本发明涉及分子生物学、植物遗传学和植物生物工程领域。具体而言，本发明涉及基因编辑产物在植物细胞中的检测方法，特别地涉及通过编辑水稻原生质体的靶基因能够检测基因编辑工具在植物细胞中产生的编辑事件以及测定其编辑效率。该方法能够应用于基因编辑工具在植物细胞中的活性比较以及优化。
背景技术：
：：基因编辑是目前生命科学研究的一个热点，目前广泛使用的基因编辑技术中的重要工具crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats/crispr-associated9)是细菌和古细菌的对抗外源dna入侵的一种防御系统，可将入侵的噬菌体基因组dna等外源核酸序列切除。此外还有人工设计的序列特异性核酸酶(sequence-specificnucleases，ssns)来对特定位置的基因组dna进行切割，如早期的锌指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、转录激活样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)、归巢核酸内切酶(meganuclease，mn)。这些基因编辑工具均在基因组的特定位置产生dna双链断裂(double-strandbreaks，dsbs)，dsb可以由生物体的体内修复机制完成核苷酸的序列变化(缺失、插入和替换)。其中crispr/cas9自首次报道在生物体内实现基因编辑以来，由于其操作简单、效率高，所以该系统广泛应用于动植物，成为药物开发、疾病治疗和农作物品质改良等领域的一个重要基因编辑工具，具有广泛应用前景。真核生物细胞有两种修复系统实现体内dna的dsb修复。同源重组(homologousrecombination，hr)和非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)。hr需要以同源dna片段作为模板进行修复，可实现核苷酸精确改变，但hr在植物体内的效率非常低。nhej不需要额外提供同源片段，依赖体内核酸酶活性，在dsb处产生少数核苷酸的改变，包括插入或缺失。nhej是植物中的一条主要修复途径。目前针对hr和nhej活性的检测依赖于荧光报告系统，荧光报告基因通过切割产生dsb，然后hr或nhej修复后恢复荧光基因活性，流式细胞仪统计发光细胞的数量从而计算hr或nhej的活性。此外，也可利用微滴数字pcr(dropletdigitalpcr，ddpr)检测模板dna中dsb的修复数量，以及高通量的深度测序也可灵敏地检测dna修复产物的数量。在植物基因组编辑研究中检测基因编辑事件的方法除上述方法外，还发展了很多方法。如最常用的pcr/re方法，该方法是应用特异引物pcr和限制性酶切相结合产生的一种检测方法，主要通过对pcr扩增的dna片段进行限制性酶切分析来区分目标位点是否被编辑。该方法虽然简单、成本低，但需要在基因组编辑核酸酶切割位点需要有限制性酶切位点。此外，还有错配切割法，其是通过错配切割酶识别并切割异源双链核酸分子进行检测的一种方法。常用的错配切割酶为t7ei、surveyor(celi)和cruiser。错配切割酶的优势在于不受限制性酶切位点的限制，但错配切割酶受核酸特定结构如holiday或cruciform影响存在一定假阳性。基因编辑技术近年来发展迅速，大量高效编辑系统被开发出来。尤其以crispr/cas9为核心的编辑技术广泛应用于动植物研究和开发。随着越来越多植物基因组编辑的应用，一种灵敏、简便的检测基因编辑事件的方法迫切所需。尽管高通量测序技术由于准确、灵敏和成本低等优势，广泛应用于哺乳动物细胞基因编辑事件的检测，但是植物由于基因组复杂并且植物细胞系难获得而较少采用高通量测序技术检测基因编辑事件。近几年植物基因组编辑的检测方法应用差别很大，说明现有这些方法各有局限，需要根据植物种类和目标基因进一步优化或改进。比较现有基因编辑事件的检测方法，当基因频率很低时，直接利用pcr扩增并进行sangerdna测序很难获得突变类型，甚至用高通量测序法(ngs)进行全基因组分析也无法获得突变类型，并且由于植物多倍性，使得高通量测序法在不同物种中应用受局限。对pcr产物进行酶切(pcr/re)的方法(需要在基因组编辑核酸酶切割位点有限制性酶切位点)，或者通过荧光报告基因恢复发光功能统计基因编辑事件频率，均对目标基因和靶位点的选择具有局限性。技术实现要素：在一个方面，本发明涉及一种检测植物细胞中发生基因编辑事件的方法，其包括由选定的基因编辑工具产生dna双链断裂，并将所提供的外源核苷酸片段由体内修复系统通过nhej途径插入断裂处，从而使得该基因编辑事件能够只通过pcr扩增就被检测到，其中所述外源核苷酸片段不含有大于6个连续核苷酸的与所述植物的基因组同源的序列。在另一个方面，本发明涉及一种测定植物细胞中基因编辑效率的方法，其包括将选定的基因编辑工具和外源核苷酸片段与报告基因一起共同转化植物细胞，由所述基因编辑工具产生dna双链断裂，将所述外源核苷酸片段由体内修复系统通过nhej途径插入断裂处，进行pcr扩增和对扩增片段进行测序，和基于测序结果和借助于报告基因而获得的转化效率来计算出基因编辑效率，其中所述外源核苷酸片段含有兼并碱基。在一个优选的实施方案中，所述兼并碱基选自由下列各项组成的组：(1)兼并碱基n，其表示a、t、c或g；(2)兼并碱基d，其表示a、t或g；(3)兼并碱基h，其表示a、t或c；(4)兼并碱基v，其表示a、c或g；(5)兼并碱基b，其表示t、c或g；(6)兼并碱基r，其表示a或g；(7)兼并碱基w，其表示a或t；(8)兼并碱基m，其表示a或c；(9)兼并碱基y，其表示t或c；(10)兼并碱基k，其表示t或g；和(11)兼并碱基s，其表示c或g。在一个进一步优选的实施方案中，所述报告基因是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白的基因。在根据上述两个方面的一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段由人工合计并合成，并且以单链dna或双链dna形式。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的5’末端含有磷酸化修饰。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的两端含有硫代磷酸修饰。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的5’末端含有磷酸化修饰，并且两端含有硫代磷酸修饰。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述外源核苷酸片段的序列如seqidno:5、seqidno:6或seqidno:7所示。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述基因编辑工具为crispr/cas9、talen、mn或zfn。在一个进一步优选的实施方案中，所述cas9的核苷酸序列如seqidno:1所示，或者所述cas9的氨基酸序列如seqidno:2所示。在一个进一步优选的实施方案中，在所述基因编辑工具为crispr/cas9，并且用于实施编辑的导向rna是单组分rna或双组分rna。在一个进一步优选的实施方案中，所述导向rna的骨架核苷酸序列如seqidno:3所示。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，在所述pcr扩增中使用基于在双链断裂处的染色体序列设计的正向引物和基于所插入的外源核苷酸片段序列设计的反向引物。在一个进一步优选的实施方案中，所述正向引物如seqidno:8所示，和所述反向引物如seqidno:9所示。在一个进一步优选的实施方案中，进行使用如seqidno:10所示的正向引物和如seqidno:11所示的反向引物的二次pcr扩增。在根据上述两个方面的另一个优选的实施方案中，所述植物为单子叶植物，例如水稻或小麦；或者双子叶植物，例如大豆。发明描述本发明的发明人首次在水稻原生质体中应用外源核苷酸片段开发了基因编辑事件的检测技术，并对3种形式的核苷酸片段测试了检测效果，由此完成了本发明。本发明的核苷酸片段，由人工设计合成；通过与水稻基因组比对，其序列与水稻基因没有同源性，由60-85nt的单链或双链dna组成。核苷酸片段1为单链dna分子(singlestranddna，ssdna)，核苷酸片段2为双链dna分子(doublestranddna，dsdna)，核苷酸片段3为单链含兼并碱基的dna分子(singlestranddegenerateddna，ssddna)。上述核苷酸序列可以通过化学法体外合成。与此同时，合成一条反向互补的核苷酸序列后，经退火与正向核苷酸序列结合后形成双链核苷酸序列。上述核苷酸片段与crispr/cas9编辑载体共同导入水稻细胞的细胞核内，体内nhej修复系统将导入的外源核苷酸片段整合至cas9切割产生的dsb处，并通过染色体复制过程完成外源核苷酸片段与染色体的结合。基于在双链断裂处的染色体序列设计一条正向引物，并与基于所插入的外源核苷酸片段序列设计的反向引物组成pcr扩增引物对，可以检测到crispr/cas9产生的水稻细胞编辑事件。进一步通过在外源核苷酸片段中引入兼并碱基，可检测到不同编辑事件的细胞，当用表达gfp(绿色荧光蛋白)的质粒共转化时可计算转化效率，进而得到所用编辑工具在水稻细胞内产生基因编辑事件的效率。具体模型见图1。本申请首次报道了在水稻中使用外源核苷酸片段检测基因编辑事件的方法，并用3个不同核苷酸序列成功测试了基因编辑事件，测定了所用基因编辑工具的编辑效率。所述方法可以显著缩短基因表达工具优化的时间和研发成本，对植物品系进行基因编辑有重大意义。发明的有益效果在本研究中，发明人首次利用外源核苷酸片段，采用crispr/cas9技术，通过编辑水稻内源osdep1基因成功检测到不同细胞的基因编辑事件，具有开创性的意义。所使用的基因编辑工具中的cas9基因如seqidno:1和seqidno:2所示，导向rna骨架核苷酸序列如seqidno:3所示，靶位点序列来自野生型水稻osdep1基因的外显子，并且如seqidno:4所示。外源核苷酸序列分别如seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示。本发明中的外源核苷酸序列可以在水稻细胞中作为基因编辑事件检测的dna片段，也可用在不同植物细胞中检测基因编辑事件。下面通过附图和实施例来对本发明所涉及的技术方案做进一步的详细描述。附图说明图1为本发明原理示意图。图2为基因编辑载体图谱。图3为水稻原生质体。图4为pcr检测ssdna和dsdna在水稻原生质体中的基因编辑事件。图5为dna测序结果比对ssdna和dsdna在水稻原生质体中的编辑事件。图6为水稻原生质体转化gfp后的照片。图7为水稻原生质体计数。图8为pcr检测ssddna在水稻原生质体中的基因编辑事件。图9为dna测序结果比对ssddna在水稻原生质体中的编辑事件。序列表信息seqidno:1为改进并优化的cas9的核酸序列。seqidno:2为改进并优化的cas9的氨基酸序列。seqidno:3为crispr/cas9的导向rna骨架核苷酸序列。seqidno:4为水稻osdep1基因中的靶位点核苷酸序列。seqidno:5为单链核苷酸序列：5’端含磷酸化修饰(phosphate)，两端各有2个硫代磷酸修饰(phosphorothioate)，其中“*”表示硫代磷酸酯键。seqidno:6为单链核苷酸的反向互补序列：5’端含磷酸化修饰，两端各有2个硫代磷酸修饰，其中“*”表示硫代磷酸酯键。seqidno:7为含兼并碱基的单链核苷酸序列：5’端含磷酸化修饰，两端各有2个硫代磷酸修饰，其中n表示碱基a、t、c或g，“*”表示硫代磷酸酯键。seqidno:8为引物f1的序列。seqidno:9为引物r1的序列。seqidno:10为引物f2的序列。seqidno:11为引物r2的序列。seqidno:12为引物m13f的序列。seqidno:13为引物m13r的序列。seqidno:14为引物r1’的序列。seqidno:15为引物r2’的序列。seqidno:16为绿色荧光蛋白表达盒序列，其中斜体部分为玉米泛素启动子，加有下划线的部分为绿色荧光蛋白cds序列，其余为nos终止子序列。seqidno:17为35s启动子序列。seqidno:18为水稻u6启动子序列。seqidno:19为nos终止子序列。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.材料与方法材料植物材料：籼稻自交系ir58025b。外源核苷酸片段：本发明中使用的核苷酸片段由发明人设计，结合gc含量、核苷酸组成、二级结构并与水稻基因组进行比较不含有大于6个连续核苷酸的同源序列，正向链和反向互补链由invitrogen公司合成，兼并序列含有随机选取的核苷酸a、t、c或g进行兼并合成，并用水或te缓冲液稀释至10μm使用。其序列信息见序列表(seqidno:5-7)。引物：本发明中使用的克隆测序扩增引物利用美国appliedbiosystem公司的primerexpress3.0软件设计，并由invitrogen公司合成。其序列信息见序列表(seqidno:8-15)。方法植物生长条件：本发明中所涉及的水稻植株在组培室中的培养条件为16小时光照(30℃)8小时黑暗(30℃)，温室湿度控制在60％。双链核苷酸片段由以下方法制备：把待退火的单链dna用经灭菌的水配制成100μm，按下表配置反应体系其中退火缓冲液(5x)的组成：50mmtris,ph7.5-8.0250mmnacl5mmedta将上述反应液置于pcr仪中，设置以下程序运行：95℃2分钟。25℃(2％降温速度或8秒/℃，大约用时45分钟)。4℃保存至使用。实施例2.crispr/cas9编辑载体的构建改进版的cas9在羧基端融合了核定位信号(cbcas9nu-02)，并根据玉米中表达模式进行密码子优化，这种优化形式经过测试同样适用于水稻，以花椰菜花叶病毒35s启动子(seqidno:17)驱动cas9表达。改进并优化的cas9的核酸序列和氨基酸序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示。籼稻自交系ir58025b中osdep1基因序列由内部基因组测序数据获得，并经过再次克隆测序验证。osdep1基因的编辑位点设计在靠近基因起始末端的位置(1号外显子区域)产生双链断裂，以产生移码突变提前终止osdep1的功能。导向rna选择ngg上游临近的20个核苷酸，将核心12个核苷酸序列(紧邻ngg的12个核苷酸)连同ngg共15个核苷酸在内部数据库中进行blast分析，兼顾已有基因组信息的多个水稻基因组(包括籼稻和粳稻)，确保在水稻基因组中只有唯一的精确匹配。用水稻u6启动子(seqidno:18)驱动导向rna和骨架rna表达。最终选定的导向rna由genscript公司(www.genscript.com)提供全序列合成。构建载体及鉴定的一般方法为本领域技术人员所熟知。基因编辑载体24333的图谱见图2。最后选定的由导向rna所靶向的靶位点序列如下：aactgcagtgcgtgctgcgc(seqidno:4)。实施例3.水稻ir58025b原生质体的分离与转化将构建好的编辑载体转化大肠杆菌dh5a，并提取质粒dna；方法为本领域技术人员所熟知。由籼稻品种ir58025b种子种植于ms培养基上而获得无菌苗，用酶解液处理切碎的植物组织，经过分离纯化后，用40％peg-4000转化法把含有0.1μm的实施例1的外源核苷酸片段和10μg的实施例2的编辑载体质粒dna共同转入0.5×105个水稻原生质体，并经过培养后进行分子检测，见图3。方法为本领域技术人员所熟知。水稻转化过程更详细的方法及各种溶液或培养基成分可参考liang等人,2016。实施例4.单链核苷酸片段用于水稻原生质体osdep1基因编辑的事件检测对培养48小时的根据实施例3用单链核苷酸片段(序列如seqidno:5所示)进行了转化的水稻原生质体进行基因组dna提取，具体过程如下：将2ml培养物收集于离心管，250g室温离心5分钟，保留沉淀，加入0.3mlplantdnazol(thermofisher)，室温混匀5分钟，12,000g室温离心10分钟，吸取上清后加入0.225ml100％乙醇，颠倒混匀后室温放置5分钟，5,000g室温离心5分钟，沉淀加入0.3mlplantdnazol-乙醇(dnazol:100％乙醇，1:3)，颠倒混匀后室温放置5分钟，5,000g室温离心5分钟，沉淀加入0.3ml75％乙醇，颠倒混匀后室温放置5分钟，5,000g室温离心5分钟，沉淀干燥后加入50μlte，4℃放置1小时使用。具体提取操作步骤详见plantdnazol试剂盒的说明书。设计检测引物：上游引物位于水稻osdep1基因双链断裂的上游区域，命名为f1；下游引物位于所述核苷酸片段内，靠近3’端，命名为r1。用无菌水或te稀释至10μm使用。f1：5’-gcaaactagtccagggatgtaatcatc-3’(seqidno:8)r1:5’-tccaagttgagccctctaccatgc-3’(seqidno:9)。配制以下pcr反应体系：将反应液置于pcr仪上，设置以下程序运行：此外，为了提高检测灵敏度，在f1引物结合的下游水稻osdep1基因双链断裂的上游区域设计另一条正向引物，命名为f2(seqidno:10)；并在核苷酸片段反向引物的下游设计另一个反向引物，命名为r2(seqidno:11)，用于二次pcr扩增。将第一轮pcr产物用无菌水或te稀释10-100倍，用f2/r2进行第二轮扩增。本发明只用第一轮扩增即可检测到目的片段。pcr扩增的一般方法为本领域技术人员所熟知。将pcr产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳(见图4)，回收约300bp的目的条带(qiaquickgelextractionkit，qiagen)，具体提取操作步骤详见该试剂盒的说明书。将回收的目的片段dna经过连接转化而克隆到peasy载体(peasy-bluntzerocloningkit，transgen)中，具体提取操作步骤详见该试剂盒的说明书。随机挑取10个单克隆菌落提取质粒dna进行sangerdna测序(lifetechnologies)，测序引物为m13f(seqidno:12)和m13r(seqidno:13)。测序结果在vectornti中与参考序列进行比较，分析核苷酸片段插入基因编辑产生的双链断裂处，得出基因编辑载体在水稻原生质体中产生的基因编辑事件。测序比对结果见图5。实施例5.双链核苷酸片段用于水稻原生质体osdep1基因编辑的转化事件检测用根据实施例1获得的双链核苷酸片段(序列如seqidno:6所示)，按照实施例3的方法转化水稻原生质体细胞，并按照实施例4的方法进行分子检测。获得基因编辑载体在水稻原生质体中产生的基因编辑事件。测序结果见图5。实施例6.含兼并碱基的核苷酸片段用于水稻原生质体osdep1基因编辑的转化事件检测为了用于转化事件的定量检测，本发明设计了含兼并碱基的核苷酸片段，该核苷酸片段含有所需的单个兼并碱基或多个兼并碱基，如1-3个兼并碱基。为了减小合成难度，设计所需的核苷酸序列由60个碱基组成。序列如seqidno:7所示。按照实施例3的方法转化水稻原生质体细胞，并同时转入10μg含绿色荧光蛋白基因表达盒(序列见seqidno:16)的表达载体；在本实施例中为puc57携带上述表达盒。用荧光显微镜或流式细胞仪统计培养48小时的发绿色荧光细胞占细胞总数的比例。检测的一般方法为本领域技术人员所熟知。测定转化效率为60％(例如10个细胞有6个细胞有绿色荧光)，见图6-7。并按照实施例4的方法进行分子检测，但下游引物对应所使用的核苷酸片段，命名为r1’(序列见seqidno:14)；以及用于第二轮pcr扩增采用r2’(序列见seqidno:15)，pcr产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳(见图8)，并对其进行克隆测序，测序结果见图9。经统计分析获得5种编辑事件，在10个克隆中所占比例为50％。最终按以下公式计算出所用基因编辑载体在水稻原生质体中产生基因编辑事件的效率为30％。计算编辑效率的公式：编辑效率＝(重组序列种类数÷测序克隆数)×(绿色荧光细胞数÷细胞总数)×100％以上结果表明，本发明了首次提供了使用外源核苷酸片段检测crispr/cas9基因编辑工具在水稻原生质体中产生编辑事件的方法，创制了不同形式的外源核苷酸片段，并且可以定量检测所用编辑载体对靶基因的编辑效率。本发明为crispr/cas9基因编辑工具在水稻中的优化和测试提供了一种新的检测方法。最后应当说明，尽管本发明的具体实施方式已经进行了详细的描述，但是以上实施例仅用于举例说明本发明的技术方案而非限制。本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改或等同替换；这些改变均在本发明的保护范围之内。序列表seqidno:1改进并优化的cas9的核酸序列：atggacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaacagcgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccgagcaagaagttcaaggtgctgggcaacaccgacaggcacagcatcaagaagaacctgatcggcgccctgctgttcgacagcggcgagaccgccgaggccaccaggctgaagaggaccgccaggaggaggtacaccaggaggaagaacaggatctgctacctgcaggagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacaggctggaggagagcttcctggtggaggaggacaagaagcacgagaggcacccgatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtacccgaccatctaccacctgaggaagaagctggtggacagcaccgacaaggccgacctgaggctgatctacctggccctggcccacatgatcaagttcaggggccacttcctgatcgagggcgacctgaacccggacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaacccgatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgagcgccaggctgagcaagagcaggaggctggagaacctgatcgcccagctgccgggcgagaagaagaacggcctgttcggcaacctgatcgccctgagcctgggcctgaccccgaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggacgccaagctgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgttcctggccgccaagaacctgagcgacgccatcctgctgagcgacatcctgagggtgaacaccgagatcaccaaggccccgctgagcgccagcatgatcaagaggtacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaggccctggtgaggcagcagctgccggagaagtacaaggagatcttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacatcgacggcggcgccagccaggaggagttctacaagttcatcaagccgatcctggagaagatggacggcaccgaggagctgctggtgaagctgaacagggaggacctgctgaggaagcagaggaccttcgacaacggcagcatcccgcaccagatccacctgggcgagctgcacgccatcctgaggaggcaggaggacttctacccgttcctgaaggacaacagggagaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccgtactacgtgggcccgctggccaggggcaacagcaggttcgcctggatgaccaggaagagcgaggagaccatcaccccgtggaacttcgaggaggtggtggacaagggcgccagcgcccagagcttcatcgagaggatgaccaacttcgacaagaacctgccgaacgagaaggtgctgccgaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgaggaagccggccttcctgagcggcgagcagaagaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaacaggaaggtgaccgtgaagcagctgaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgacagcgtggagatcagcggcgtggaggacaggttcaacgccagcctgggcacctaccacgacctgctgaagatcatcaaggacaaggacttcctggacaacgaggagaacgaggacatcctggaggacatcgtgctgaccctgaccctgttcgaggacagggagatgatcgaggagaggctgaagacctacgcccacctgttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagaggaggaggtacaccggctggggcaggctgagcaggaagctgatcaacggcatcagggacaagcagagcggcaagaccatcctggacttcctgaagagcgacggcttcgccaacaggaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgaccttcaaggaggacatccagaaggcccaggtgagcggccagggcgacagcctgcacgagcacatcgccaacctggccggcagcccggccatcaagaagggcatcctgcagaccgtgaaggtggtggacgagctggtgaaggtgatgggcaggcacaagccggagaacatcgtgatcgagatggccagggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacagcagggagaggatgaagaggatcgaggagggcatcaaggagctgggcagccagatcctgaaggagcacccggtggagaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggaccaggagctggacatcaacaggctgagcgactacgacgtggaccacatcgtgccgcagagcttcctgaaggacgacagcatcgacaacaaggtgctgaccaggagcgacaagaacaggggcaagagcgacaacgtgccgagcgaggaggtggtgaagaagatgaaaaactactggaggcagctgctgaacgccaagctgatcacccagaggaagttcgacaacctgaccaaggccgagaggggcggcctgagcgagctggacaaggccggcttcattaaaaggcagctggtggagaccaggcagatcaccaagcacgtggcccagatcctggacagcaggatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctgatcagggaggtgaaggtgatcaccctgaagagcaagctggtgagcgacttcaggaaggacttccagttctacaaggtgagggagatcaataattaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtggtgggcaccgccctgattaaaaagtacccgaagctggagagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgaggaagatgatcgccaagagcgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctggccaacggcgagatcaggaagaggccgctgatcgagaccaacggcgagaccggcgagatcgtgtgggacaagggcagggacttcgccaccgtgaggaaggtgctgtccatgccgcaggtgaacatcgtgaagaagaccgaggtgcagaccggcggcttcagcaaggagagcatcctgccgaagaggaacagcgacaagctgatcgccaggaagaaggactgggatccgaagaagtacggcggcttcgacagcccgaccgtggcctacagcgtgctggtggtggccaaggtggagaagggcaagagcaagaagctgaagagcgtgaaggagctggtgggcatcaccatcatggagaggagcagcttcgagaagaacccagtggacttcctggaggccaagggctacaaggaggtgaagaaggacctgatcattaaactgccgaagtacagcctgttcgagctggagaacggcaggaagaggatgctggccagcgccggcgagctgcagaagggcaacgagctggccctgccgagcaagtacgtgaacttcctgtacctggccagccactacgagaagctgaagggcagcccggaggacaacgagcagaagcagctgttcgtggagcagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttcagcaagagggtgatcctggccgacgccaacctggacaaggtgctgagcgcctacaacaagcacagggacaagccgatcagggagcaggccgagaacatcatccacctgttcaccctgaccaacctgggcgccccggccgccttcaagtacttcgacaccaccatcgacaggaagaggtacaccagcaccaaggaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagaccaggatcgacctgagccagctgggcggcgacagcagcccgccgaagaagaagaggaaggtgagctggaaggacgccagcggctggagcaggatgtgaseqidno:2改进并优化的cas9的氨基酸序列：mdkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkelvgitimerssfeknpvdfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggdssppkkkrkvswkdasgwsrmseqidno:3crispr/cas9的导向rna骨架核苷酸序列：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttttseqidno:4水稻osdep1基因中的靶位点核苷酸序列：aactgcagtgcgtgctgcgcseqidno:5单链核苷酸序列：5’端含磷酸化修饰，两端各有2个硫代磷酸修饰，其中“*”表示硫代磷酸酯键。5’-pho-g*g*aacctgtgagtcgcatggtagagggctcaacttggacatcgtcgatctagagaactcatcgatcgcactcccgtagccgac*g*t-3’seqidno:6单链核苷酸的反向互补序列：5’端含磷酸化修饰，两端各有2个硫代磷酸修饰，其中“*”表示硫代磷酸酯键。5’-pho-a*c*gtcggctacgggagtgcgatcgatgagttctctagatcgacgatgtccaagttga*g*c-3’seqidno:7含兼并碱基的单链核苷酸序列：5’端含磷酸化修饰，两端各有2个硫代磷酸修饰，其中n表示碱基a、t、c或g，“*”表示硫代磷酸酯键。5’-pho-c*c*tacgntcgncacgaccctganctacggcgtccagtgcttctcccgcaaccctgacc*a*c-3’克隆测序扩增引物序列：seqidno:8f1：5’-gcaaactagtccagggatgtaatcatc-3’seqidno:9r1：5’-tccaagttgagccctctaccatgc-3’seqidno:10f2:5’-ggcataataatctgtactactgcc-3’seqidno:11r2:5’-gagccctctaccatgcgactc-3’seqidno:12m13f：caggaaacagctatgaccseqidno:13m13r：tgtaaaacgacggccagtseqidno:14r1’：5’-gtggtcagggttgcgggaga-3’seqidno:15r2’:5’-gggagaagcactggacgccg-3’seqidno:16绿色荧光蛋白表达盒序列，其中斜体部分为玉米泛素启动子，加有下划线的部分为绿色荧光蛋白cds序列，其余为nos终止子序列。seqidno:1735s启动子序列agtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacttggtggagcacgacacgctagtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttaattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggtaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggseqidno:18水稻u6启动子序列tttgtgaaagttgaattacggcatagccgaaggaataacagaatcgtttcacactttcgtaacaaaggtcttcttatcatgtttcagacgatggaggcaaggctgatcaaagtgatcaagcacataaacgcatttttttaccatgtttcactccataagcgtctgagattatcacaagtcacgtctagtagtttgatggtacactagtgacaatcagttcgtgcagacagagctcatacttgactacttgagcgattacaggcgaaagtgtgaaacgcatgtgatgtgggctgggaggaggagaatatatactaatgggccgtatcctgatttgggctgcgtcggaaggtgcagcccacgcgcgccgtaccgcgcgggtggcgctgctacccactttagtccgttggatggggatccgatggtttgcgcggtggcgttgcgggggatgtttagtaccacatcggaaaccgaaagacgatggaaccagcttataaacccgcgcgctgtagtcagcttseqidno:19nos终止子序列gatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc参考文献1.wiedenheftb,sternbergsh和doudnaja.rna-guidedgeneticsilencingsystemsinbacteriaandarchaea.nature,2012,482:331-338.2.zhouhb,liub,weeksdp等人,largechromosomaldeletionsandheritablesmallgeneticchangesinducedbycrispr/cas9inrice.nucleicacidsresearch,2014,42:10903-10914.3.liangz,zongy和gaoc.anefficienttargetedmutagenesissystemusingcrispr/casinmonocotyledonscurr.protoc.plantbiol.2016,1:329-344.4.liucx,genglz和xujp.detectionmethodsofgenomeeditinginplants.hereditas,2018,40:1075-1091.5.wangy,gengl,yuanm等人,deletionofatargetgeneinindicariceviacrispr/cas9.plantcellrep,2017,36:1333-1343.序列表<110>先正达作物保护股份公司(syngentacropprotectionag)先正达生物科技（中国）有限公司(syngentabiotechnologychinaco.,ltd.)<120>检测基因编辑事件以及测定基因编辑效率的方法以及其应用<130>81845-wo-reg-org-p-1<141>2019-05-21<160>19<170>patentinversion3.5<210>1<211>4170<212>dna<213>人工序列<220><223>改进并优化的cas9的核酸序列<400>1atggacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaacagcgtgggctgggccgtg60atcaccgacgagtacaaggtgccgagcaagaagttcaaggtgctgggcaacaccgacagg120cacagcatcaagaagaacctgatcggcgccctgctgttcgacagcggcgagaccgccgag180gccaccaggctgaagaggaccgccaggaggaggtacaccaggaggaagaacaggatctgc240tacctgcaggagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagg300ctggaggagagcttcctggtggaggaggacaagaagcacgagaggcacccgatcttcggc360aacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtacccgaccatctaccacctgaggaag420aagctggtggacagcaccgacaaggccgacctgaggctgatctacctggccctggcccac480atgatcaagttcaggggccacttcctgatcgagggcgacctgaacccggacaacagcgac540gtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaacccg600atcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgagcgccaggctgagcaagagcagg660aggctggagaacctgatcgcccagctgccgggcgagaagaagaacggcctgttcggcaac720ctgatcgccctgagcctgggcctgaccccgaacttcaagagcaacttcgacctggccgag780gacgccaagctgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcc840cagatcggcgaccagtacgccgacctgttcctggccgccaagaacctgagcgacgccatc900ctgctgagcgacatcctgagggtgaacaccgagatcaccaaggccccgctgagcgccagc960atgatcaagaggtacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaggccctggtgagg1020cagcagctgccggagaagtacaaggagatcttcttcgaccagagcaagaacggctacgcc1080ggctacatcgacggcggcgccagccaggaggagttctacaagttcatcaagccgatcctg1140gagaagatggacggcaccgaggagctgctggtgaagctgaacagggaggacctgctgagg1200aagcagaggaccttcgacaacggcagcatcccgcaccagatccacctgggcgagctgcac1260gccatcctgaggaggcaggaggacttctacccgttcctgaaggacaacagggagaagatc1320gagaagatcctgaccttccgcatcccgtactacgtgggcccgctggccaggggcaacagc1380aggttcgcctggatgaccaggaagagcgaggagaccatcaccccgtggaacttcgaggag1440gtggtggacaagggcgccagcgcccagagcttcatcgagaggatgaccaacttcgacaag1500aacctgccgaacgagaaggtgctgccgaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtg1560tacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgaggaagccggccttcctg1620agcggcgagcagaagaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaacaggaaggtgacc1680gtgaagcagctgaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgacagcgtggagatc1740agcggcgtggaggacaggttcaacgccagcctgggcacctaccacgacctgctgaagatc1800atcaaggacaaggacttcctggacaacgaggagaacgaggacatcctggaggacatcgtg1860ctgaccctgaccctgttcgaggacagggagatgatcgaggagaggctgaagacctacgcc1920cacctgttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagaggaggaggtacaccggctggggc1980aggctgagcaggaagctgatcaacggcatcagggacaagcagagcggcaagaccatcctg2040gacttcctgaagagcgacggcttcgccaacaggaacttcatgcagctgatccacgacgac2100agcctgaccttcaaggaggacatccagaaggcccaggtgagcggccagggcgacagcctg2160cacgagcacatcgccaacctggccggcagcccggccatcaagaagggcatcctgcagacc2220gtgaaggtggtggacgagctggtgaaggtgatgggcaggcacaagccggagaacatcgtg2280atcgagatggccagggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacagcagggagagg2340atgaagaggatcgaggagggcatcaaggagctgggcagccagatcctgaaggagcacccg2400gtggagaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaacggcagg2460gacatgtacgtggaccaggagctggacatcaacaggctgagcgactacgacgtggaccac2520atcgtgccgcagagcttcctgaaggacgacagcatcgacaacaaggtgctgaccaggagc2580gacaagaacaggggcaagagcgacaacgtgccgagcgaggaggtggtgaagaagatgaaa2640aactactggaggcagctgctgaacgccaagctgatcacccagaggaagttcgacaacctg2700accaaggccgagaggggcggcctgagcgagctggacaaggccggcttcattaaaaggcag2760ctggtggagaccaggcagatcaccaagcacgtggcccagatcctggacagcaggatgaac2820accaagtacgacgagaacgacaagctgatcagggaggtgaaggtgatcaccctgaagagc2880aagctggtgagcgacttcaggaaggacttccagttctacaaggtgagggagatcaataat2940taccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtggtgggcaccgccctgattaaaaag3000tacccgaagctggagagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgaggaag3060atgatcgccaagagcgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctacagc3120aacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctggccaacggcgagatcaggaagagg3180ccgctgatcgagaccaacggcgagaccggcgagatcgtgtgggacaagggcagggacttc3240gccaccgtgaggaaggtgctgtccatgccgcaggtgaacatcgtgaagaagaccgaggtg3300cagaccggcggcttcagcaaggagagcatcctgccgaagaggaacagcgacaagctgatc3360gccaggaagaaggactgggatccgaagaagtacggcggcttcgacagcccgaccgtggcc3420tacagcgtgctggtggtggccaaggtggagaagggcaagagcaagaagctgaagagcgtg3480aaggagctggtgggcatcaccatcatggagaggagcagcttcgagaagaacccagtggac3540ttcctggaggccaagggctacaaggaggtgaagaaggacctgatcattaaactgccgaag3600tacagcctgttcgagctggagaacggcaggaagaggatgctggccagcgccggcgagctg3660cagaagggcaacgagctggccctgccgagcaagtacgtgaacttcctgtacctggccagc3720cactacgagaagctgaagggcagcccggaggacaacgagcagaagcagctgttcgtggag3780cagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttcagcaagagggtg3840atcctggccgacgccaacctggacaaggtgctgagcgcctacaacaagcacagggacaag3900ccgatcagggagcaggccgagaacatcatccacctgttcaccctgaccaacctgggcgcc3960ccggccgccttcaagtacttcgacaccaccatcgacaggaagaggtacaccagcaccaag4020gaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagaccaggatc4080gacctgagccagctgggcggcgacagcagcccgccgaagaagaagaggaaggtgagctgg4140aaggacgccagcggctggagcaggatgtga4170<210>2<211>1389<212>prt<213>人工序列<220><223>改进并优化的cas9的氨基酸序列<400>2metasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnserval151015glytrpalavalilethraspglutyrlysvalproserlyslysphe202530lysvalleuglyasnthrasparghisserilelyslysasnleuile354045glyalaleuleupheaspserglygluthralaglualathrargleu505560lysargthralaargargargtyrthrargarglysasnargilecys65707580tyrleuglngluilepheserasnglumetalalysvalaspaspser859095phephehisargleuglugluserpheleuvalglugluasplyslys100105110hisgluarghisproilepheglyasnilevalaspgluvalalatyr115120125hisglulystyrprothriletyrhisleuarglyslysleuvalasp130135140serthrasplysalaaspleuargleuiletyrleualaleualahis145150155160metilelyspheargglyhispheleuilegluglyaspleuasnpro165170175aspasnseraspvalasplysleupheileglnleuvalglnthrtyr180185190asnglnleupheglugluasnproileasnalaserglyvalaspala195200205lysalaileleuseralaargleuserlysserargargleugluasn210215220leuilealaglnleuproglyglulyslysasnglyleupheglyasn225230235240leuilealaleuserleuglyleuthrproasnphelysserasnphe245250255aspleualagluaspalalysleuglnleuserlysaspthrtyrasp260265270aspaspleuaspasnleuleualaglnileglyaspglntyralaasp275280285leupheleualaalalysasnleuseraspalaileleuleuserasp290295300ileleuargvalasnthrgluilethrlysalaproleuseralaser305310315320metilelysargtyraspgluhishisglnaspleuthrleuleulys325330335alaleuvalargglnglnleuproglulystyrlysgluilephephe340345350aspglnserlysasnglytyralaglytyrileaspglyglyalaser355360365glnglugluphetyrlyspheilelysproileleuglulysmetasp370375380glythrglugluleuleuvallysleuasnarggluaspleuleuarg385390395400lysglnargthrpheaspasnglyserileprohisglnilehisleu405410415glygluleuhisalaileleuargargglngluaspphetyrprophe420425430leulysaspasnargglulysileglulysileleuthrpheargile435440445protyrtyrvalglyproleualaargglyasnserargphealatrp450455460metthrarglysserglugluthrilethrprotrpasnphegluglu465470475480valvalasplysglyalaseralaglnserpheilegluargmetthr485490495asnpheasplysasnleuproasnglulysvalleuprolyshisser500505510leuleutyrglutyrphethrvaltyrasngluleuthrlysvallys515520525tyrvalthrgluglymetarglysproalapheleuserglyglugln530535540lyslysalailevalaspleuleuphelysthrasnarglysvalthr545550555560vallysglnleulysgluasptyrphelyslysileglucyspheasp565570575servalgluileserglyvalgluaspargpheasnalaserleugly580585590thrtyrhisaspleuleulysileilelysasplysasppheleuasp595600605asnglugluasngluaspileleugluaspilevalleuthrleuthr610615620leuphegluaspargglumetileglugluargleulysthrtyrala625630635640hisleupheaspasplysvalmetlysglnleulysargargargtyr645650655thrglytrpglyargleuserarglysleuileasnglyileargasp660665670lysglnserglylysthrileleuasppheleulysseraspglyphe675680685alaasnargasnphemetglnleuilehisaspaspserleuthrphe690695700lysgluaspileglnlysalaglnvalserglyglnglyaspserleu705710715720hisgluhisilealaasnleualaglyserproalailelyslysgly725730735ileleuglnthrvallysvalvalaspgluleuvallysvalmetgly740745750arghislysprogluasnilevalileglumetalaarggluasngln755760765thrthrglnlysglyglnlysasnserarggluargmetlysargile770775780glugluglyilelysgluleuglyserglnileleulysgluhispro785790795800valgluasnthrglnleuglnasnglulysleutyrleutyrtyrleu805810815glnasnglyargaspmettyrvalaspglngluleuaspileasnarg820825830leuserasptyraspvalasphisilevalproglnserpheleulys835840845aspaspserileaspasnlysvalleuthrargserasplys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