一种人工设计合成的Bt抗虫基因JBT-FD及其应用的制作方法

本发明属于抗虫基因工程育种领域，具体涉及一种人工合成的bt抗虫基因jbt-fd及其应用。

背景技术：

农业害虫是农业可持续发展的一个重要限制因素，尤其是玉米，它是我国的重要粮食作物和经济作物，生产周期长，虫害损失大。我国目前治理虫害的主要方法是喷施农药或生物杀虫剂，但此方法不仅造成严重的环境污染，导致害虫的抗药性增强，破坏植被低层生态平衡，而且农产品还会存在对人体有害的大量农药残留。因此绿色高效的基因工程技术已成为当前植物抗虫研究的重要途径。研究和开发外源抗虫基因并通过基因工程将其导入作物，无论是理论上还是经济上都有重大意义。但是随着转基因抗虫玉米种植规模不断扩大，转基因抗虫玉米仍然存在很多问题。抗虫范围相对较小，而危害玉米的害虫极多，玉米害虫逐渐对抗虫玉米产生抗性。

苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiesis，bt)的毒蛋白基因，简称bt基因。在芽孢形成时，该基因编码的δ-内毒素(δ-endotoxin)，也称杀虫晶体蛋白或晶体毒素，对直翅目、膜翅目、鳞翅目、双翅目、同翅目、鞘翅目和食虫目等多种昆虫以及原生动物、线虫、螨等具有特异性的杀灭作用。

经过近一个世纪的研究，目前共报道了500多个bt杀虫蛋白，依据杀虫作用方式将其分为四个类型：含有三个结构域cry杀虫蛋白；杀蚊毒素蛋白(mtx)和binary-like毒素蛋白(bin)；溶细胞毒素蛋白(cyt)；营养生长杀虫蛋白(vip)。cry杀虫晶体蛋白发现最早、杀虫机理研究最透彻、在生物制剂和植物基因工程领域中应用最广，并已在生产应用中取得了巨大的社会、经济和生态效益。cry蛋白家族的三维结构典型特征是含有明显能区分出来的三个domain，即domaini、domainii、domainiii。domaini由7个α螺旋组成，是杀虫蛋白发挥功能的主要区域，参与了杀虫蛋白低聚物形成和插入细胞膜形成穿孔导致细胞死亡的过程，domainii由β折叠组成3个loop环，主要参与杀虫蛋白与受体结合。domainiii由β折叠组成轮状拓补结构，主要参与杀虫蛋白与受体的识别，是不同btcry蛋白识别不同害虫的主要功能区域，domainii和domainiii共同决定靶标害虫的类型。

植物抗虫基因工程在30多年的发展历程中已经取得了丰硕的科研成果，转基因抗虫棉花、玉米、水稻、番茄、马铃薯和杨树等在农林业的广泛种植，说明这项技术在逐步走向成熟。但仅用自然界的bt基因做抗源可造成抗虫的遗传基础较狭窄，仍然存在很多问题。抗虫基因表达量不高是研究过程中普遍存在的问题，昆虫抗性是植物抗虫转基因工程中存在的严重，目前抗虫基因已广泛应用于农林业生产中，昆虫抗性问题也随之显现。探索新型高效的抗虫基因、明确其抗虫机制，增强抗虫基因的遗传表达稳定性，避免或减缓敏感昆虫抗性，将是植物抗虫基因工程未来的发展方向。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人工合成的bt抗虫基因jbt-fd。

本发明的第二个目的是提供人工合成的bt抗虫基因jbt-fd在制备抗虫植物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种人工合成的bt抗虫基因jbt-fd，所述bt抗虫基因jbt-fd的核苷酸序列用seqidno1所示。

上述的人工合成的bt抗虫基因jbt-fda在制备抗虫植物中的应用。

本发明的优点：人工合成的bt抗虫基因jbt-fd较其密码子优化前更容易获得高表达的转基因植株。该基因可在转基因玉米中稳定遗传和表达，且表达量高，所得转基因玉米抗虫性好。

附图说明

图1.jbt-fd基因设计过程

图2.jbt-fd基因的植物表达载体

图3.转jbt-fd基因的玉米rt-pcr检测结果

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所用方法如果没有特别的说明，均为常规方法，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。

c58农杆菌感受态购自武汉淼灵生物科技有限公司；含有基因bar的质粒pcambia3301购自武汉淼灵生物科技有限公司。

实施例1jbt-fd新基因的设计改造

本发明是在苏云金芽孢杆菌中所发现的对鳞翅目害虫有特异杀虫活性的杀虫晶体蛋白基础上，根据苏云金芽孢杆菌cry1ac蛋白和cry4aa不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对两种蛋白对应的密码子及编码框进行了优化改造，分别命名为cry1ac-j和cry4aa-j。接着将cry1ac-j的domainiii与cry4aa-j的domaini和domainii进行融合(见图1)，获得一条新的基因，命名为jbt-fd。基因序列如seqidno：1所示。

实施例2jbt-fd基因的植物表达载体构建

按照实施例1的方案我们设计合成了jbt-fd基因，同时在基因的5’端添加了bamhi的酶切位点，3’端添加了sali的酶切位点。用bamhi、sali对jbt-fd基因进行酶切，并回收jbt-fd基因片段，然后与bamhi、sali酶切过得的已有植物表达载体pcambia3301进行连接，得到含有jbt-fd基因的植物表达载体pcambia3301-jbt-fd(见图2)。

实施例3抗虫基因jbt-fd转化农杆菌。

实验中所用的农杆菌为c58菌株，重组质粒载体pcambia3301-jbt-fd上构建有筛选基因bar。将保存的c58农杆菌感受态从-80℃冰箱拿出100μl，放在冰上，取出3μlpcambia3301-jbt-fd质粒与农杆菌100μl混匀，冰浴15min，放入冰上预冷的电击杯中，1500v，电击转化。将菌液吸入1.5ml离心管中，加入400μlyep液体培养基，于28℃振荡培养3h，6000r/min，28℃，离心收集菌体，弃300μl上清，重悬菌体，涂板于28℃暗培养2天，筛选出转化成功的转化用农杆菌菌株。

实施例4农杆菌侵染液的制备

从平板上挑取转化用农杆菌单菌落接种于yep液体培养基中(含100mg/l卡那霉素)，28℃、180r/min振荡培养过夜，当农杆菌生长至对数生长期时(od600为0.6，20℃，5000r/min离心7min收集菌体，用等体积侵染培养基重悬菌体，得到农杆菌侵染液。yep培养基：10g/l蛋白胨+10g/l酵母提取物+5g/lnacl，ph为7.0。侵染培养基：1/2ms+65g/l蔗糖+36.5g/l葡萄糖+150μmol/l乙酰丁香酮，ph为5.3。

实施例5转抗虫基因jbt-fd玉米的获得。

1玉米芽尖的转化。选取整齐饱满的玉米种子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞消毒12min，无菌水清洗3次后接入发芽培养基，26℃，黑暗条件下培养。待苗长至4-6cm时，在无菌条件下切除幼叶和胚芽鞘以露出芽尖生长点，并用灭过菌的手术刀轻轻划伤用于侵染。将玉米芽尖浸泡在侵染培养基中(含有150μmol/l乙酰丁香酮)并置于真空干燥器中，在50kpa压力下分别侵染20分钟，侵染完后弃去菌液，用无菌滤纸吸去玉米芽尖表面多余的菌液，继续放入发芽培养基中共培养3天。发芽培养基：1/2ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂，ph为5.7。

2转化苗的移栽和筛选。洗去玉米小苗表面的培养基，移入装有珍珠岩和蛭石的花盆中，放于温室培养。待小苗长到5-7cm时将草胺膦溶液喷洒在叶片上进行抗性苗的筛选。

3抗性植株的rt-pcr分子检测。用非转基因植株和转基因植株提取叶片总rna，反转录合成的cdna作为模板，用jbt-fd特异性引物进行扩增，扩增出的片段大小为1770bp。扩增反应程序为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸7min。引物为上游：atgttatctgcttatactat；下游：tgtgaccggtatgaactcaa。产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。如图3所示，泳道1为markeriii，泳道2-5为转基因植株，泳道6为野生型对照，泳道7为质粒pcambia3301-jbt-fd阳性对照。rt-pcr检测结果表明，jbt-fd基因已经成功整合入玉米植物基因组中，表明成功获得了转jbt-fd基因玉米植株。

实施例6转jbt-fd基因玉米植株抗虫性鉴定

将获得的转基因苗种植于温室，并且全生育期不施农药，花后16天观察植株抗虫性，以非转基因的植株作为阴性对照。田间观察时，只要植株上出现叶片有横排小虫孔、苞叶、花丝被蛀食、茎秆、穗柄、穗轴被蛀食等，均认为不抗虫。植株无明显虫害，植株健壮，认为抗虫。统计结果见下表。

注：“+”代表检测为阳性；“-”代表检测为阴性；“有”代表植株上能看到虫的危害症状，如叶片有横排小虫孔、苞叶、花丝被蛀食、茎秆、穗柄、穗轴被蛀食；“无”代表植株没有玉米螟的危害症状。

上述结果表明：29株转jbt-fd基因玉米植株中抗虫植株为23株，抗重率为79.31％，与非转基因玉米植株相比，转jbt-fd基因玉米植株表现为抗虫，且抗虫效果好。