术方案中，所述步骤3)具体包括：31)试剂盒提取大豆rna；32)反转录为cdna；以及qrt-pcr检测转基因大豆中lunasin的表达量。

优选地，上述技术方案中，所述步骤31)具体为：

(1)取500μl裂解液rltplus2，转入1.5ml离心管中，加入50μlplantaid混匀备用；

(2)液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有rltplus2和plantaid的离心管,立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解；

(3)将裂解物12000rpm离心5-10分钟，将所有裂解物上清转移至一个基因组dna清除柱中，12000rpm离心30～60秒，收集滤液；

(4)向收集的滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇，立即吹打混匀，将混合物加入一个吸附柱ra中，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；

(5)向吸附柱ra中加500μl去蛋白液rw1，室温放置30秒，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；

(6)向吸附柱ra中加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液rw，重复一遍；

(7)将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液；

(8)取出吸附柱ra，放入一个rnasefree离心管中，加30-50μlrnasefreewater，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集用于下一步实验。

优选地，上述技术方案中，所述步骤32)具体为：将rna模板和引物混合，65℃金属浴孵育5min后，立即置于冰上冰浴2min，加入其它反应试剂；42℃孵育15min后，85℃加热5s，反转录完成。

优选地，上述技术方案中，所述步骤33)具体为：反转录结束后，将cdna稀释10倍，用于qrt-pcr，分析lunasin在不同转基因系中的表达情况。

一种lunasin多肽过表达的大豆，所述大豆是根据上述任一所述的提高lunasin多肽在大豆中表达量的方法获得的。

一种lunasin多肽过表达的大豆的提纯方法，包括以下步骤：

1)将上述放放获得的含lunasin多肽的大豆置于预冷的研钵中，加入液氮进行充分研磨，至粉末状；

2)加入pbs缓冲液，低温条件下震荡提取48h；

3)将混合物12000g离心30min，收集上清液，用10kd和3kd孔径的截留柱超滤纯化上清液；

4)将收集到的浓缩液经真空冷冻干燥，得高纯的lunasin多肽。

一种lunasin多肽过表达的大豆在功能食品中的应用。

优选地，上述技术方案中，应用于制备抗氧化性食品、抗炎性食品以及抗癌性食品。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

1、通过本申请的方法已获得稳定遗传的转lunasin大豆，并通过qrt-pcr检测和westernblot印记杂交分析，表明lunasin在大豆中成功表达，而且在转lunasin大豆中的lunasin表达明显升高；

2、对获得的大豆中的lunasin进行分离纯化，经uplc-ms/ms和酶联免疫方法鉴定lunasin在大豆中的含量分别为1.44mg·g-1(wt)，2.14mg·g-1(l12)，1.66mg·g-1(l43)，2.62mg·g-1(l45)；

3、进行抗氧化活性分析，表明过表达lunasin的大豆多肽提取物抗氧化性明显高于野生型大豆；

4.lps诱导的炎症反应中，过表达lunasin的大豆多肽提取物抗炎活性明显高于野生型大豆；

5.抗癌活性分析表明，过表达lunasin的大豆多肽提取物对人乳腺癌细胞mb-mda-231无毒性，且可以显著抑制癌细胞mda-231的增值生长。

附图说明

图1为转基因大豆的获得及其分子鉴定，其中1a为构建dts1001植物表达载体图；1b为通过农杆菌介导法将lunasin基因整合入大豆基因组；1c为用eps-f/eps-r为上下游引物进行pcr验证；1d为荧光定量检测图；1e为大豆蛋白sds-page分析图；图1f为westernblot印记杂交结果图。

图2为lunasin标准品图，其中2a为lunasin标准品色谱图；2b为lunasin标准品质谱图。

图3为大豆lunasin提取物样品的图，其中3a为色谱图；3b为质谱图。

图4a为lunasin标准品进行系列浓度稀释的标准曲线图。

图4b为大豆lunasin提取物样品进行倍比稀释后的lunasin含量图。

图5a为let对dpph自由基的清除活性。

图5b为lew对abts+自由基的清除活性。

图5c为let的orac值图。

图6a为let、lew样品在系列浓度梯度(0.25-4g·l-1)范围内对小鼠巨噬细胞raw264.7毒性图。

图6b为lew对no的抑制率。

图6c为let、lew对il-1的抑制率。

图6d为let、lew对对il-6的抑制率。

图7a为let、lew样品在系列浓度梯度(0.25-4g·l-1)范围内对人乳腺癌细胞mda-231毒性图。

图7b为let、lew对癌细胞mda-231的抑制率对比图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

1.大豆lunasin基因克隆和植物表达载体构建

提取大豆新鲜组织的rna，反转录cdna，以cdna为模板，以iun-f:cgagctcatgtccaaatggcagcaccagc和iun-r:ggggtacctcagtcgtcgtcatcatcatc为上下游引物进行pcr扩增，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳得到lunasin基因片段，回收目的片段，并连接到t载体；得到的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，然后进行测序验证；酶切，连接，将克隆载体中的lunasin基因片段连入dts1001表达载体中，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；对重组质粒进行酶切验证，测序。

2.农杆菌电击转化和大豆遗传转化，将lunasin基因转入大豆基因组

将包含lunasin基因的重组质粒通过电击转化农杆菌，测序鉴定后选取阳性菌株转化大豆，提取大豆基因组，pcr鉴定验证阳性转基因大豆，胶回收进行测序。

大豆基因组的提取利用dna提取试剂盒进行提取。(植物组织基因组dna提取试剂盒-天津生化科技)上下游引物序列为epsps-f：actggttgccgtttgactatg，epsps-r：acccataacgaggaagctcat；pcr反应体系为20ul.

pcr扩增程序为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃45s；72℃10min；30个循环。

3.转基因大豆中lunasin的表达检测

3.1试剂盒提取大豆rna

(1).取500μl裂解液rltplus2(已加入β-巯基乙醇)，转入1.5ml离心管中，加入50μlplantaid混匀备用；

(2).液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有rltplus2和plantaid的离心管,立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解；

(3).将裂解物12000rpm离心5-10分钟，将所有裂解物上清转移至一个基因组dna清除柱中，12000rpm离心30～60秒，收集滤液；

(4).向收集的滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇，立即吹打混匀，将混合物加入一个吸附柱ra中，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；

(5).向吸附柱ra中加500μl去蛋白液rw1，室温放置30秒，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；

(6).向吸附柱ra中加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液rw，重复一遍；

(7).将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液；

(8).取出吸附柱ra，放入一个rnasefree离心管中，加30-50μlrnasefreewater，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集用于下一步实验。

3.2反转录为cdna

反应体系：

将rna模板和引物混合，65℃金属浴孵育5min后，立即置于冰上冰浴2min，加入其它反应试剂。42℃孵育15min后，85℃加热5s，反转录完成。

3.3qrt-pcr检测转基因大豆中lunasin的表达量

反转录结束后，将cdna稀释10倍，用于qrt-pcr，分析lunasin在不同转基因系中的表达情况.

荧光定量程序：

holdingstage：50℃1min，95℃1min；

cycllingstage：95℃15s，55℃15s，72℃45s，45个循环；

meltcurvestage：95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s；

荧光定量体系：

4.提取转lunasin大豆蛋白，分离纯化lunasin，uplc-ms/ms鉴定大豆中的lunasin：

取转基因大豆于预冷的研钵中，加入液氮进行充分研磨，至粉末状，然后加入pbs缓冲液，低温条件下震荡提取48h。将混合物12000g离心30min，收集上清液，用10kd和3kd孔径的截留柱超滤纯化上清液，将收集到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到高纯的lunasin多肽。最后将分离纯化的lunasin提取物let(lunasinextractsfromtransgenicsoybean)溶于超纯水中。

与此类似，将野生型大豆进行研磨，超滤，分离纯化出相同分子量大小的lunasin多肽lew(lunasinextractsfromwildtypesoybean)。

取适量let和lew进行westernblot，检测lunasin的表达情况。let，lew经uplc-ms/ms进行检测，鉴定大豆中的lunasin。uplc连接sciextripletof6600质谱仪，该仪器在离子电喷雾电离模式下进行一级，二级碎片扫描。分离柱为cshc18(1.7μm,2.1mm×100mm)，流速为0.2ml/min,a相为0.1％甲酸水溶液，b相为0.1％甲酸乙腈。流动条件为：2分钟95％a，15分钟65％a，18分钟20％a，23分钟20％a，24分钟95％a，30分钟95％a。根据样品的一级，二级质谱信号鉴定lunasin。

5.酶联免疫法检测转基因大豆中lunasin含量，lunasin标准品进行系列浓度稀释(0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100及200ng·ml^-1)。

(1)抗原包被：于96孔板中加入每孔100μl包被液(含样品)，37℃孵育2小时。

(2)封闭：倒去抗原，每孔加入100μl封闭液[pbst(0.05％tween-20)，5％脱脂奶粉，ph＝7.2]。37℃孵育1小时。倒去封闭液，pbst洗板3次。

(3)孵育一抗：加入每孔100μl的一抗，稀释度为1：1000。37℃孵育1小时。倾去一抗，pbst洗板3次。

(4)孵育二抗：每孔加入二抗稀释液100μl(hrp标记羊抗兔1：5000)，37℃孵育45min。洗板3次，同上。

(5)显色：加入每孔100μl的tmb底物(现用现配)，室温孵育5-20分钟。

(6)终止：加入每孔100μl的终止液(2mh2so4)终止显色。

(7)在酶标仪上读取450nm的吸光度，计算lunasin含量。

6.抗氧化性检测

自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制。自由基的清除能力是通过检测在简化的“无脂”体系中潜在的抗氧化剂提供的氢或者电子向自由基迁移的能力。通过检测let(lunasinextractsfromtransgenicsoybeanlinesl12、l43andl45)，lew(lunasinextractsfromwildsoybean)的abts+，dpph，氧自由基清除能力来评估转基因大豆中lunasin多肽的抗氧化性。

6.1abts+自由基清除实验

配制适量的abts+储备液(7.4mmol/l)，abts+储备液与k2s2o8储备液(2.6mmol/l)等体积混合，制成abts+高浓度工作液，室温避光存放12–16h，使用前用80％乙醇进行稀释，稀释后的abts+工作液的吸光度值减去乙醇空白对照的吸光度值后，a734要求在0.7±0.05范围内。将let，lew配置成0.5、1、2、4、8g·l-1系列梯度浓度，将样品溶液与abts+工作液混匀于96孔板中，反应5min，测定734nm处吸光值。实验以trolox(0.3mmol/l)作为阳性对照，空白组包括样品空白组和试剂空白组，每个实验组重复三次。按下式计算abts的清除率：abts+清除率(％)＝[1－(at－b)/a0]×100％，at：样品反应后的吸光度值；b：样品空白组的吸光度值；a0：试剂空白组的吸光度值。

6.2dpph自由基清除实验

将let，lew配置成0.5、1、2、4、8g·l-1系列梯度浓度，将dpph溶液(2×10-4mol/l)，与样品等体积充分混合，测定517nm处吸光度值ai，室温避光保存30min后再在517nm处测定其吸光度aj，对照试验为只加dpph的乙醇溶液，其吸光值记为ac。按下式计算dpph的清除率：k(％)＝[1-(ai-aj)/ac]*100％

6.3氧自由基清除实验

orac(oxygenradicalabsorbancecapacity)，氧化自由基吸收能力又称为抗氧化能力指数。orac分析方法是根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化原理，以维生素e水溶性类似物trolox为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析。荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时，它可以抑制由自由基引起的荧光变化。抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力。

将let，lew配置成0.1、0.25、0.5、1、2g·l-1系列梯度浓度，配置适合浓度的荧光钠溶液(4125mmol/l)和aaph(153mmol/l)溶液。将100ul荧光钠稀释液与50ul样品混匀于96孔荧光板中，振荡5min，37℃温育10min后迅速加入50ulaaph液启动反应，以激发波长485nm，发射波长535nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔2min测定一次荧光值(记为fn)。orac实验需要设定两种对照,即没有添加自由基的fl荧光自然衰减对照(-aaph)和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(+aaph)。orac值以trolox当量(μmoltrolox当量/μmol，μmoltrolox当量/ml及μmoltrolox当量/mg)表达，其计算公式为：orac值＝[(aucsample-auc+aaph)/(auctrolox-auc+aaph)]×(molarityoftrolox/molarityofsample)

7.抗炎性检测

一氧化氮，作为一种多功能的内源性气体信号分子，具有重要的生理和病理功能。no的合成是巨噬细胞被激活的重要标志。巨噬细胞被激活后可迅速表达il-6、tnf-α以及il-1等细胞因子来介导宿主细胞免疫，一定浓度的no、il-6、tnf-α以及il-1表达对机体的免疫具有积极意义。然而若机体产生过量的no、il-6、tnf-α以及il-1，便会引发炎症反应，造成组织细胞病理损伤。本研究通过分析let，lew对lps引发的炎症反应的抑制能力来评估转lunasin大豆中lunasin多肽的抗炎活性。

小鼠巨噬细胞raw264.7在rp1640培养基置恒温培养箱中(37℃,5％co2,饱和湿度)培养，当培养细胞铺满整个培养瓶的底面积70-80％时(处于对数生长期)，用细胞刮收取对数生长期的raw264.7细胞，转移至离心管中，1000rpm，离心5分钟，将密度调整为2.5×106个/ml，按照100μl/孔，接种于96孔细胞培养板，设置三组实验，分别加入100μl不同浓度的样品(样品组)，lps(阳性对照组)，培养基(空白对照组)，加入完成后，96孔板放入培养箱培养2小时，之后，除空白对照组，其他两组均加入lps，培养24小时后，测定上述各组中上清液no浓度。il-6、tnf-α以及il-1表达量的测定参考bdpharmingen公司酶联免疫试剂盒进行测定。

8.抗增殖活性检测

人乳腺癌细胞mda-231细胞是广泛应用于癌症机理研究、遗传学和营养学等方面的一类细胞株。细胞毒性试验采用亚甲基蓝染色法，即将mda-231细胞悬液接种于96孔细胞培养板上(要求每孔的细胞数达到4×104个)，每孔加入100μl培养液，37℃下培养24h，待细胞贴壁生长后，每孔加入100μl不同浓度的样品(样品组)，lps(阳性对照组)，培养基(空白对照组)，37℃下培养24h后，去除上清液，用pbs清洗每个孔后去除溶液，每孔加入50μl亚甲基蓝着色液，置于37℃下培养1h。取出96孔细胞培养板，去除染色液，浸入去离子水中洗板6次直到去离子水变清澈透明。甩干细胞培养板中的去离子水，每孔加入100μl洗脱缓冲液，在平板振荡器上振荡20min，570nm下用酶标仪测定其吸光度值，比较不同浓度的样品与对照的区别。

抗增殖作用采用mda-231细胞亚甲基蓝比色测定方法，将mda-231细胞悬液接种于96孔细胞培养板上(要求每孔的细胞数达到2.5×104个)，96孔细胞培养板外围四周的孔不加细胞悬液，仅加入100μl不含细胞的培养液，其目的是用于和内部加入悬液的孔进行空白对照。内部每孔加入100μl培养液，37℃下培养4h，使细胞完全贴壁生长。去除上清液，每孔加入100μl含不同浓度的样品(样品组)，lps(阳性对照组)，培养基(空白对照组)，放置于37℃下培养培养96h。取出96孔细胞培养板，去除染色液，浸入去离子水中洗板6次直到去离子水变清澈透明。甩干细胞培养板中的去离子水，每孔加入100μl洗脱缓冲液，在平板振荡器上振荡20min，570nm下用酶标仪测定其吸光度值。每个样品至少做3次平行，以半最大效应浓度(ec50)来判定细胞的抗增殖作用。

结果分析：

1.以大豆lunasincdna序列为模板，设计特异性引物，通过pcr扩增获得目的序列，然后构建dts1001植物表达载体(图1a)，通过农杆菌介导法将lunasin基因整合入大豆基因组中(图1b)，提取大豆基因组dna，以大豆dna为模板，用eps-f/eps-r为上下游引物进行pcr验证，结果与预期相符(图1c)，表明lunasin基因已成功整合入大豆基因组中，选取了3个转基因株系l12、l43和l45进行后续实验。

2.提取转lunasin大豆总rna，反转录cdna，以cdna为模板，进行实时荧光定量检测(图1d)，测定lunasin在各个转基因系中的表达情况。结果显示，lunasin在野生型大豆和转基因大豆中均有表达，但转基因大豆中lunasin的表达量显著提高，表明在大豆中过表达lunasin确实提高了其在转录水平的表达。

3.提取大豆总蛋白，经过分离纯化得到了富含lunasin的多肽化合物，westernblot印记杂交结果显示(图1f)，lunasin多肽在野生型大豆和转基因大豆中成功表达，而且与转录水平的结果一致，转基因大豆中lunasin多肽蛋白表达量显著上升，表明通过转基因技术确实提高了大豆中lunasin多肽的产量。采用uplc-ms-ms检测大豆中的lunasin，lunasin标准品的色谱图[m+7h]7+为718.90，[m+5h]5+为1006.45，[m+4h]4+为1257.39，在保留时间12.893min时中出峰(图2)，分子量为5kd左右，这与之前报道的研究相符.样品中lunasin提取物中物质成分较多，峰图较复杂(图3)，但也可检测到母离子峰为838.54的峰图，同位素之间带有6个电荷，结果表明lunasin多肽在大豆中成功表达。

4.通过酶联免疫的方法检测大豆样品中lunasin含量。lunasin标准品进行系列浓度稀释(0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100及200ng·ml-1)，标准曲线为y＝00.63x+0.0342r2＝0.998(图4a)。样品进行倍比稀释(1：1024)，检测lunasin含量，结果表明过表达lunasin提高了lunasin含量(图4b)，lunasin在野生型和转基因大豆中的含量分别为1.44mg·g-1(wt),2.14mg·g-1(l12),1.66mg·g-1(l43),2.62mg·g-1(l45).

5.通过检测let，lew的abts+自由基清除能力，dpph自由基清除能力，氧自由基清除能力(orac)来评估转基因大豆中lunasin多肽的抗氧化性。

在dpph自由基测定中，let-l12，let-l43，let-l45dpph自由基清除活性(ic50值为4g·l-1)明显高于野生型lew，其dpph自由基清除活性显示ic50值为6.95g·l-1(图5a)；在abts+自由基测定中，let-l12，let-l43，let-l45的ic50值分别为4.68，4.46，4.61g·l-1；而lew的abts+自由基清除活性明显较低，ic50值为5.38g·l-1(图5b)。此外，在orac分析中，let的orac值也明显高于lew(图5c)。结果表明，转基因大豆中lunasin多肽提取物抗氧化性高于野生型大豆中lunasin多肽提取物，呈差异显著。

6.通过分析let，lew对lps诱发的raw264.7内no、tnf-α,il-1和il-6过量表达的抑制能力来评估转基因大豆中lunasin多肽的抗炎活性。

研究表明，let、lew样品在系列浓度梯度(0.25-4g·l-1)范围内对小鼠巨噬细胞raw264.7无毒性(图6a)。且小鼠巨噬细胞raw264.7在经过lps刺激之后，细胞内no,il-1和il-6表达量显著升高，但这种上调可明显被let，lew抑制，且let抑制效果明显强于lew。研究结果表明，在let、lew浓度均为1g·l-1时，let对no的抑制率为47.5％，而lew对no的抑制率为30％(图6b)。在细胞因子的测定中，let、lew(浓度均为1g·l-1)对il-1的抑制率分别为85.1％，74.7％(图6c)；对il-6的抑制率分别为43.1％，27.56％(图6d)。上述结果表明，在lps诱导的炎症反应中，转lunasin大豆多肽提取物抗炎性明显高于野生型大豆。

7.通过分析let、lew对人乳腺癌细胞mda-231的抗增值活性来检测大豆lunasin提取物的抗癌活性。研究表明，let、lew样品在系列浓度梯度(0.25-4g·l-1)范围内对人乳腺癌细胞mda-231无毒性(图7a)。在抗增值实验中，let、lew可显著抑制人乳腺癌细胞mda-231的增值生长；然而，let的抑制活性明显高于lew，在浓度为4g·l-1时，let对癌细胞mda-231的抑制率为43％，而lew对癌细胞mda-231的抑制率为23.8％(图7b)。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。