一种柔嫩艾美耳球虫超氧化物歧化酶及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性的分子标记etsod。

背景技术：

鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生鸡肠道引起的一种寄生虫病，给全世界的养禽业造成了严重的经济损失。药物是球虫病防治中的主力军，主要分为两类，一类是影响球虫细胞膜通透性的离子载体类药物，如马杜拉霉素、莫能霉素等；另一类是影响球虫代谢途径的化学合成类药物，如地克珠利。随着药物的大量使用，球虫极易产生耐药性，目前鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药都产生了耐药性。耐药性的产生导致现场用药困难，给全世界的养殖业都造成巨大的经济损失。

目前，现场田间球虫耐药性的检测主要还是依赖于动物药物敏感性试验，费时、费力、且周期长，因此，研究球虫耐药性的快速检测方法，指导现场用药显得尤为重要。但由于球虫耐药性产生的机制至今尚不清楚，没有找到与球虫耐药性相关的代表性靶标分子，尚未建立快速检测方法，无法给现场用药提供指导。因此，筛选并利用与柔嫩艾美耳球虫耐药性相关的分子标记具有重要意义。

技术实现要素：

本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)进行了转录组测序，筛选出耐药株与敏感株之间的差异表达基因，其中包括了柔嫩艾美耳球虫超氧化物歧化酶(eimeriatenellasuperoxidedismutase，etsod)，两个耐药株中etsod的表达水平明显高于敏感株。超氧化物歧化酶是一种能够通过歧化反应催化超氧化物转化为氧气和过氧化氢的酶，能够清除细胞新陈代谢产生的各种活性氧，从而达到保护细胞免受氧自由基毒害的目的。已有研究者发现弓形虫、疟原虫sod可能参与虫体在宿主细胞内的生长发育，并且有研究者指出超氧化物歧化酶具有作为真核病原体药物靶标的潜力。

本发明首先保护一种特异引物对，其可由用于扩增特异dna片段的两条引物组成；所述特异dna片段中具有etsod中引物f和引物r组成的引物对的靶序列；

所述引物f可为如下a1)或a2)：

a1)序列表的seqidno.4或seqidno.6所示的单链dna分子；

a2)将seqidno.4或seqidno.6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.4或seqidno.6具有相同功能的dna分子；

所述引物r可为如下a3)或a4)：

a3)序列表的seqidno.5或seqidno.7所示的单链dna分子；

a4)将seqidno.5或seqidno.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.5或seqidno.7具有相同功能的dna分子。

所述特异引物对具体可由所述引物f和所述引物r组成。

本发明同时保护一种特异引物对的应用。所述特异引物对的应用可为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性；

b2)辅助筛选具有或疑似具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种；

b3)辅助筛选不具有或疑似不具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种。

本发明还保护一种试剂盒，其含有上述任一所述特异引物对。

所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为如下c1)-c3)中的任一种：

c1)辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性；

c2)辅助筛选具有或疑似具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种；

c3)辅助筛选不具有或疑似不具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种。

本发明还保护以待测柔嫩艾美耳球虫的mrna反转录的cdna为模板，采用上述任一所述特异引物对扩增得到的dna片段。

所述dna片段即为本发明要保护的分子标记etsod。

所述dna片段的核苷酸序列具体可如序列表中的seqidno.1或seqidno.2所示。

所述dna片段所编码的氨基酸序列具体可如序列表中的seqidno.3所示。

所述dna片段的应用也属于本发明的保护范围。所述dna片段的应用可为如下d1)-d8)中的任一种：

d1)辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性；

d2)辅助筛选具有或疑似具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种；

d3)辅助筛选不具有或疑似不具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种。

d4)制备辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性的产品；

d5)制备辅助筛选具有或疑似具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种的产品；

d6)制备辅助筛选不具有或疑似不具有耐药性的柔嫩艾美耳球虫虫种的产品；

d7)作为分子标记。

本发明还保护一种辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测柔嫩艾美耳球虫的mrna反转录产物为模板，采用上述特异引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，将pcr产物链接到原核表达载体，在原核表达系统中表达重组蛋白制备多克隆抗体或单克隆抗体。采用制备的抗体对柔嫩艾美耳球虫蛋白进行western-blot检测。

(3)完成步骤(2)后，进行如下判断：如果所述western-blot检测中etsod蛋白在待测柔嫩艾美耳球虫(田间分离株)高于敏感株判定待测柔嫩艾美耳球虫具有或疑似具有耐药性，如果所述western-blot检测中etsod蛋白在待测柔嫩艾美耳球虫(田间分离株)低于或相当于敏感株，待测柔嫩艾美耳球虫不具有或疑似不具有耐药性。

本发明还保护一种辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测柔嫩艾美耳球虫的cdna为模板

(2)采用上述特异引物对进行定量pcr；

(3)完成步骤(2)后，进行如下判断：如果所述定量pcr扩增产物中mrna的转录含量在待测柔嫩艾美耳球虫(田间分离株)高于敏感株判定待测柔嫩艾美耳球虫具有或疑似具有耐药性，如果所述定量pcr扩增产物中mrna的转录含量在待测柔嫩艾美耳球虫(田间分离株)低于或相当于敏感株，待测柔嫩艾美耳球虫不具有或疑似不具有耐药性。

实验证明，采用本发明提供的分子标记etsod具有较高的特异性，可以辅助鉴定待测柔嫩艾美耳球虫的耐药性，具有快速、低成本以及限制少等特点，可大大提高筛选效率。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1：etsod基因cdna核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息学分析，其中，小写字体：n-糖基化位点；小写加粗字体：锰/铁超氧化物歧化酶处；波浪线：酪蛋白激酶ii磷酸化位点；下划线：n-豆蔻酰化位点；倾斜字体：蛋白激酶c磷酸化位点；括弧：铁/锰超氧化物歧化酶α-发夹结构域；阴影：酪氨酸激酶磷酸化位点；方框：铁/锰超氧化物歧化酶c-末端结构域；星号：终止子。

图2重组蛋白retsod的纯化

图3etsod的分布定位，其中，a：重悬于pbs的子孢子，b：重悬于pbs的子孢子，c：子孢子入侵df-1细胞2h，d：子孢子入侵df-1细胞24h，e：子孢子入侵df-1细胞48h，f：子孢子入侵df-1细胞60hg：子孢子入侵df-1细胞72h，h：子孢子入侵df-1细胞84h

图4retsod的免疫原性分析，其中，m：蛋白marker，1：一抗为阴性血清，2：一抗为his标签单抗，3：一抗为兔抗子孢子多克隆抗体

图5etsod基因在虫体不同发育阶段的转录水平

图6etsod基因的转录与翻译水平，其中，a：etsod基因的转录水平；b：etsod基因的翻译水平

图7etsod基因的转录与翻译水平，其中，a：etsod基因的转录水平；b：etsod基因的翻译水平。ds：柔嫩艾美耳球虫敏感株1：0.2ppm地克珠利作用下，2：0.5ppm地克珠利作用下，3：0.8ppm地克珠利作用下。

图8etsod基因的转录与翻译水平，其中，a：etsod基因的转录水平；b：etsod基因的翻译水平。ds：柔嫩艾美耳球虫敏感株1：3ppm马杜拉霉素作用下2：5ppm马杜拉霉素作用下

图9etsod酶活性检测。

实施例

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1etsod基因的克隆与生物信息学分析

虫株

柔嫩艾美耳球虫上海株(资源编号：caas21111601)、地克珠利耐药株(资源号：caas2111160821)和马杜拉霉素耐药株(资源号：caas2111160921)、不同药物浓度(0.2ppm、0.5ppm和0.8ppm地克珠利耐药株；3ppm和5ppm马杜拉霉素耐药株)虫体均由中国农业科学院上海兽医研究所原虫病创新团队分离、诱导并保存。经2周龄无球虫幼鸡大量繁殖，按参考文献获得纯化的未孢子化卵囊(unsporulatedoocysts，uo)、孢子化卵囊(sporulatedoocysts，so)、子孢子(sporozoites，sz)和第二代裂殖子(second-generation，sm)。

rna提取和cdna制备

使用trizol试剂根据使用说明书提取虫体总rna。采用分光光度计在260nm处测定总rna浓度。采用1％琼脂糖凝胶进行电泳评估rna质量。采用superscriptiiirt试剂，用未孢子化卵囊总rna合成互补dna(cdna)。

扩增

使用分别带有限制性酶切位点bamhi和xhoi(下划线)上游引物5’-gcggatccatggcgctccgcagagccgcccttcgcctca-3’(seqidno.4)和下游引物5’-gcctcgagtcagtaggtctcgaggaggttgttgacgaactgttc-3’(seqidno.5)，扩增etsod基因的orf序列。采用未孢子化卵囊的cdna作为模板，进行pcr扩增。总体系25，μl，程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，72℃持续延伸10min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并采用qiaquick凝胶提取试剂盒回收目的条带。使用t4dna连接酶将etsod片段连接到pgem-t-easy载体上构建重组质粒pgem-t-etsod。重组质粒送生工生物(中国上海)进行测序鉴定。以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊的cdna的第一链为模板，pcr扩增。所得的条带大小与预期一致，约为651bp，将其命名为etsod。所获得etsod的核苷酸序列如seqidno.1所示；氨基酸序列如seqidno.3所示。同时，以柔嫩艾美耳球虫上海株(资源编号：caas21111601)基因组为模板，进行pcr扩增，具体pcr体系和步骤如上所述，所获得etsod的全长核苷酸序列如seqidno.2所示，小写字母为其中的内含子序列。目的片段与pgem-t-easy载体连接转化测序后，筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行序列测定及生物信息学分析。

生物信息学分析

使用expasy上的protparam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)预测etsod的分子量和理论等电点。使用计算工具signalp(http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)预测编码蛋白有无信号肽，使用tmhmm(http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)预测编码蛋白有无跨膜结构。采用motifscan(http：//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析蛋白质基序。运用生物信息学软件分析显示：该基因序列长为651bp，编码216个氨基酸，预测分子质量为24.9kda，等电点为7.15；信号肽和跨膜结构分析表明该基因序列表达的蛋白无信号肽，无跨膜结构；蛋白的结构功能域发现，该基因编码的蛋白含有1个酪蛋白激酶ii磷酸化位点(位点位置：144-147)，2个n-豆蔻酰化位点(位点位置：74-79和116-121)，4个蛋白激酶c磷酸化位点(位点位置：11-13，31-33，107-109和146-148)，2个n-糖基化位点(位点位置：85-88和187-190)，1个酪氨酸激酶磷酸化位点(位点位置：33-39)，1个铁/锰超氧化物歧化酶，c-末端结构域(位点位置：101-208)，1个铁/锰超氧化物歧化酶，α-发夹结构域(位点位置：13-94)和1个锰和铁超氧化物歧化酶(位点位置：174-181)(图1)。etsod蛋白属于超氧化物歧化酶家族。

实施例2重组蛋白etsod的表达

用bamhi/xhoi对pgem-t-etsod和pet-28a载体进行双酶切，进行琼脂糖凝胶回收，连接后将重组pet-28a-etsod质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中。将测序正确后的菌落在37℃扩大培养，培养至od值至0.6-1.0之间时加入1.0mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)，置于16℃恒温摇床中震荡培养24h，摇床转速保持在180r/min。冰浴超声裂解菌体，超声2s，停2s，持续20min。采用his-bindresin亲和柱层析的方法纯化含有his标签的重组蛋白retsod。sds-page电泳检测表明，得到了比较纯的融合蛋白，如图2。使用bca蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白存储于-20℃以用于后续分析。

实施例3蛋白etsod在虫体上的分布定位

retsod抗血清的制备

取200μg纯化的retsod用等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫2个月大的新西兰白兔。两周后，进行加强免疫，加强免疫采用弗氏不完全佐剂进行乳化。每7天进行一次免疫，总共进行5次免疫。于最后一次免疫后7天，收集血液，分离多克隆抗体血清。阴性血清于免疫前从兔耳缘静脉采集血液后分离所得。

etsod在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的分布

按照每孔2×10⁵的量将df-1细胞接种于放有细胞爬片的六孔板中，加入2ml完全培养基(含有10％胎牛血清，100单位/ml双抗)在37℃细胞培养箱中培养24小时。将新鲜的柔嫩艾美耳球虫子孢子(每孔6×10⁵寄生虫)在完全培养基中于41℃温育2小时后感染df-1细胞，在感染后24，48，60，72和84收集细胞爬片。所有样品在室温下用4％多聚甲醛固定20min，用1％tritonx-100通透15min，然后用2％牛血清白蛋白于4℃冰箱封闭过夜。将样品用兔抗retsod多克隆抗体以1∶100的比例在37℃下孵育2小时，然后用异硫氰酸酯(fitc)荧光素标记的山羊抗兔igg(1∶500稀释)在37℃孵育1h。细胞核用15μg/ml的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色30min。每次孵育后，所有样品均用pbs洗涤4次。将子孢子和第二代裂殖子均匀地涂布在细胞爬片上。然后，经4％多聚甲醛固定，1％tritonx-100和2％牛血清白蛋白封闭后，以兔抗retsod多克隆抗体为一抗、fitc为二抗孵育样品，用dapi标记细胞核。之后，于载玻片上滴加60μl抗荧光淬灭剂(将细胞爬片反扣于载玻片上。采用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。结果(图3)显示etsod蛋白在子孢子和第二代裂殖子上的表达量较少，子孢子和第二代裂殖子表面的绿色荧光强度均较弱(图3a和b)。用子孢子感染df-1细胞2h和24h后，etsod主要定位于虫体的顶端，此阶段绿色荧光强度也增强(图3c和d)。在48h，我们发现滋养体阶段表达量有所下降，荧光强度减弱(图3e)。随着细胞内虫体的发育，etsod定位于未成熟裂殖体和成熟裂殖体的整体表面，并且绿色荧光的强度增加，表达量上升。(图3f，g和h)。

实施例4重组蛋白retsod的免疫原性分析

荧光定量pcr

为了检测etsod在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)转录水平，以及比较敏感株与不同药物浓度耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)孢子化卵囊之间的转录水平差异。提取虫体rna，去除基因组后，使用superscriptiii逆转录酶和随机引物合成第一cdna链。使用上游引物5’-agattctctctgccgccgctcccct-3’(seqidno.6)和下游引物5’-gcgttcaagttgtccacataagcct-3’(seqidno.7)，以虫体cdna为模板，利用sybrgreeni对etsod的转录水平进行检测。以柔嫩艾美耳球虫的18s核糖体rna为参照，并使用上游引物5’-tgtagtggagtcttggtgattc-3’和下游引物5’-cctgctgccttccttagatg-3’进行扩增。每个样品3个重复，实验重复三次。使用2^-δδct方法计算etsod的相对表达水平。

westernblot

为了检测重组蛋白免疫原性分析，将retsod重组蛋白进行sds-page，转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉4℃过夜封闭，用pbs洗3次，每次5min，分别用抗子孢子血清(1∶100稀释)、his单抗(1∶2000稀释)和兔igg作为一抗37℃孵育2h，pbs洗3次后，用680rd驴抗鼠igg或680cw羊抗兔igg(1∶10000稀释)避光孵育1h，pbst洗5次后，用双色红外激光成像系统扫描。双色红外激光成像系统中扫描的结果(图4)显示在his单克隆抗体、抗子孢子全蛋白多克隆抗体作为一抗孵育的膜在目的位置出现了条带。而兔阴性血清作为一抗孵育的膜在目的位置未出现了条带。说明该重组蛋白retsod的免疫原性良好。

用上述同样的方法对敏感株以及不同药物浓度耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)孢子化卵囊中etsod蛋白表达情况进行分析。取各组适量的孢子化卵囊，重悬于0.5ml细胞裂解液中，加入蛋白酶抑制剂使其终浓度为1％，加入玻璃珠，放于旋涡振荡器上震动60min，其中每震动8min，冰浴2min。用sds-page检测蛋白提取情况，用bca测定各虫体蛋白浓度，各组取等量的蛋白进行进行westernblot，其中，一抗为retsod抗兔血清，同时用α-tubulin单克隆抗体作为内参。结果显示该基因mrna在第二代裂殖子(mrz)转录水平最高，未孢子化卵囊(uo)次之。孢子化卵囊(so)和子孢子(spz)最低(图5)。此外，利用实时荧光定量pcr检测，发现与柔嫩艾美耳球虫敏感株相比，etsod基因在地克珠利耐药株(dzr)和马杜拉霉素耐药株(mrr)中的转录水平是显著上调的。在敏感株与耐药株中转录与翻译水平的差异分析中证实以管家基因α-tubulin为内参，利用westernbloting检测，发现与柔嫩艾美耳球虫敏感株相比，etsod蛋白在两种耐药株中的翻译水平是显著上调的(如图6)。而且etsod基因在不同浓度的地克珠利作用下转录与翻译水平的分析证实发现随着药物浓度的升高，etsod基因转录水平也越高。管家基因α-tubulin为内参，利用westernbloting检测发现：etsod蛋白的翻译水平也随着药物浓度的升高而上升。如图7。etsod基因在不同浓度的马杜拉霉素作用下转录与翻译水平的分析证实利用westernbloting检测，发现etsod蛋白翻译水平与药物浓度呈正相关。如图8。

酶学活性分析

使用日本同仁化学研究所研发的超氧化物歧化酶(sod)试剂盒检测敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株孢子化卵囊之间etsod酶活性差异。原理是利用同仁化学研究所研发的高度水溶性四唑盐(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐，二钠盐)与超氧阴离子(o2-)反应生成一种水溶性的染料。被超氧阴离子还原的比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被sod所抑制(sod反应优先发生，反应后发生)，从而排除自身对实验的影响。具体的操作步骤参照使用说明书。使用超氧化物歧化酶检测试剂盒，在预实验的基础上，进行了三次独立实验，实验结果表明，与敏感株相比，地克珠利耐药株(dzr)和马杜拉霉素耐药株(mrr)中etsod酶活性显著提高。如图9。