玉米高赖氨酸基因ZmcytMdh4的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记及其应用。

背景技术：

玉米为我国第一大粮食作物，也是重要的饲料、工业原料和能源作物。但玉米营养物质中蛋白质大部分属于胶蛋白，且缺乏人类和单胃动物所需要的必需赖氨酸，这会影响到依赖于玉米产品的人类健康和畜禽生产性能。

以提高赖氨酸含量为目的的优质蛋白玉米（qpm）育种成为解决这一问题的重要途径。opaque类突变体的发现，开启了优质蛋白玉米培育的新篇章。现有的典型高赖氨酸含量玉米突变体包括o2、o7、fl2和zmocd1，这类突变体基因的定位和功能解析，使得基因工程培育高赖氨酸玉米品种成为可能。然而，现有的这类玉米突变体苗期生长弱、为粉质胚乳、产量较低、易感病虫害，给生产和加工带来诸多不便，在很大程度上限制了其应用。

因此，亟需研发、筛选出新的高赖氨酸突变体，并研究突变体相关基因功能，有助于深入了解调控赖氨酸含量的基因网络，从而利用基因的功能分子标记通过基因聚合培育籽粒硬度和产量都较高的优质蛋白玉米。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记及其应用，旨在解决现有高赖氨酸突变体苗期生长弱、为粉质胚乳、产量较低、易感病虫害，无法生产和加工的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选得到一种玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4，其核苷酸序列如seqidno.2所示；该基因编码细胞质苹果酸脱氢酶4，能够影响胚乳淀粉和储藏蛋白的平衡，显著提高赖氨酸含量。

分析得一种玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记，即5’utr的-293bp处a突变为c，该位点及其侧翼的核苷酸序列如seqidno.4所示。

提供一种检测上述的玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记的引物对，其核苷酸序列为：

snp(-293)-bsphi-l：aagcgtcacgccgtctcatg；

snp(-293)-1r：cttgggaatccactgtcacacgc。

分析得一种玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记，即第七个外显子中第59到61位碱基gag的缺失，该位点及其侧翼的核苷酸序列如seqidno.6所示。

提供一种检测上述的玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记的引物对，其核苷酸序列为：

exon7-l：caaggaagaagatggatgcc；

exon7-r：tgctctctgggtgtggtagaat。

将上述玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4或玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记在高赖氨酸含量玉米分子标记辅助选择和聚合育种中应用。

将上述检测玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记的引物对在高赖氨酸玉米育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明的分子标记是基于功能基因内引起表型变异的功能标记开发而得的，该功能标记不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率。

2.可通过回交转育的方法将本发明zmcytmdh4基因导入多个杂交组合的双亲背景中，结合功能分子标记辅助选择，获得赖氨酸含量得到不同程度提高的玉米植株中间材料，为选育发芽率高的优良品系奠定了坚实的物质及技术基础。

3.本发明为zmcytmdh4在高赖氨酸玉米育种中的应用提供了技术支持。

附图说明

图1为zmcytmdh4基因结构及核苷酸多态性信息图；

图中，a为zmcytmdh4基因的定位，b为基因结构及核苷酸多态性；

图2为snp(-293)的dcaps标记图；

图中，1和3表示snp(-293)为a；2和4表示snp(-293)为c；

图3为indel(3-bp)的pcr标记图；

图中，2，4，6，8，10泳道为有利变异；

图4为indel(3-bp)在大刍草及55份自然群体中的核苷酸状态图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：高赖氨酸功能基因的获得

（1）利用高赖氨酸含量玉米突变体与优良自交系郑58构建包含30,000单株的分离群体，获得一个赖氨酸含量显著提高的突变体。

发明人在前期大量的田间育种过程中，筛选到一份籽粒有缺陷表型的突变体材料。然后，将该突变体与优良自交系郑58构建了一套f2分离群体，通过近红外光谱(nearinfraredreflectancespectroscopy,nir)的方法对野生型和突变体的成熟籽粒进行测定，结果显示突变体中的赖氨酸含量显著高于野生型。

（2）通过图位克隆将目的基因定位于玉米第1染色体上约224kb的物理区间内，候选区段内有2个蛋白编码基因。

通过卡方测验，对f2分离群体中的籽粒表型进行统计分析发现，在随机选取的100个f2分离果穗中籽粒表型表现3：1的分离比（野生型：突变体=5494：1833，χ²=0.002<χ²0.05=3.84），表明该突变体是一个单基因控制的隐性突变，且野生型对突变体表现为显性。

首先采用分离群体分组分析法（bulkedsegregantanalysis，bsa），选择分离果穗中的野生型和突变体各10个籽粒，构建成显性池和隐性池。随后用覆盖玉米10条染色体的标记对显性池和隐性池进行筛选，初步将目标区段限定在第一染色体上umc1245和umc2181之间。进一步通过精细定位，利用34080个单株将目标区段限定在c368和indel-98之间，区间长度约为224kb。

通过与已公布b73v4版基因组序列的比较分析发现该区段内含有2个蛋白编码的基因，zm00001d032695和zm00001d032699。

实施例2：高赖氨酸功能基因的筛选

序列分析和玉米遗传转化证明编码细胞质苹果酸脱氢酶4的zmcytmdh4基因是目的基因。

通过在maizegdb（https://www.maizegdb.org/）数据库的查询，发现zm00001d032695编码一个细胞质型的苹果酸脱氢酶。利用crispr/cas9的技术构建敲除载体，送至中国种子集团有限公司进行遗传转化，将分离得到的纯合阳性植株分别与原始突变体和杂合型单株进行等位测验，结果表明zmcytmdh4为目的基因。

zmcytmdh4基因结构及核苷酸多态性信息如图1所示：

图1中的(a)图表示zmcytmdh4基因的定位过程，竖线上方代表用到的分子标记，对应下方斜线左侧数字代表发生重组的单株个数，斜线右侧代表群体数量；(b)图表示突变体和野生型的基因结构及两者之间的差异功能位点。

实施例3：高赖氨酸功能基因zmcytmdh4的分析

（1）突变体中zmcytmdh4的第七个外显子有3-bp的缺失，缺失产生移码突变导致酶活降低，苹果酸积累，赖氨酸含量增加。

对野生型和突变体dna序列和编码序列的测序结果分析，发现在突变体的第七个外显子均存在3-bp的缺失，最终导致突变体中缺失一个氨基酸。随后用原核表达的方法体外纯化了野生型和突变体的蛋白，通过添加不同的底物及对应的辅酶来测定蛋白的催化活性。结果表明，突变体的催化活性几乎丧失。

通过靶向代谢组，测定授粉后12天野生型和突变体籽粒中能量代谢相关物质的变化，结果分析发现突变体中苹果酸和赖氨酸含量均显著升高。同时，测定12dap、20dap和成熟籽粒中苹果酸含量，成熟籽粒中赖氨酸含量，结果均表明突变体中的苹果酸和赖氨酸含量均较野生型显著提高。

（2）根据zmcytmdh4在野生型和突变体中的核苷酸多态性，通过候选基因关联分析获得了5’utr上与赖氨酸含量显著关联的snp(-293)-a/c。

首先针对zmcytmdh4基因全长设计引物并进行测序，获得野生型和突变体在zmcytmdh4中的核苷酸多态性位点。然后利用华中农业大学严建兵课题组（http://www.maizego.org/resources.html）关联群体数据，选择q+k的模型进行关联分析，最终分析结果显示5’utr上的snp(-293)与籽粒中的赖氨酸含量显著关联。

表1定位过程所用的标记及序列

。

表1主要是初步定位和精细定位过程中用到的差异连锁分子标记，其中c4、45、46、c351、c368、c143、c201和indel-98为新开发的ssr(simplesequencerepeats)或indel类型的分子标记，umc2237、bnlg1556、umc1245、umc2181、mmc0041和phi423298为maizegdb数据库中所公布的ssr分子标记。

表2候选基因关联分析

。

^a仅列出了显著关联位点；

^bsnp(-293)的等位变异，加粗表示有利等位变异；

^csgw表示淀粉粒宽度；gi表示淀粉粒长度;arg表示精氨酸含量；lys表示赖氨酸含量

^dp-value是通过tassel软件的混合线性模型整合了群体结构和亲缘关系得到的；blup是两年数据整合后得到的结果；

^ep-value是利用blup数据通过anova分析得到的结果。

表2显示与snp(-293)显著关联的4个性状，包括sgw(淀粉粒宽度)、gi(淀粉粒长度)、arg(精氨酸)和lys(赖氨酸)。n代表该性状所使用的个体数量。

实施例4：玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记的设计

针对3-bp的特异性开发了易于检测的pcr功能分子标记，根据snp(-293)设计了易于检测的dcaps功能分子标记。

cytmdh4基因功能分子标记的pcr引物序列如下：

（1）功能snp位点：b73v4：234908227，即为参照已经测序完成的b73基因组序列，该功能snp位点在染色体上的实际位置。

snp(-293)-bsphi-l：aagcgtcacgccgtctcatg；

snp(-293)-1r：cttgggaatccactgtcacacgc；

（2）3-bp的差异功能位点：b73v4：234902919-234902921，即为参照已经测序完成的b73基因组序列，该3-bp的差异功能位点在染色体上的实际位置。

exon7-l：caaggaagaagatggatgcc；

exon7-r：tgctctctgggtgtggtagaat。

实施例5：玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记的检测

针对5’utr内（-293bp处）a到c突变的分子标记的检测，包括以下步骤：

（1）配制10µl反应体系为：

dna模板（30～50ng/ul）2ul

leftprimer(10um)0.5ul

rightprimer(10um)0.5ul

ddh2o2ul

2×hieff®pcrmastermix5ul

（2）pcr扩增程序为：

1cycle95℃5min

36cycles95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s

delay72℃10min

soak25℃

（3）酶切体系为：

pcr产物3ul

cutsmart10×buffer1ul

bsphi(neb)0.5ul

ddh2o5.5ul

（4）配置4%的琼脂糖胶进行常规条件电泳，大约30min后即可显示差异。

snp(-293)的dcaps标记如图2所示：

针对snp(-293)位点在野生型的差异设计含有bsphi的酶切位点的引物，野生型的扩增产物因含有该酶的酶切位点而被正常切割，突变体不含该酶切位点而保持完整，因此在胶图上表现出差异。图中1和3代表野生型，2和4代表突变体。

实施例6：玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记的检测

针对第七个外显子3-bpindel的分子标记的检测，包括以下步骤：

（1）反应体系为：

dna模板（30～50ng/ul）2ul

leftprimer(10um)1ul

rightprimer(10um)1ul

ddh2o1ul

2×mixforpage5ul

（2）pcr扩增程序为：

1cycle95℃5min

36cycles95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s

delay72℃10min

soak25℃

indel(3-bp)的pcr标记图如图3所示：

针对野生型和突变体中3-bp的差异设计包含该位点的引物，野生型和突变体的扩增产物分别为96bp和93bp，其中1、3、5、7、和9代表含有3-bp个体，2、4、6、8和10代表缺失3-bp个体。

实施例7：snp(-293)在自然群体中的分布

利用华中农业大学严建兵课题组（http://www.maizego.org/resources.html）对关联群体的测序数据进行比对查找获得snp(-293)在自然群体中的分布。

snp(-293)在自然群体中的分布如表3所示。

表3snp(-293)在自然群体中的分布

。

note:“-”,deletion;“.”,nodata.“-”代表该位点碱基的缺失，“.”代表该材料无对应的数据。

实施例7：indel(3-bp)在大刍草及55份自然群体中的核苷酸状态

设计含有3-bp缺失位点的测序引物，对大刍草和55份自然群体基因组dna的测序，然后用bioedit软件对序列进行比对分析。

测序引物序列为：

mdh4-4l：ggtttcgttagggacacaatga

mdh4-4r：acccaccgaatcccaagtt

indel(3-bp)在大刍草及55份自然群体中的核苷酸状态如图4所示。

图4中最左侧字母表示不同的材料名称，其中第一行为野生型序列，第二行为突变体序列；黑框部分表示野生型、突变体、大刍草和55份自然群体材料3-bp的插入缺失情况，结果显示仅在突变体中检测到3-bp的缺失，证明该缺失是突变体特有的缺失。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

sequencelisting

<110>河南农业大学

<120>玉米高赖氨酸基因zmcytmdh4的分子标记及其应用

<130>2019

<160>12

<170>patentinversion3.2

<210>1

<211>6408

<212>dna

<213>zeamays

<400>1

cttagagtttattattgtaattgctcttactcccaaccaaacataggccttgtttggcac60

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ttgactgcttttagtgtattctgagaagcagttgaactgataagctgctgcagaagctgg180

ctgtttggcagaactttaacttaaatttgtgaagaagctaaaaataagttgtgtcaaaca240

tggccacagtagtaagaaaaagtatcgtcacatcgcgtttccctatcggtcgaagtagct300

ttcaaatctttagatgtgtggataaaaaaacggctggtgatcaaagccatcggtacctat360

caaacctatcaccaaccctatcgtgaatgagtgccatcttcctcacgccacgcttctcga420

atctcgagaggcatctcctccacaacgataatgtcgccgcttcggtcctgtaaaacagca480

cgcaagaaaaatgcagaaaatcaatcaagctccatccagcttgtcaagctgccatgctgt540

ctaactgacagaaggaccccaccatcttgctccactccgtacaactgtacctgtacgtag600

tattcatcgccgaagccgtgggcggtgggccagcgcccacagcgtcaagcgtcacgccgt660

cacttgagagtctcctgcctaaagacacaccaaccaatcagagccaacatagcacactga720

cgtcaggggcccgctgctgtcgggccaattgtcagttactgataagcacgctgtcattat780

cggggcgtgtgacagtggattcccaaggcttccccgtcacagcgacgttgttaaatagtg840

gccacccattgccgcgttctcttcgctatcccttggttgccgcagcctccaaagccactc900

ccaaacccccgcttccagaaccttctcgaagctccccgccgcctcctccactcgcaccga960

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cctccttcccgatccgcgtagtatccggtgtcgtctggtcccggctcggatctggcctag1080

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gttttggccagtagaactgtagaagggctcactgtcactctccttgttcagtcggtgaag1260

ttgaaccgatccgcggtgctagctgatctgatcagtggttgggcttgatgggtagatcct1320

cgtggtagtcacttgatccagttgactcgctagctgcacttaattaactgcttactcttt1380

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ttcatcccatcagactatctggtgggacttaagttacagatctaggtactccacccatgg1560

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tcataaccacagggtttggtatggattagccaaaagttagttaatatcctgcttatttat1860

ggtagcatatgtctggcattcagttataaaattgcacagcgtgcttgacacttttcttgt1920

atattattgagctattcttagggggtgtttggtttgcccctgctaaaatttagcccctat1980

cacatcgaatgtttgaacctccgttcggggtattaaatgtagtcggattataaaactaat2040

tttcagccgaagattaaaaagtgagacgaattagtacagttggttgggtcaatattttat2100

actcctatttgaaagtcaaacgcttgatgtgacccgggctaaactttagtccacagaacc2160

aaacacccccttataagcatctactgtgatacaacaattgtctactgcttgtgtcatatt2220

tgatggtattagagttggtgtacaatgcgtatttactagttccatttttatatgcttgta2280

ctgagttaaaatatgatgcttgttcttatggtgatagtgaccttccctcacctgttccgg2340

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ggatccaaaatcttactactgatttgcgcccaacatatgggtgaggtttttttttgggtt2700

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atttgcatctttggtgctgacttcctattacaatttcattctctcactgttaccacagta3240

aaagggatttgtacaaagggacattttgaacggatctttctctaatttgtgctcatcttt3300

aggtgtgttgagctaatttgtttgttgtttgataggacaaattggatatgccctggttcc3360

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tcctcttctgaagggtaagctgatgtgctaatttagagagtatggcctcttctgtctttt3540

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