一种具有抗氧化活性的桑葚多糖-铁螯合物的制备方法与流程

本发明涉及一种具有抗氧化活性的多糖-铁螯合物的制备方法，具体涉及一种具有抗氧化活性桑葚多糖-铁螯合物的制备方法。

背景技术：

铁是人体必需微量元素之一，是血红蛋白和肌红蛋白的核心部分，也是某些酶如过氧化物酶的重要组成部分，对人体的正常功能特别是新陈代谢和免疫功能至关重要。缺铁性贫血(ida)是营养缺乏发病率最高的疾病之一，缺铁严重时会导致细胞内酶功能受损产生消化道和神经系统问题，严重影响人类健康。口服铁补充剂在治疗和预防人体缺铁方面是必需的。硫酸亚铁已被广泛用作治疗缺铁性贫血的铁补充剂。虽然硫酸亚铁在一定程度上可能有助于缓解缺铁和贫血的症状，但也会引起如上腹部疼痛，腹泻和便秘等不良反应，严重时可导致终止治疗，另一方面，铁的摄入量高于所需的量，铁补充剂可能对生物有毒和有害。

多糖是由十个以上的单糖通过糖苷键结合组成的聚合糖高分子碳水化合物，在生物体内不仅是支持组织和能量来源，更重要是参与各项生理活动，如细胞间的识别，激素激活，胚胎形成，神经细胞发育等，对维持正常生命活动有着重要作用。同时多糖具有广泛的生理活性，如降血糖、抗氧化、降血脂、抗病毒、增强免疫等。此外，多糖及其衍生物具有多个羟基、羧基并且含有n、s、p等杂原子的生物活性配体，可以与金属离子配位，形成稳定的配合物。金属离子广泛存在生物体内，细胞间的吸附、金属离子的传递、糖蛋白对细胞表面的结合及毒性机理都涉及到糖与金属离子的相互作用。因此糖与金属离子形成螯合物可以具有双重保健功能，既有较高的药用价值。

中国发明专利申请cn107714720a公开了一种治疗缺铁性贫血的当归黄芪多糖铁复合物的制备方法，第一步按重量份称取当归1份和黄芪3～7份混合后，水提醇沉法提取粗多糖,纯化得当归黄芪多糖混合物，第二步在碱性条件下,按重量份称取2～4份的当归黄芪多糖与1份的柠檬酸三钠混合后，水浴加热,加入适量fecl3，充分反应得当归黄芪多糖铁。该技术的当归黄芪多糖铁为颗粒剂、片剂、丸剂或胶囊，所得的多糖铁复合物具备第三代补铁剂多糖铁的所有优点，而且实现了中西医结合优势互补，可用于治疗缺铁性贫血。但该发明中使用大量的乙醇和乙醚进行洗涤、沉淀，生产成本较高。

中国发明专利申请cn106806383a公开了一种茯苓多糖铁复合物的制备方法，是将茯苓多糖与络合剂、fecl3以质量比为2:1:3在蒸馏水中反应，反应结束之后用乙醇洗涤得到茯苓多糖铁复合物。特征在于铁的含量为4～6％，茯苓多糖的含量为40～65％，在25℃时每100ml水中的溶解度为8～10g。但该发明使用乙醇洗涤生产成本较高，多糖制备纯化程度不够，无法排除其他成分与铁结合造成的影响。

同时现有技术多糖铁复合物功能相对单一，主要用于补铁作用，而同时具有配合的其他功效相对较少，用途单一。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过桑葚多糖与无机铁盐螯合作用制备出一种具有抗氧化活性的补铁剂，利于人体吸收且具有较少的不良反应，使螯合物在治疗缺铁性贫血的同时发挥抗氧化作用，达到双重保健功能。

桑葚具有多种活性成分，作为“药食同源”水果，具有较高的营养价值和药用价值，富含糖、蛋白质、维生素、花色苷、氨基酸、多酚、黄酮及微量元素。根据中医记载，桑椹可以预防肾脏和肝脏的损害，改善视力，加强关节，并具有辐射防护和抗衰老的作用。桑葚多糖已被证实具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力、抗炎和抗肿瘤等生理活性。有关桑葚多糖-铁螯合物的制备及抗氧化活性目前尚无报道，本发明人以桑葚为原料提取多糖，分离纯化后与三价铁离子进行螯合，通过醇沉、透析、冷冻干燥，制备具有抗氧化活性的桑葚多糖-铁螯合物的同时提供良好的补铁剂，所得产品安全性高，纯度高，制备过程有效地排除其他化学成分干扰，在实现螯合物作为补铁剂的同时获得良好的抗氧化活性，并且与原多糖相比，桑葚多糖-铁螯合物的吸收性显著提高，较高的吸收率利于发挥良好的双重保健作用，促进桑葚资源开发利用，有广阔的发展前景。

多糖与铁离子通过螯合反应形成多糖-铁螯合物，作为铁补充剂不仅具有更好的稳定性，水溶性和吸收率等，与硫酸亚铁相比减少游离铁离子对胃肠道刺激等不良反应和更高的生物利用度。同时多糖具有多种生理活性，如提高免疫力、抗氧化，抗肿瘤等，多糖-铁螯合物中的铁释放后，多糖可继续发挥其他药效。因此，多糖-铁螯合物是既可以作为铁补充剂治疗缺铁性贫血，也可以抗氧化，提高机体免疫力等理想药物。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种具有抗氧化活性的桑葚多糖-铁螯合物的制备方法，包括以如步骤：

1)桑葚多糖的提取：将桑葚自然晒干后，采用乙醇回流，除去脂质、色素小分子杂质；70～90℃采用水浴提取2～4h，将水提物浓缩后加入体积浓度40～80％乙醇进行醇沉，得到粗多糖；

2)桑葚多糖的分离：用sevage法对桑葚多糖除蛋白后，使用大孔树脂ab-8对多糖进行静态吸附脱色，室温下振荡使溶液澄清；将上清液浓缩并用蒸馏水透析48～72h；采用体积浓度20～40％乙醇醇沉，离心，弃去上清液，将沉淀溶于蒸馏水，将得到的溶液冷冻干燥，得到桑葚多糖；

3)桑葚多糖的纯化：把步骤(2)得到的桑葚多糖溶于水，用deae-52纤维素离子交换层析柱纯化，以0.1～0.5mol/lnacl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到螯合用的桑葚多糖；

4)桑葚多糖铁复合物的制备：将步骤(3)所得的桑葚多糖与柠檬酸三钠以质量比3:1～2:1溶于蒸馏水中，加入铁盐溶液至生成红棕色沉淀，用naoh溶液调节ph8.0～9.0，将反应液在60～70℃加热反应1～1.5h，离心后，上清液通过透析除盐，最后通过乙醇醇沉，冷冻干燥，得到桑葚多糖～铁螯合物。

为进一步实现本发明目的，优选地，步骤2)所述sevage试剂的配制方法为三氯甲烷、正丁醇按体积比3:1～4:1混合，sevage法脱蛋白的方法为多糖与sevage试剂按体积比为1:3～1:4混合，振荡10～20min，5000～6000r/min离心5～10min，取出上层多糖溶液，再按上述步骤重复10～13次，至蛋白脱除完全。

优选地，步骤1)、步骤2)和步骤3)所述醇沉方法为3～4℃放置12～24小时。

优选地，步骤3)所述以0.1～0.5mol/lnacl溶液为洗脱剂，收集所得多糖主要集中在0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/lnacl浓度。

优选地，步骤4)所述铁盐溶液为fecl3溶液；所述的铁盐溶液的浓度为1.8～2mol/l。

优选地，步骤1)所述乙醇回流是70～90℃，采用90～95％乙醇回流4～5h。

优选地，步骤1)所述的水浴提取的次数为2-3次。

优选地，步骤2)所述的室温下振荡使溶液澄清的振荡速度为400～500rpm。

优选地，步骤2)所述的离心的转速为4500～5000r/min，离心的时间为5～10min。

优选地，步骤4)所述的naoh溶液的浓度为1.5～2mol/l；步骤4)所述的离心的转速为4500～5000r/min，离心的时间为5～8min；步骤4)所述的乙醇醇沉的乙醇体积浓度为70～80％。

与已有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明原料纯度的高，桑葚多糖采用水提醇沉法，经脱蛋白、脱色等工艺分离，通过deae～52纤维素层析柱纯化得到较均一的纯多糖。

2)本发明制备的具有抗氧化活性桑葚多糖-铁螯合物在小肠的吸收率明显高于原多糖的吸收率，人体对螯合物中多糖和铁的吸收效果得到较好的改善。

3)本发明制备的具有抗氧化活性桑葚多糖-铁螯合物能明显清除超氧自由基，并且抗氧化活性相对于原多糖大幅度提高。

4)本发明制备的具有抗氧化活性桑葚多糖-铁螯合物的制备工艺流程简单，原料易得，成本低，能够实现大批量生产。

附图说明

图1为实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物对超氧自由基清除能力效果图。

图2为实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物对超氧自由基清除能力ic50对比图。

图3为小肠对实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物吸收率的对比图。

图4为小肠对实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖螯合物累计吸收量的对比图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施不限于此。

实施例1、实施例2和实施例3中步骤(2)所述sevage试剂的配制方法为三氯甲烷、正丁醇按体积比4:1混合，sevage法脱蛋白的方法为多糖与sevage试剂按体积比为1:4混合，振荡20min，5000r/min离心5min，取出上层多糖溶液，再按上述步骤重复10～13次，至蛋白脱除完全。

实施例1

(1)桑葚多糖的提取：将500g桑葚自然晒干后，采用70℃，95％乙醇回流4h，除去脂质、色素等小分子杂质。采用90℃水浴提取2h，共两次，将水提物浓缩后加入80％乙醇醇沉，得到粗多糖。

(2)桑葚多糖的分离：用sevage法对桑葚多糖除蛋白后，使用大孔树脂ab-8对多糖进行静态吸附脱色，并通过在室温下以400rpm振荡使溶液澄清。将上清液浓缩并用蒸馏水透析72h。最后加入40％乙醇醇沉，5000r/min，离心5min，弃去上清液，将沉淀溶于蒸馏水，将得到的溶液冷冻干燥，得到桑葚多糖。

(3)桑葚多糖的纯化：把步骤(2)得到的桑葚多糖溶于水，用deae-52纤维素离子交换层析柱纯化，分别以0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/lnacl溶液为洗脱剂洗脱，主要收集0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/lnacl浓度洗脱得到的多糖溶液，经过浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到螯合用的桑葚多糖，分别命名为mfp1、mfp2和mfp3。

(4)桑葚多糖抗氧化功效：通过体外实验对超氧自由基的抑制作用评价其抗氧化功效。

(5)桑葚多糖的小肠吸收能力：通过外翻肠囊法评价小肠对桑葚多糖的吸收效果。

实施例2

(1)桑葚多糖的提取：将500g桑葚自然晒干后，采用70℃，95％乙醇回流4h，除去脂质、色素等小分子杂质。采用90℃水浴提取2h，共两次，将水提物浓缩后加入80％乙醇醇沉，得到粗多糖。

(2)桑葚多糖的分离：用sevage法对桑葚多糖除蛋白后，使用大孔树脂ab-8对多糖进行静态吸附脱色，并通过在室温下以400rpm振荡使溶液澄清。将上清液浓缩并用蒸馏水透析72h。最后加入40％乙醇醇沉，5000r/min，离心5min，弃去上清液，将沉淀溶于蒸馏水，将得到的溶液冷冻干燥，得到桑葚多糖。

(3)桑葚多糖的纯化：把步骤(2)得到的桑葚多糖溶于水，用deae-52纤维素离子交换层析柱纯化，分别以0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/lnacl溶液为洗脱剂洗脱，主要收集0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/lnacl浓度洗脱得到的多糖溶液，进过浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到螯合用的桑葚多糖，分别命名为mfp1、mfp2和mfp3。

(4)桑葚多糖-铁螯合物的制备：将步骤(3)所得的桑葚多糖与柠檬酸三钠以质量比2:1溶于蒸馏水中，加入2mol/l的fecl3溶液至生成红棕色沉淀，用2mol/l的naoh溶液调节ph8.0～9.0，期间naoh与fecl3交替滴加，将反应液在70℃加热反应1h，5000r/min，离心5min后，上清液通过透析除盐，最后加入80％乙醇醇沉12h，冷冻干燥，得到桑葚多糖-铁螯合物，分别命名为mfp1-fe、mfp2-fe和mfp3-fe。

(5)桑葚多糖-铁螯合物抗氧化功效：通过体外实验对超氧自由基的抑制作用评价其抗氧化功效。

(6)桑葚多糖-铁螯合物的小肠吸收能力：通过外翻肠囊法评价小肠对桑葚多糖的吸收效果。

实施例3

(1)桑葚多糖的提取：将500g桑葚自然晒干后，采用90℃，90％乙醇回流5h，除去脂质、色素等小分子杂质。采用70℃水浴提取4h，共两次，将水提物浓缩后加入40％乙醇醇沉，得到粗多糖。

(2)桑葚多糖的分离：用sevage法对桑葚多糖除蛋白后，使用大孔树脂ab-8对多糖进行静态吸附脱色，并通过在室温下以500rpm振荡使溶液澄清。将上清液浓缩并用蒸馏水透析48h。最后加入20％乙醇醇沉，4500r/min，离心10min，弃去上清液，将沉淀溶于蒸馏水，将得到的溶液冷冻干燥，得到桑葚多糖。

(3)桑葚多糖的纯化：把步骤(2)得到的桑葚多糖溶于水，用deae-52纤维素离子交换层析柱纯化，分别以0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/lnacl溶液为洗脱剂洗脱，主要收集0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/lnacl浓度洗脱得到的多糖溶液，进过浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到螯合用的桑葚多糖，分别命名为mfp1、mfp2和mfp3。

(4)桑葚多糖-铁螯合物的制备：将步骤(3)所得的桑葚多糖与柠檬酸三钠以质量比3:1溶于蒸馏水中，加入1.8mol/l的fecl3溶液至生成红棕色沉淀，用1.5mol/l的naoh溶液调节ph8.0～9.0，期间naoh与fecl3交替滴加，将反应液在60℃加热反应1.5h，4500r/min，离心8min后，上清液通过透析除盐，最后加入70％乙醇醇沉24h，冷冻干燥，得到桑葚多糖-铁螯合物，分别命名为mfp1-fe＇、mfp2-fe＇和mfp3-fe＇。

实施例4

通过连苯三酚法检测不同浓度桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物对超氧自由基的抑制作用。

将4.5ml，50mm的tris-hcl缓冲液(ph8.2)在25℃条件下水浴20min，加入1ml不同浓度的样液和抗坏血酸溶液和0.4ml，25mm的连苯三酚溶液，25℃反应5min，最后加入1ml，8mm的hcl终止反应，在325nm处测吸光值。以去离子水代替样品作为空白对照，以去离子水代替连苯三酚作为背景对照，抗会血酸为阳性对照。超氧自由基清除活性计算如下：

超氧自由基清除率(％)＝[1-(a样品-a背景对照)/a空白对照]×100％

图1为实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物对超氧自由基清除能力效果图。图2为实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物对超氧自由基清除能力ic50对比图。

通过origin软件和spss进行数据分析，以样品浓度为横坐标，超氧自由基清除率为纵坐标，绘制清除率随样品浓度变化图，得图1，通过比较不同样品间ic50值得图2，p<0.05。

从图1和图2中可以看出桑葚多糖-铁螯合物比桑葚多糖具有更强的超氧自由基清除能力，两者对超氧自由基的抑制作用呈现剂量依赖关系，当样品浓度达到2mg/ml时，桑葚多糖-铁螯合物的抑制效果与vc的抑制效果接近，ic50值反应样品对超氧自由基的抑制能力，桑葚多糖-铁螯合物的ic50值均低于0.7mg/ml，而原桑葚多糖的ic50值均高于2mg/ml，进一步说明桑葚多糖-铁螯合物具有较好的抗氧化功能，而这可归结于多糖与铁螯合后，多糖与超氧自由基的作用基团暴露出来，更容易与超氧自由基结合，从而提高了抗氧化活性。证明了桑葚多糖-铁螯合物作为补铁剂的同时可达到抗氧化的双重保健作用。

实施例5

通过外翻肠膜法测定不同时间小肠对桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物的吸收能力；

选取健康的昆明鼠，禁食24h，用乙醚麻醉，立即打开腹腔，分离出小肠，放入小肠缓冲液中，用缓冲液冲洗小肠表面，清除浆膜层外面的脂肪组织。剪取大约10cm的一段小肠，将肠段翻转使粘膜层在外，浆膜层在内，洗净内容物，用手术线结扎肠段一端，另一端用手术线结扎在塑料管上。肠囊内注入约1ml空白小肠缓冲液，滤纸吸干表面，放入含有0.5mg/ml桑葚多糖及其铁螯合物小肠缓冲液的小试管中，通入空气，置于水浴锅中37℃保温。在吸收开始后的15min,30min,60min,90min,120min,用取样器取出小囊中的所有内液,然后加入1ml新鲜小肠缓冲液,继续实验。样品取出后放入离心管中4000r/min离心20min，取上清液用苯酚-硫酸法进行显色反应，测定样品在490nm处的吸光度，根据吸光度计算桑葚多糖含量，计算每个时间段桑葚多糖及其铁螯合物的吸收率。

结果表示如下：

吸收率(％)＝所测多糖含量/总多糖含量×100％

累积吸收量(μg)＝该时段所测多糖含量的总和

图3为小肠对实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖-铁螯合物吸收率的对比图。图4为小肠对实施例1和实施例2所得的桑葚多糖和桑葚多糖螯合物累计吸收量的对比图。

通过origin软件和spss进行数据分析，以不同时间点为横坐标，该时间下小肠吸收率为纵坐标，绘制吸收率随时间变化图，得图3，通过比较不同样品间在反应2h后小肠累计吸收总糖量得图4，p<0.05。

从图3和图4中可以看不同时间段小肠对桑葚多糖-铁螯合物的吸收率均高于对原桑葚多糖，并且随着时间的增加，小肠对螯合物的吸收率的增加趋势也强于对原多糖的趋势。在进行两小时吸收实验后，小肠对桑葚多糖-铁螯合物的累计吸收量明显高于对原多糖的累计吸收量，总体吸收强度均呈现出桑葚多糖-铁螯合物强于原桑葚多糖，这可能由于多糖与铁螯合后，多糖结构发生改变，由原来扁片状变为以铁核为中心的杆状，更易于多糖-铁螯合物进入细胞，进一步说明，桑葚多糖在与铁螯合后，其螯合物的吸收性显著提高，更加便于人体吸收利用。

实施例3得到的桑葚多糖-铁螯合物mfp1-fe＇、mfp2-fe＇和mfp3-fe＇与实施例2得到的桑葚多糖-铁螯合物mfp1-fe、mfp2-fe和mfp3-fe通过体外实验对超氧自由基的抑制作用评价以及通过外翻肠囊法评价小肠对桑葚多糖的吸收效果均相似，不一一提供。

目前已有的多糖-铁螯合物已被证实具有良好的补血作用，但是在抗氧化和吸收性方面并未得到关注，本实施例证明桑葚多糖-铁螯合物的抗氧化活性显著提高，并且人体吸收性提高，利于人体利用。

本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。