用于鉴别杂交棉品种中棉1279的SSR引物对及其产品以及鉴别方法与流程

本发明涉及分子检测领域，具体而言，涉及用于鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对及其产品以及鉴别方法。
背景技术：
：杂种优势利用是提高棉花产量、改善纤维品质和增强棉花品种适应性的有效手段，棉花杂交品种在我国得到了广泛推广。然而，棉花是常异花授粉作物，田间的杂交工作主要通过人工授粉，耗时费力，进而导致制种成本远远高于常规棉。受利益驱动，市场上时常存在通过常规棉冒充或替换杂交种的现象。因此，有效鉴别杂交棉势在必行。目前，育种家往往采用通过肉眼观察和长期的育种经验等传统的技术和方法来判断杂交棉，这种方法非常耗时费力，每年只能在棉花生长期内集中大量人力进行；受田间环境影响较大，每年田间环境(病害、虫害、降雨等)差异导致棉花表型差异较大，对育种家的判断造成重大干扰；另外，受育种家主观方面的制约，育种家的经验往往对判断杂交棉有很大限制。分子生物学的快速发展为育种鉴定工作提供了方便，其中ssr标记以其准确性高、稳定性强、简单实用、快速方便、易于高通量等优势被广泛用于品种鉴定。这些优点弥补了传统鉴定方法的不足。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供用于鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对，这些上下游引物能有效区分中棉1279与其他棉花品种，特异性强，能稳定有效地鉴别中棉1279。本发明的第二目的在于提供鉴别杂交棉品种中棉1279的试剂盒，该试剂盒为审定品种中棉1279的鉴定提供便利。本发明的第三目的在于提供杂交棉品种中棉1279的鉴别方法，该方法通过分子水平实现鉴别，可靠程度高。以往的田间工作中，育种家往往通过传统手段依据棉花形态性状对杂交棉进行田间鉴定，这种方法不仅时效性差，耗费精力，而且很容易受到外界环境和本人主观因素的影响。因此，利用分子标记进行杂交品种快速鉴定应运而生。国际植物品种保护联盟(upov)在bmt分子测试指南中，将构建dna指纹数据库的方法确定为ssr和snp。目前，利用ssr分子标记对材料进行鉴定的方法已经在各种作物中得到广泛应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：用于鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对，包括以下中的任一种或多种：nau2836上下游引物、bnl3255上下游引物、nau1233上下游引物、nau2671上下游引物、nau1070上下游引物、cir043上下游引物、bnl1154上下游引物、nau3675上下游引物；所述nau2836上下游引物的核酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述bnl3255上下游引物的核酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示；所述nau1233上下游引物的核酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；所述nau2671上下游引物的核酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示；所述nau1070上下游引物的核酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；所述cir043上下游引物的核酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示；所述bnl1154上下游引物的核酸序列如seqidno.13和seqidno.14所示；所述nau3675上下游引物的核酸序列如seqidno.15和seqidno.16所示。即本发明在鉴别杂交棉品种中棉1279时，所用的ssr引物对可以为上述上下游引物的任意一种、任意两种、任意三种、任意四种、任意五种等等，当然，理论上来讲，检测时所用的上下游引物越多，则检测的准确度越高。本发明以陆地棉的26条染色体设计182对引物，即平均每条染色体上设计7对引物，得到的ssr引物对对检测物进行pcr扩增，待检测物包括杂交棉品种中棉1279与10个棉花品种，然后将不同的棉花品种进行比较，筛选得到鉴别杂交棉品种中棉1279的特异性上下游引物。这些上下游引物特异性强，能很好的将杂交棉品种中棉1279与其他品种区分。选择鉴别的棉花品种需要较丰富的遗传多样性，并且能代表各个不同棉区的育种情况。本发明中的10个棉花品种包括陆地棉遗传标准系(tm-1)和来源于三大棉区(黄河流域、长江流域、西北内陆)，即本发明选用了不同棉区已经被大面积推广的品种，它们基本代表了不同棉区的育种水平。用于鉴别杂交棉品种中棉1279更具有实际意义。10个棉花品种具体如下：陆地棉遗传标准系tm-1；黄河流域棉区陆地棉品种中棉所10号和鲁棉研28号；长江流域棉区陆地棉品种蜀棉2号、川棉239、鄂棉18号和泗棉2号；黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种中棉所12；西北内陆棉区陆地棉品种中棉所49和新陆中69号。这些棉花品种均为公开的棉花品种，如可从中国农业科学院棉花研究所或者其他棉花品种公司购买获得。本发明还提供了鉴别杂交棉品种中棉1279的试剂盒，含有上述的ssr引物对。该试剂盒为杂交棉品种中棉1279的鉴别提供便利。本发明还提供了上述的ssr引物对在鉴别杂交棉品种中棉1279中的应用。具体地，本发明提供的一种杂交棉品种中棉1279的鉴别方法，包括以下步骤：以上述的ssr引物对对待检测样本提取的基因组进行扩增，检测扩增产物的带型，判断待检测样本是否为杂交棉品种中棉1279。进一步地，所述扩增的退火温度为58±1℃。进一步地，所述带型的检测采用毛细管电泳检测。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)又称高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，hpce)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳能更好的区别条带的大小，为检测的准确进行提供良好的基础。进一步地，所述待检测样本包括以下中的任一种材料：棉花种子、棉花叶、棉花根、棉花茎棉花胚根、棉花胚芽。进一步地，所述待检测样本可区分的棉花品种包括陆地棉遗传标准系tm-1、黄河流域棉区陆地棉品种、长江流域棉区陆地棉品种、黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种、西北内陆棉区陆地棉品种。本发明中，黄河流域棉区陆地棉品种是指在黄河流域棉区被审定的陆地棉品种，且能在该棉区获得最大的生长潜力；同样地，长江流域棉区陆地棉品种是指在长江流域棉区被审定的陆地棉品种，且能在该棉区获得最大的生长潜力；而黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种则是指在两者棉区在这两个棉区分别被审定的陆地棉品种，且能同时在这两个棉区获得最大的生长潜力。具体地，所述黄河流域棉区陆地棉品种包括中棉所10号和鲁棉研28号；所述长江流域棉区陆地棉品种包括蜀棉2号、川棉239、鄂棉18号和泗棉2号；所述黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种包括中棉所12；所述西北内陆棉区陆地棉品种包括中棉所49和新陆中69号。也就是说，本发明待检测样本可区分的棉花品种包括陆地棉遗传标准系tm-1、中棉所10号、鲁棉研28号、蜀棉2号、川棉239、鄂棉18号和泗棉2号、中棉所12、中棉所49和新陆中69号。进一步地，采用以下方法判断待检测样本是否为杂交棉品种中棉1279：对于nau2836上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有69bp和158bp的条带；对于bnl3255上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有215bp的条带；对于nau1233上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有70bp的条带；对于nau2671上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有78bp的条带；对于nau1070上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有82bp、193bp和208bp条带；对于cir043上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有157bp和180bp的条带；对于bnl1154上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有56bp的条带；对于nau3675上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有84bp的条带。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对，能够很好的将中棉1279与其他棉花品种区分开，检测稳定可靠。(2)本发明提供的鉴别杂交棉品种中棉1279的试剂盒，为杂交棉品种中棉1279的鉴别提供便利。(3)本发明提供的一种杂交棉品种中棉1279的鉴别方法，能稳定有效的判断待检测物是否为杂交棉品种中棉1279。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例1中nau2836上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图2为本发明实施例1中bnl3255上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图3为本发明实施例1中nau1233上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图4为本发明实施例1中nau2671上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图5为本发明实施例1中nau1070上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图6为本发明实施例1中cir043上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图7为本发明实施例1中bnl1154上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图8为本发明实施例1中nau3675上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图9为本发明实施例1中bnl1053上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图10为本发明实施例1中bnl3442上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图11为本发明实施例1中bnl4047上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图；图12为本发明实施例1中cgr5707上下游引物对不同棉花品种的扩增产物电泳图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例11、棉花材料以下棉花品种的种子：中棉1279、陆地棉遗传标准系tm-1、中棉所10号、鲁棉研28号、蜀棉2号、川棉239、鄂棉18号和泗棉2号、中棉所12、中棉所49、新陆中69号。2、dna提取取中棉1279和其它作为对照的10份材料种子，去壳，采用sds法提取基因组dna，并稀释成最终浓度为50ng/μl。3、ssr引物的扩增以上述提取的基因组dna为模板，针对陆地棉26条染色体选择182对引物(平均每条染色体上7对引物)进行ssrpcr扩增。pcr反应体系为10μl，扩增混合体系如表1所示，pcr扩增程序如表2所示。表1pcr扩增反应体系试剂体积taqmix5.0μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl模板dna1.0μlddh2o3.0μl总体积10μl表2pcr扩增程序4、扩增产物检测由于本发明提供的上下游引物针对棉花染色体上的ssr序列得到，因此，使用该引物得到的片段的长度较小，一般在50-400bp，因此扩增产物选用高分辨率的毛细管电泳检测，具体选用fa-96全自动毛细管电泳系统和配套的dnf-910试剂盒进行检测。选用的ssr引物对共182对，其中，列举如表3所述的上下游引物进行说明。表3ssr引物对按毛细管电泳系统的建议操作进行具体操作，每个点样孔中加入的全部的扩增产物。最终在prosize2.0软件中查看结果相关信息。通过毛细管电泳，最终鉴定出8对在杂交棉品种中棉1279中有特异性扩增条带的引物。8对特异性引物的扩增产物如下：如图1所示，对于nau2836上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有69bp和158bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图2所示，对于bnl3255上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有215bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图3所示，对于nau1233上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有70bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图4所示，对于nau2671上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有78bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图5所示，对于nau1070上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有82bp、193bp和208bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图6所示，对于cir043上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有157bp和180bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图7所示，对于bnl1154上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有56bp的条带，其他棉种无该大小的条带；如图8所示，对于nau3675上下游引物的扩增产物来说，中棉1279有84bp的条带，其他棉种无该大小的条带。即对于这10个棉花品种，能够鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对包括nau2836上下游引物、bnl3255上下游引物、nau1233上下游引物、nau2671上下游引物、nau1070上下游引物、cir043上下游引物、bnl1154上下游引物、nau3675上下游引物中的任一种或多种。剩余174对ssr标记在中棉1279和10份对照品种中扩增出相同的条带，即这些标记在参试品种中无特异性条带。其他未扩增出特异条带的图谱进行举例说明，具体如图9-图12所示。如图9所示，对于bnl1053上下游引物(如seqidno.17和seqidno.18所示)的扩增产物来说，在所鉴定的11份品种中同时扩增出76bp和313bp两条条带；如图10所示，对于bnl3442上下游引物(如seqidno.19和seqidno.20所示)的扩增产物来说，在所鉴定的11份品种中同时扩增出82bp和164bp两条条带；如图11所示，对于bnl4047上下游引物(如seqidno.21和seqidno.22所示)的扩增产物来说，在所鉴定的11份品种中同时扩增出168bp条带；如图12所示，对于cgr5707上下游引物(如seqidno.23和seqidno.24所示)的扩增产物来说，在所鉴定的11份品种中同时扩增出154bp条带。上述内容可知，本发明提供的nau2836上下游引物、bnl3255上下游引物、nau1233上下游引物、nau2671上下游引物、nau1070上下游引物、cir043上下游引物、bnl1154上下游引物、nau3675上下游引物对杂交棉品种中棉1279均有较好的特异性，均能很好的将杂交棉品种中棉1279与其他10种棉花品种分开。另外，本发明采用毛细管电泳分辨ssrpcr扩增产物，毛细管电泳可以区分开相差2bp以上的条带，分辨率高，且毛细管电泳分辨扩增产物方便高效。实施例2对杂交棉品种中棉1279以及其他棉花品种按照实施例1的方法进行检测，得到的结果完全与实施例1一致。说明本发明提供的ssr引物对检测的稳定性佳，能有效的将杂交棉品种中棉1279与其他品种区分开。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。sequencelisting<110>中国农业科学院棉花研究所<120>用于鉴别杂交棉品种中棉1279的ssr引物对及其产品以及鉴别方法<130>2019<160>24<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1attggaagggtattgagctg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tcctttcccacttctgttct20<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3gacagtcaaacagaacagatatgc24<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ttacacgacttgttcccacg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ttcgggaaagttagaggaga20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6tcctcagagctcggaatagt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ttgcaaccctaatgtcaatg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8aaacgatgggaaaagtggta20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ccctccataaccaaaagttg20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10accaacaatggtgacctctt20<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11cagggcttctttattatgt19<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<400>12ggtgaagtggtttctctc18<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13catctattttcgtggggtgc20<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<400>14aaccctttgttcaatttctcg21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15ggctttgcctgtgaatctat20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16aggtttgaggctgagagtgt20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17agggtctgtcatggttggag20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18catgcatgcgtacgtgtgta20<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<400>19cattagcggatttgtcgtga20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20aacgaacaaagcaaagcgat20<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列<400>21caccaaggagctctgcaaat20<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<400>22atctgcagcaaatagtgactcg22<210>23<211>22<212>dna<213>人工序列<400>23aaacccgatatccttagccttt22<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<400>24ggaaaggaggaagaggagga20当前第1页12