本发明属于海洋微生物药物的应用领域，具体涉及杂萜化合物及其制备方法与应用和抗肿瘤的药物。
背景技术：
疾病的复杂性和多变性使得新药研发的重要性不容忽视，而天然产物是药物的重要来源。微生物的易于培养和规模化放大及环境友好的特点使其成为天然产物研究的重要对象。海洋环境的特殊性加上海洋微生物资源获取技术的进步又给海洋微生物源天然药源化合物的研究带了前所未有的机遇。海洋微生物中的海洋真菌是活性次级代谢产物的丰富的来源。
肿瘤细胞的增殖、存活和分化，受到多种遗传和分子改变的影响。多种类型的化合物中都发现过抗肿瘤活性物质，如生物碱类化合物、甾体类化合物、黄酮类化合物、蒽醌类化合物等。
从海洋真菌次级代谢产物或其衍生物中寻找具有新颖作用机制的高效抗癌新药是抗癌药物研发的一个重要方向，以海洋真菌为原料发现具有特定结构类型的天然产物对于海洋药物的研发具有重要意义。为此，本发明以青霉菌为原料发现两种新的杂萜化合物，其具有较强的抗肿瘤活性。
技术实现要素：
本发明通过充分利用深海微生物资源优势，获取一类新的杂萜化合物。
本发明中杂萜化合物的结构式如下；
本发明还提供一种杂萜化合物的制备方法，包括以下步骤：
s1、将青霉菌进行发酵培养，得到发酵产物；
s2、将发酵产物进行萃取，得到萃取液；萃取液经分离纯化后，得到杂萜化合物。
在本发明的其中一种具体实施方式中，步骤s1中将青霉菌在pda平板培养3天得到菌丝体，培养温度为25℃；再将菌丝体接种到1l的三角烧瓶中静态培养30天，培养温度为28℃，三角烧瓶中有80g大米和120ml水。
本发明杂萜化合物及其盐类中的至少一种用于抗肿瘤的药物的制备，制备的抗肿瘤药物对肿瘤细胞具有抑制作用。
具体的，抗肿瘤的药物用于治疗膀胱癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、肝癌和宫颈癌中的至少一种。
一种抗肿瘤的药物，包括有效剂量的杂萜化合物及其盐中的至少一种，以及药学上可以接受的载体。
相对于现有技术而言，本发明具有以下有益效果：
本发明杂萜化合物通过青霉菌在特定的培养基中发酵产生，具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物，本发明为研发抗肿瘤药物提供了新的化合物来源，利用丰富的海洋微生物作为发酵原料发酵制备杂萜化合物作为抗肿瘤活性物质，降低药物生产成本，对癌细胞有明显的抑制作用，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
青霉菌penicilliumallii-sativi保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为mccc3a00580。
杂萜化合物的制备
(1)将青霉菌在pda平板上于25℃培养3天。然后将新鲜的菌丝体接种到50个1l的三角烧瓶中在28℃下静态培养，每瓶中有80g大米和120ml蒸馏水，培养30天。
(2)将步骤(1)得到的发酵物用乙酸乙酯萃取三次。减压蒸发掉有机溶剂，得到有机萃取物(120g)。将这些萃取物使用甲醇和和石油醚进行萃取。浓缩甲醇层，得到脱脂提取物(60.4g)。
(3)将步骤(2)得到的脱脂提取物使用硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷-甲醇体系进行梯度洗脱，得到8个级分(fr.1～fr.8)。
(4)将步骤(3)得到的有生物活性的级分fr.3(5.5g)使用ods柱色谱进行分离，使用水-甲醇体系进行梯度洗脱，再在硅胶柱色谱上使用石油醚-丙酮(5：1)进行洗脱，得到化合物1(5.0mg)。
(5)将步骤(3)得到的另一生物活性级分fr.5(6.7g)过ods色谱柱和sephadexlh-20凝胶柱，使用甲醇洗脱。通过制备型hplc使用水-甲醇梯度(20％→80％)进行最终纯化，得到化合物2(3.5mg)。
(6)将上述步骤中得到的化合物1和2用1d和2dnmr图谱以及高分辨质谱分析进行结构鉴定：
化合物1为无色油状物。根据其在高分辨质谱中确定其分子式为c28h40o7，不饱和度为9。1h和13cnmr数据(表1)显示28个碳信号，包括八个甲基，一个甲氧基，四个亚甲基，四个次甲基(一个烯键)和11个季碳(两个酮，两个羧基，一个烯碳)。除去1个甲氧基[δh3.54(3h,s)；δc51.8q]和一个乙酰基[δh2.03(3h,s)；δc21.1q,170.0s]外，剩余的信号表明化合物1结构式还含有25个碳。由于两个酮基，两个羧基和一个烯键部分占了5个不饱和度，因此化合物1为四环骨架。
在cosy谱中，根据h-3/h-2/h-1，h-5/h-6/h-7和h-9/h-11/h-21的相关，得出三个片段。在hmbc谱中，根据me-18，me-20、me-22-me-25、h-3和h-3'的相关，将以上三个片段连接成一个四环骨架，且乙酰基和甲氧基在分别连在c-3和c-19上。由此确定了化合物1的平面结构。
表1化合物1和化合物2的1h(400mhz)和13c(100mhz)nmr数据
化合物1的相对构型主要由noesy谱确定。根据h-5与h-9/me-25/h-7a相关，h-9与16-oh相关，me-25经3-oac与h-2a相关，而h-2b与me-24相关，h-7b经me-22与me-23/3'-ome相关。因此，h-5/h-9/me-25/3-oac/16-oh处于同一平面，定为β构型，与me-23/h-3/me-24/me-22/me-18相反。
其绝对构型通过对比理论计算和实验测量的电子圆二色谱(ecd)谱图，发现(3s,5s,8s,9s,10r,13r,14r,16r)-1的计算图谱与实验谱图吻合。由此确定了化合物1的绝对构型，并将其命名为：雄甾酮a(andrastonea)。
化合物2为无色油状物，其分子式根据高分辨质谱确定为c28h36o9。1h和13cnmr数据(表1)与已知化合物citreohybriddionea非常相似。不同之处仅在于c-16，me-18分别往低场位移了4.7和5.7ppm，推测c-16的羟基在化合物2中应该是β构型，而非citreohybriddionea中的α构型。在noesy谱中，3'-me与me-18相关，从而确定2中c-16的羟基为β构型。通过对比其ecd的实验和计算值，最终确定化合物2的结构为ent-16β-hydroxycitreohybriddionea，命名为：雄甾酮b(andrastoneb)。
杂萜化合物的抗肿瘤活性考察
本实施例选择7株肿瘤细胞，包括hepg2(肝癌)、a549(肺癌)、biu-87(膀胱癌)、bel-7402(肝癌)、eca-109(食管癌)、hela-s3(宫颈癌)和panc-1(胰腺癌)。
通过检测化合物样品对这些肿瘤细胞的的抑制率，从而检测化合物1和2的抗肿瘤活性。
本实施例分为以下3组：
(1)细胞培养液中不加化合物的阴性对照组；
(2)不含细胞，但有等量培养液的空白对照组；
(3)青霉菌发酵化合物实验组：实施例1中所得青霉菌发酵化合物；
本具体实施方式采用如下操作：
(1)以每孔2000～5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl。
(2)37℃，5％co2的培养箱中培养24h，然后加入不同浓度的化合物继续培养。
(3)72h后，每孔加10μl3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide(mtt)，37℃避光反应3h。小心吸弃上清液后，每孔加入150μldmso，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。
(4)酶标仪测定570nm光吸收值，然后根据公式(i)计算抑制率。
公式(i)：
(5)ic50表示抑制率为50％时的化合物浓度。
化合物1和2的ic50数据如表2所示，化合物1和化合物2对hepg2、a549、biu-87、bel-7402、eca-109、hela-s3和panc-1有较强的抑制作用，表现出较强的抗肿瘤活性，化合物1对肝癌hepg2细胞的生长有显著的抑制作用。
表2化合物1和化合物2对不同肿瘤细胞的抑制作用(ic50，μm)
化合物1对应的盐类、化合物2对应的盐类同样具有抗肿瘤活性。
将有效剂量的化合物1、化合物1对应的盐类、化合物2和化合物2对应的盐类中的至少一种与药学上可以接受的载体混合制备具有抑制肿瘤细胞生长的药物。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。