一种丝瓜抗黄瓜花叶病毒CMV主效QTL的SLAF-SNP分子标记方法及应用与流程

本发明涉及一种slaf-snp分子标记方法及应用，特别是涉及一种丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

丝瓜是我国主要的渡秋淡蔬菜之一，黄瓜花叶病毒导致的病毒病是危害丝瓜的重要病害，对丝瓜的产量和品质均有较大影响，大田发病率达25～40％，个别地区和年份，病株率高达100％，病瓜畸形，品质差，造成很多营养成分的降低，严重影响了丝瓜的生产。

植物病毒病被称为植物的“癌症”，尚无特效的药剂可以使用，且黄瓜花叶病毒的寄主范围广，可浸染100多个科的1000多种植物，使其防治更加困难，因此，发掘并利用抗病基因，通过培育抗病毒病的丝瓜品种是防治丝瓜病毒病最为经济、有效的途径。

目前，尚缺乏有效充足的分子标记以供利用，限制了丝瓜抗病毒病基因的准确定位，进而限制了分子标记辅助育种技术的应用，单靠常规方法育种改良，周期长，效率低，造成丝瓜抗病毒病育种进展缓慢，关于丝瓜病毒病的研究，大多集中在防治方法、资源筛选等方面，而对抗病基因的分子机理研究较少，尤其是关于基因分子标记定位的研究尚不深入，因此，加强丝瓜抗黄瓜花叶病毒主效基因的挖掘利用，开发出用于辅助育种的分子标记，对丝瓜抗病毒病的分子育种至关重要。

单核苷酸多态性snp，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，其在基因组上，数量多，分布广泛，适用于快速、规模化的筛查，随着测序技术的兴起，snp标记，具有易于开发，易于基因分型等优点，广泛用于高密度遗传图谱的构建，基因的精细定位，大量样本的分子标记验证、分子标记辅助育种以及资源鉴定等方面。

技术实现要素：

本发明的主要目的是为了提供一种丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，在挖掘与丝瓜黄瓜花叶病毒抗性qtl紧密连锁标记的基础上进行的。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，包括如下步骤：

步骤1：高密度丝瓜遗传图谱的构建

定位分离群体的构建、丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性鉴定、丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析、dna提取及高通量测序；

步骤2：丝瓜抗cmv的qtl定位

根据f2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用r/qtl进行qtl定位分析，绘制病级性状qtl分布图。

进一步的，定位分离群体的构建，包括：以感cmv的丝瓜高代自交系“p1-21”为母本，以抗cmv的丝瓜高代自交系“p2-16”为父本，杂交获得f1代，f1单株自交获得f2代遗传分离群体。

进一步的，丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性鉴定，包括：丝瓜的黄瓜花叶病毒接种体系和抗性鉴定。

进一步的，丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析，包括：对f2群体及部分f2和f3群体的病毒病抗性进行鉴定及分析，明确丝瓜抗cmv基因的遗传方式。

进一步的，dna提取及高通量测序，包括：

采用ctab法提取双亲及分离群体f2各单株丝瓜叶片的基因组dna进行slaf-seq测序；

利用slaf-seq技术和highmap软件对丝瓜物种f2遗传分离群体开发高密度分子标签；

筛选父母本都为杂合且亲本间具有多态性的位点，作为符合群体特征的有效标签，经过标记筛选，最终绘制出丝瓜高密度遗传连锁图谱。

进一步的，丝瓜物种f2遗传分离群体包括2个亲本和130个子代。

进一步的，丝瓜抗cmv的qtl定位，包括：根据f2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用r/qtl进行qtl定位分析，根据连锁群的信息和标记与性状的连锁关系，绘制病级性状qtl分布图。

一种丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记的应用，根据连锁群的信息，对丝瓜黄瓜花叶病毒病的抗性表型和标记的连锁关系进行关联分析，获得与性状紧密关联的分子标签和候选区域。

本发明的有益技术效果：

本发明提供的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，采用高通量的测序开发标记，快速，高效的构建了高密度的丝瓜遗传图谱，在此基础上，结合群体的抗性表型数据，获得了丝瓜控制抗黄瓜花叶病毒基因的连锁标记区段，不仅解决了丝瓜可用于定位的分子标记缺乏的问题，而且极大缩短了与性状连锁标记的开发周期。

本发明提供的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，与丝瓜黄瓜花叶病毒病基因紧密连锁标记的引物，有助于标记用于辅助育种。

本发明提供的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，为其他缺乏基因组数据的小作物基因组生物的标记开发，基因定位和基因组研究提供参考。

附图说明

图1为按照本发明的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法的一优选实施例的丝瓜f2群体的病级分布图；

图2为按照本发明的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法的一优选实施例的丝瓜cmv抗性相关的qtl定位图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本实施例提供的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，包括如下步骤：

步骤1：高密度丝瓜遗传图谱的构建

定位分离群体的构建、丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性鉴定、丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析、dna提取及高通量测序；

步骤2：丝瓜抗cmv的qtl定位

根据f2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用r/qtl进行qtl定位分析，绘制病级性状qtl分布图。

高密度丝瓜遗传图谱的构建：

定位分离群体的构建：以感cmv的丝瓜高代自交系“p1-21”为母本，以抗cmv的丝瓜高代自交系“p2-16”为父本，杂交获得f1代,f1单株自交获得f2代遗传分离群体。

丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性鉴定：丝瓜的黄瓜花叶病毒接种体系和抗性鉴定，参照顾兴芳，等(2005)(顾兴芳，张圣平，冯兰香，杨宇红，杨翠荣.黄瓜抗病毒病材料的鉴定与筛选[j].中国蔬菜，2005，6:21-23.)对黄瓜的分级标准进行。

丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析：对f2群体的病毒病抗性进行鉴定及分析，明确丝瓜抗cmv基因的遗传方式为数量遗传。如图1。f2群体的病级分布，都呈现出一种连续的分布，证明丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传为数量遗传。

dna提取及高通量测序：采用ctab法提取双亲及分离群体f2各单株丝瓜叶片的基因组dna进行slaf-seq测序；利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的slaf-seq技术和highmap软件对丝瓜物种f2遗传分离群体(2个亲本和130个子代)开发高密度分子标签，筛选父母本都为杂合且亲本间具有多态性的位点，作为符合群体特征的有效标签。经过对上图的标记进行筛选，最终绘制出丝瓜高密度遗传连锁图谱。以连锁群为单位，采用highmap软件分析获得连锁群内marker的线性排列，并估算相邻marker间的遗传距离，最终得到总图距为1518.56cm的遗传图谱。遗传图平均图距为：0.41cm,构建完成了普通丝瓜的高密度遗传连锁图谱。

丝瓜抗cmv的qtl定位：

根据f2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用r/qtl进行qtl定位分析，首先通过pt检验1000次设定阈值，先考虑0.99置信度对应的阈值，若没有定位区间则考虑0.95置信度对应的阈值；若没有定位区间则考虑0.90置信度的阈值。若仍没有结果则不考虑pt检验的结果，手动降低阈值到3.0。在连锁群4上获得与病毒病抗性基因相关联区域，对应的基因组位置以及其他信息如表1。根据连锁群的信息和标记与性状的连锁关系，在连锁群4上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状，如图2。

标记的定位区间1.923cm(42.475～44.398cm)，标记的最大贡献率为：9.75％。

一种丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记的应用，根据连锁群的信息，对丝瓜黄瓜花叶病毒病的抗性表型和标记的连锁关系进行关联分析，获得与性状紧密关联的分子标签和候选区域，如表1所示，slaf-marker12148为与丝瓜抗黄瓜花叶病毒病基因紧密连锁的snp标记，标记序列为：

ttatttttctattttgtacttttagttaatgcaattgatcttttcttttatactattgagaatattatttttctttttaaagttcctagttattctatcaxxxxxxxxxxttgtcctacctaatttctaatttttattgcttgcaaatacttggatgggggagggagcttattaggatgattttactcctcacaaaatctta(t/g)gacaaaa

该snp标记位点的多态性变异为单个核苷酸的颠换，具体为胸腺嘧啶(t)和鸟嘌呤的颠换。

随着测序技术的发展，测序成本降低，通过对大批量样本的测序进行基因片段的测序和序列比较，进而确定标定位点的碱基是否变异，测出率可达100％，因此该标记位点，可用于分子标记辅助选择育种，特异性地追踪连锁群4上的抗丝瓜黄瓜花叶病毒基因。

表1丝瓜cmv抗性qtl的标记信息

综上所述，在本实施例中，本实施例提供的丝瓜抗黄瓜花叶病毒cmv主效qtl的slaf-snp分子标记方法，采用高通量的测序开发标记，快速，高效的构建了高密度的丝瓜遗传图谱，在此基础上，结合群体的抗性表型数据，获得了丝瓜控制抗黄瓜花叶病毒基因的连锁标记区段，不仅解决了丝瓜可用于定位的分子标记缺乏的问题，而且极大缩短了与性状连锁标记的开发周期，与丝瓜黄瓜花叶病毒病基因紧密连锁标记的引物，有助于标记用于辅助育种，也为其他缺乏基因组数据的小作物基因组生物的标记开发，基因定位和基因组研究提供参考。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。