本发明涉及一种葡萄糖酸盐响应元件及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术：
在枯草芽孢杆菌代谢工程领域，响应某种外源添加物质的诱导表达元件，广泛应用于代谢调控等方向。目前，常用于枯草芽孢杆菌中的诱导启动子，有木糖诱导启动子pxyl和iptg诱导启动子pgrac。但是，木糖诱导启动子pxyl存在木糖价格昂贵的问题，iptg诱导启动子pgrac，存在iptg价格昂贵，以及对细胞存在一定毒性的问题。葡萄糖酸盐作为一种简单碳源，价格低廉，且对细胞无毒，是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子，可以获得枯草芽孢杆菌的诱导响应元件。然而，天然葡萄糖酸盐诱导启动子表达水平较低，远低于木糖和iptg诱导启动子。同时，不同表达强度的诱导启动子文库在代谢工程领域有重要应用，可满足不同的代谢调控需求，而目前缺少不同表达强度的葡萄糖酸盐诱导启动子文库。以上因素，严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，实现优化葡萄酸盐响应元件表达强度，本发明以组成型启动子psrfaa、phbs、pveg、pytxg、pphrk、pminc，分别整合转录调控蛋白gntr结合序列atacttgtatacaagtatact，构建启动子文库，实现以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168为宿主时，添加葡萄糖酸盐后，达到不同诱导表达强度。
本发明的第一个目的是提供一种响应葡萄糖酸盐的诱导表达元件文库；所述元件含有第一启动子、转录调控蛋白gntr、第二启动子、转录调控蛋白gntr结合序列；所述第一启动子表达转录调控蛋白gntr，所述第二启动子整合转录调控蛋白gntr结合序列；所述第一启动子和第二启动子的转录方向相反；所述转录调控蛋白gntr结合序列为atacttgtatacaagtatact(如seqidno.3所示)。
在本发明的一种实施方式中，所述第一启动子为pyvyd启动子。
在本发明的一种实施方式中，所述第二启动子包括psrfaa、phbs、pveg、pytxg、pphrk、或pminc。
在本发明的一种实施方式中，所述元件还包括标记物。
在本发明的一种实施方式中，所述标记物包括但不限于绿色荧光蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述组成型pyvyd启动子核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白gntr的氨基酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，以质粒pht为骨架，将所述第一启动子、转录调控蛋白gntr、整合转录调控蛋白gntr结合序列的第二启动子连接在质粒上。
在本发明的一种实施方式中，用于构建所述元件的质粒为pht01(核苷酸序列如seqidno.4所示)。
在本发明的一种实施方式中，组成型不同强度组成型启动子psrfaa、phbs、pveg、pytxg、pphrk、pminc的碱基序列分别为seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10。
在本发明的一种实施方式中，不同强度组成型启动子psrfaa、phbs、pveg、pytxg、pphrk、pminc，整合转录调控蛋白gntr结合序列atacttgtatacaagtatact后的碱基序列分别为seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15和seqidno.16。
在本发明的一种实施方式中，编码gntr启动子的核苷酸序列为seqidno.18。
本发明的第二个目的是提供一种构建所述葡萄糖酸盐响应元件文库的方法，包括如下步骤：
1)构建gntr启动子质粒pht-ck：克隆编码pyvyd启动子基因片段(seqidno.1所示)、编码gntr的基因片段、编码gntr启动子的基因片段(seqidno.18所示)和编码gfp的基因片段，以及质粒pht01的基因片段(seqidno.4所示)，共5个片段通过nebgibsonassemblymastermixkit进行组装，构建葡萄糖酸响应元件工具质粒pht-ck质粒。
2)构建优化葡萄糖酸响应元件文库：克隆含有转录调控蛋白gntr结合序列atacttgtatacaagtatact的组成型启动子psrfaa、phbs、pveg、pytxg、pphrk、pminc，分别替换pht-ck质粒中gntr原始启动子，通过nebgibsonassemblymastermixkit进行组装，构建葡萄糖酸响应元件文库。
本发明的第三个目是提供含有所述响应葡萄糖酸盐的诱导表达元件的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。
本发明的第四个目的是提供一种优化葡萄糖酸盐诱导表达元件文库在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括以文库中的高表达强度的元件表达目的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括以文库中的低表达强度的元件调控必须基因的表达，使之在完成正常代谢的同时不积累副产物。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括以高表达强度的元件激活合成途径关键基因，使之在特定时间可以被高强度启动。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，诱导表达元件激活强度是在含有葡萄糖酸盐的培养环境中，35～37℃，160～250rpm，培养至少24h。
有益效果：(1)本发明通过强启动子pyvyd表达转录调控蛋白gntr，并通过优化碱基序列的gntr原始启动子关联绿色荧光蛋白gfp，获得了葡萄糖酸盐诱导表达启动子元件pht-ck。
(2)在葡萄糖酸盐诱导表达启动子元件pht-ck的基础上，通过将原始gntr启动子，更换为组成型启动子psrfaa、phbs、pveg、pytxg、pphrk、pminc，并整合转录调控蛋白gntr结合序列atacttgtatacaagtatact，获得优化的葡萄糖酸盐诱导表达元件文库。优化后的启动子表达强度为32000a.u.，与枯草芽孢杆菌中p43强启动子强度相近(约35000a.u.)，高于木糖诱导启动子(约5000a.u.)和iptg诱导启动子(约25000a.u.)。
(3)本发明提供的优化葡萄糖酸响应元件的6个启动子文库，其在枯草芽孢杆菌中，激活表达强度范围为2000～32000a.u.。葡萄糖酸盐诱导表达启动子元件在无葡萄糖酸盐存在条件下的泄漏表达水平仅为2％左右。为进一步通过基因工程，改造枯草芽孢杆菌葡萄糖酸盐诱导表达启动子奠定了基础。
具体实施方式
含葡萄糖酸盐诱导表达启动子元件的枯草芽孢杆菌培养条件：
发酵培养基(g/l)：葡萄糖酸钠60，胰蛋白胨6，酵母粉12，硫酸铵6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁3。
培养条件：37℃、200rpm，条件下培养48h。
绿色荧光蛋白和菌体浓度检测方法：
tecan酶标仪：绿色荧光蛋白检测，激发波长490nm，发射波长530nm，增益60。菌体浓度检测波长为600nm。
实施例1构建葡萄糖酸响应元件工具质粒pht-ck
设计引物pht-f：5’-ttcacgtcacgcgtccatggagatcttt-3’和pht-r：
5’-gagctcgaattcactggccgtcgtt-3’，以pht质粒为模板，扩增pht质粒片段(seqidno.4所示)；设计引物gntr-f：
5’-aacgacggccagtgaattcgagctcctagtcattgttgtattcagctccttttgcca-3’和gntr-r：
5’-aaaggaggtgaaatgtacacatgctagactccaaagacctgttgtatccc-3’，以优化密码子并基因合成后片段为模板，扩增gntr基因序列；设计引物pgntr-f：
5’-tgtgaaagcaatatggtaaaaatttaaataaaaattagaaatgaaagtgtttgaca-3’和pgntr-r：
5’-ccagtgaaaagttcttctcccttacccatacactcaccttcctcactcaagga-3’以枯草芽孢杆菌168基因组为模板扩增gntr原始启动子序列；合成编码gfp的基因序列。
通过nebgibsonassemblymastermixkit进行组装，构建葡萄糖酸响应元件工具质粒pht-ck质粒。
实施例2构建葡萄糖酸盐诱导编导元件枯草芽孢杆菌bs-pht-ck
将上述步骤中pht-ck质粒转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为bs-pht-ck。
实施例3构建优化葡萄糖酸响应元件文库
设计引物pht-ty-f:5’-aaaggaggtgaaatgtacacatgggtaagggagaagaacttttcactgga-3’和pht-ty-r:5’-tttcacaaaagatttatgtttcagcaggaattgtaaagggt-3’以pht-ck质粒为模板扩增质粒骨架片段；设计引物5’-tcctgctgaaacataaatcttttgtgaaaaggatcaaggaataggatgaaaaaagga-3’和5’-ccatgtgtacatttcacctcctttgaatgtttgtccaacaagtatacttgtataca-3’，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增phbs启动子序列；设计引物5’-ctgaaacataaatcttttgtgaaatttggcttcaaaagcgtttaaagtgttgcatacaa-3’和5’-gtgtacatttcacctcctttaaggagtatacttgtatacaagtatttcgtcaaaaaaagataaaatcctttttactcatct-3’，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增pminc启动子序列；设计引物5’-gaaacataaatcttttgtgaaatagaagcaattgatattgcaaaagaaacaaaagatga-3’和5’-gtgtacatttcacctcctttggatgaaggagtatacttgtatacaagtattctccattaatatgagtctttcctgtgct-3’，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增pphrk启动子序列；设计引物5’-cctgctgaaacataaatcttttgtgaaagacgctcttcgcaagggtgtct-3’和5’-gtgtacatttcacctcctttataagtatacttgtatacaagtatagtttaaatgaaaaaaatgtttttatcaccgaaaaat-3’，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增psrfaa启动子序列；设计引物5’-tgaaacataaatcttttgtgaaatatgggaagtgctccgtaatacgctgaca-3’和5’-gtgtacatttcacctcctttagtatacttgtatacaagtatattgtacaacacgagcccatttttgtcaaataaaat-3’，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增pveg启动子序列；设计引物5’-aaacataaatcttttgtgaaagatcggtgatctccagggaaaaattcataatgcca-3’和5’-gtgtacatttcacctcctttaaggagtatacttgtatacaagtatacccgttttcttcaatcataaacatgtgtact-3’，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增pytxg启动子序列。
以上启动子片段，分别和质粒骨架，通过nebgibsonassemblymastermixkit进行组装，构建优化葡萄糖酸响应元件分别命名为：pht-hbs、pht-minc、pht-phrk、pht-srfaa、pht-veg、pht-ytxg。
实施例4构建优化葡萄糖酸盐诱导表达元件枯草芽孢杆菌
将上述步骤中pht-hbs、pht-minc、pht-phrk、pht-srfaa、pht-veg、pht-ytxg质粒，分别转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，分别命名为bs-pht-hbs、bs-pht-minc、bs-pht-phrk、bs-pht-srfaa、bs-pht-veg、bs-pht-ytxg。
实施例5枯草芽孢杆菌bs-pht-ck添加葡萄糖酸钠诱导发酵
将按照实施例2的方法制备的菌株bs-pht-ck于37℃、200rpm下，在含有60g/l葡萄糖酸钠的发酵培养基中培养48h。最终测定发酵液绿色荧光蛋白强度为3000a.u.，获得表达强度的葡萄糖酸盐诱导表达元件。当发酵培养基中不添加葡萄糖酸钠时，发酵48h，发酵液绿色荧光蛋白强度为600a.u.，泄漏表达量为2％。
调整发酵培养基中葡萄糖酸钠浓度为3～30g/l，分别将实施例2的方法制备的菌株bs-pht-ck于37℃、200rpm下培养，测定应该蛋白强度，结果显示，加入不同浓度葡萄糖酸钠，瞬时激活表达强度与60g/l葡萄糖酸钠诱导下发酵48h的表达强度处于相同水平。
实施例6枯草芽孢杆菌bs-pht-hbs、bs-pht-minc、bs-pht-phrk、bs-pht-srfaa、bs-pht-veg、bs-pht-ytxg添加葡萄糖酸钠诱导发酵
将按照实施例4的方法制备的菌株bs-pht-hbs、bs-pht-minc、bs-pht-phrk、bs-pht-srfaa、bs-pht-veg、bs-pht-ytxg于37℃、200rpm下，在含有60g/l葡萄糖酸钠的发酵培养基中培养48h。最终测定发酵液绿色荧光蛋白强度分别为bs-pht-phrk2000a.u.、bs-pht-minc6000a.u.、bs-pht-ytxg10000a.u.、bs-pht-veg12000a.u.、bs-pht-hbs25000a.u.、bs-pht-srfaa32000a.u.，获得葡萄糖酸盐响应强度范围为2000～32000a.u.的诱导启动子文库。
对比例1：不同启动子对诱导表达元件调控效果的影响
按照实施例1～4相同策略构建表达元件文库，选取pyvyd启动子、podha启动子、pyrxa启动子、pphrg启动子、pphrf启动子和plytr启动子，共6个启动子整合gntr结合序列，结果显示，pyvyd启动子、plytr启动子和podha启动子，不能被葡萄糖酸盐激活表达，而pyrxa启动子、pphrg启动子和pphrf启动子，激活强度都低于1000a.u.，不足以应用到代谢工程等领域。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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