由食用微生物表达的多酶反应体系制备肌醇的方法与流程

本发明属于肌醇的酶催化生产领域，具体涉及一种由食用微生物表达的多酶反应体系制备肌醇的方法。
背景技术：
：肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素b族中的一种，结构如下式i所示。肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。目前全球的需求量大概在每年5,000吨左右，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发，例如2013年全球饲料产量为96亿吨，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么饲料工业所需肌醇的产量应该达到190-480万吨。在这种情况下，目前国内甚至全世界的产量都远远不能满足需求。目前肌醇的生产主要还是传统的高温加压水解植酸(六磷酸肌醇)。该工艺设备材质要求严格，一次性投资大；操作压力必须控制在一定的范围内，限制了原材料利用率的提高，且粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高；此外，该工艺会产生大量的磷酸污染物，对水源等环境污染严重。近些年，为了减少能耗和污染，开发了常压水解法。目前研究肌醇生产的热点集中在化学合成法和微生物酶解法，然而均不同程度的存在成本高、产率低等问题。专利cn106148425a描述了一种肌醇的制备方法，尤其涉及体外多酶催化将淀粉以及它们的衍生物转化为肌醇的方法。该方法通过一个体外多酶催化体系将淀粉转化为肌醇，这些关键酶及其作用包括：异淀粉酶(ia，ec3.2.1.68)，将支链淀粉剪枝为直链淀粉；葡聚糖磷酸化酶(αgp，ec2.4.1.1)，从淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；葡萄糖磷酸变位酶(pgm，ec5.4.2.2)，催化葡萄糖-1-磷酸到葡萄糖_6-磷酸；肌醇-3-磷酸合成酶(ips，ec5.5.1.4)，其催化葡萄糖-6-磷酸为肌醇-3-磷酸；肌醇单磷酸酶(imp，ec3.1.3.25)，其将肌醇-3-磷酸脱磷成为肌醇。由于最后两个酶反应是不可逆反应，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。这五种酶对应的基因组dna都可从美国典型培养物收藏所(americantypeculturecollection，以下简称atcc)的官方网站(www.atcc.org)上获得。将这5个基因分别用不同的引物从相应的基因组dna中通过pcr获取，并克隆至原核表达载体pet20b中，获得相应的基因表达载体。再分别将基因表达载体都转化至大肠杆菌表达菌bl21(de3)中进行蛋白质表达。大肠杆菌具有基因结构简单、易于进行基因操作，生长速度快的优点，但大肠杆菌表达的产物中有可能会含有毒蛋白或抗原性蛋白，以及因其细胞壁而产生的内毒素，所以大肠杆菌生产的产品需要严格、复杂的纯化工艺。技术实现要素：为了避免大肠杆菌酶表达体系的不足，本发明的目的在于提供一种新的多酶体系的生产方法，并将其应用于安全要求更高的肌醇的制备当中。出于上述目的，本发明的研究人员试图从对人体和动物无害的表达系统中筛选适宜的菌种。乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌，现在已经广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业中，不论是菌体本身还是其代谢产物都不会产生健康危害，而且培养工艺成熟，适合工业生产。因此，发明人首先选取乳酸菌作为多酶体系的表达系统以期获得具有催化活性且安全性高的多酶。但是，令人遗憾地是，在乳酸菌表达产物中检测到的目标酶活呈阴性，乳酸菌表达系统并不能有效的表达生产肌醇所需的蛋白多酶。发明人又尝试在食品领域应用广泛的酵母中实现该目的。其中，酿酒酵母不但安全、培养成熟，还具有繁殖快，生长周期短的优点；而毕赤酵母表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分离纯化，并且可以在简单合成培养基中实现高密度培养，如果能够在本发明中得到成功应用，将具有巨大的工业潜力。但是，试验结果仍然无法令人满意，酿酒酵母和毕赤酵母的目标酶活同样表现为阴性。在经历多次失败之后，发明人惊喜地发现枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌能够有效地表达出目标多酶，为生产能够运用于食品、生物医药等领域的高品质要求的肌醇提供了可能。枯草芽孢杆菌(bccillussubtilis)是美国fda“公认为安全的物质”(generallyrecognizedassafe,gras)清单中的微生物菌种。谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)是《美国药典》与《美国食品化学法典》附录xv中的食品安全级微生物。基于本发明的研究成果，本发明首先提供了一种制备肌醇用的多酶体系的表达方法，所述多酶体系由食用微生物表达。进一步地，所述食用微生物为枯草芽孢杆菌和/或谷氨酸棒杆菌。进一步地，所述多酶体系为异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶中的一种或多种。食用微生物表达的多酶体系可以根据被催化的底物类型进行选择，淀粉以及不同的淀粉衍生物所需的酶种类不同。优选地，所述多酶体系为葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶。更优选地，所述多酶体系为葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶和异淀粉酶。其次，本发明还提供了一种由食用微生物表达多酶体系制备肌醇的方法，该方法采用前述方法表达的多酶体系，以淀粉或淀粉衍生物为底物，进行酶催化反应，再将反应产物进行分离、纯化，即得肌醇。进一步地，所述的淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精中的任意一种或多种。本发明中，异淀粉酶来源于sulfolobustokodaii,基因在京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，以下简称kegg)上的编号为st0928，葡聚糖磷酸化酶来源于thermotogamaritima，基因在kegg上的编号为tm1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于thermotogamaritima，基因在kegg上的编号为tm0769,肌醇-3-磷酸合成酶来源于archaeoglobusfulgidus，基因在kegg上的编号为af1794,肌醇单磷酸酶来源于thermotogamaritima，基因在kegg上的编号为tm1415，这些基因组dna都可从美国典型培养物收藏所(americantypeculturecollection,以下简称atcc)的官方网站(www.atcc.org)上获得。5种酶对应的基因分别用不同的引物从相应的基因组dna中通过pcr获取，并克隆至表达载体中，获得相应的基因表达载体。再分别将基因表达载体都转化至枯草芽孢杆菌和/或谷氨酸棒杆菌中进行蛋白质表达。根据本发明的一些具体实施例，以枯草芽孢杆菌为食用微生物表达系统时，其载体为pht01。以谷氨酸棒杆菌为食用微生物表达系统时，其载体为pec-xk99e。本发明将目标基因pcr、转载和表达的方法参照simplecloning(you,c.,etal.2012).〃simplecloningviadirecttransformationofpcrproduct(dnamultimer)toescherichiacoliandbacillussubtilis./rappl.environ.microbiol.78(5):1593-1595.)的方法进行。本发明的有益效果在于：成功地从食品工业用菌中筛选出能够表达催化淀粉及其衍生物制备肌醇的多酶体系的菌种，与专利cn106148425a用大肠杆菌为表达系统相比，本发明的方法从根本上避免了生产工艺中肌醇被大肠杆菌产生的毒蛋白、抗原性蛋白或内毒素污染的可能性，避免了严格、复杂的纯化工艺，降低了生产成本。附图说明图1是实施例5制备的肌醇的1h-nmr(d2o，400mhz)图谱；图2是实施例5制备的肌醇的核磁共振解析表及化学结构图；图3是实施例7制备的肌醇的1h-nmr(d2o，400mhz)图谱；图4是实施例7制备的肌醇的核磁共振解析表及化学结构图。具体实施方式以下通过具体实施例对本发明的
发明内容做进一步的阐释，但不应理解为本发明的范围仅限于以下的实例，根据本发明的发明思路和全文内容，可以将以下实例中的各个技术特征做适当的组合/替换/调整/修改等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的，仍属于本发明保护的范畴。主要实验材料可溶性淀粉，solublestarch，acros公司产品，产品编号:424490020；表达载体及宿主细胞(见表-1)，ntcc典型培养物保藏中心；表-1表达体系载体宿主细胞乳酸菌pnz9530nz9000酿酒酵母pyes2y187毕赤酵母ppic9kgs115枯草芽孢杆菌pht01bs168谷氨酸棒杆菌pec-xk99entcc910233实施例1：乳酸菌制备多酶kegg编号分别为st0928、tm1168、tm0769、af1794、tm1415的五个基因从atcc的官方网站(www.atcc.org)上获得。分别用不同的引物从相应的基因组dna中通过pcr获取，通过simplecloning(you,c.,etal.(2012)."simplecloningviadirecttransformationofpcrproduct(dnamultimer)toescherichiacoliandbacillussubtilis."appl.environ.microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pnz9530载体中，获得相应的基因表达载体，再分别都转化至乳酸菌nz9000中，并进行蛋白质表达，经检测，目标酶活呈阴性。实施例2：酿酒酵母制备多酶采用与实施例1相同的方法将5种基因克隆至pyes2载体中，获得相应的基因表达载体，再分别都转化至酿酒酵母y187中，并进行蛋白质表达，经检测，目标酶活呈阴性。实施例3：毕赤酵母制备多酶采用与实施例1相同的方法将5种基因克隆至ppic9k载体中，获得相应的基因表达载体，再分别都转化至毕赤酵母gs115中，并进行蛋白质表达，经检测，目标酶活呈阴性。实施例4：枯草芽孢杆菌制备多酶采用与实施例1相同的方法将5种基因克隆至pht01载体中，获得相应的基因表达载体，再分别转化至谷枯草芽孢杆菌168中，并进行蛋白质表达与纯化。实施例5：体外多酶将淀粉催化转化为肌醇用实施例4制得的多酶进行肌醇制备试验。在一个500毫升的反应体系中含有100mm的hepes缓冲液(ph7.2)，10mm的无机磷酸根，5mm的二价镁离子，0.5mm锌离子，5u/ml的葡聚糖磷酸化酶，lu/ml的葡萄糖磷酸变位酶，5u/ml肌醇-3-磷酸合成酶和2u/ml的肌醇单磷酸酶，lu/ml的异淀粉酶，10g/l的可溶性淀粉，在80℃进行催化反应，反应40个小时后，微滤膜过滤，滤液旋转蒸发器浓缩至约50毫升，冷却、析出结晶，过滤、干燥，得5.8克白色粉末。经测定熔点为224.8～225.4℃，核磁共振1h-nmr(d2o，400mhz)图谱及解析表见图1和图2。实施例6：谷氨酸棒杆菌制备多酶采用与实施例1相同的方法将5种基因克隆至pec-xk99e载体中，获得相应的基因表达载体，再分别转化至谷氨酸棒杆菌ntcc910233中，并进行蛋白质表达与纯化。实施例7：体外多酶将淀粉催化转化为肌醇用实施例6制得的多酶进行肌醇制备试验。在一个500毫升的反应体系中含有100mm的hepes缓冲液(ph7.2)，10mm的无机磷酸根，5mm的二价镁离子，0.5mm锌离子，5u/ml的葡聚糖磷酸化酶，lu/ml的葡萄糖磷酸变位酶，5u/ml肌醇-3-磷酸合成酶和2u/ml的肌醇单磷酸酶，lu/ml的异淀粉酶，10g/l的可溶性淀粉，在80℃进行催化反应，反应40个小时后，微滤膜过滤，滤液旋转蒸发器浓缩至约50毫升，冷却、析出结晶，过滤、干燥，得6.6克白色粉末。经测定熔点为225.2～225.6℃，核磁共振1h-nmr(d2o，400mhz)图谱及解析表见图3和图4。综上所述，采用谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌能够成功地表达目的多酶体系，并实现催化淀粉转化为肌醇。当前第1页12