一种提高马尔尼菲篮状菌基因敲除转化率的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种马尔尼菲篮状菌基因敲除新方法。

背景技术：

马尔尼菲篮状菌病流行于我国南方和东南亚地区，是其流行地区艾滋病患者最常合并的机会性感染之一，据报道广西19％艾滋病患者合并马尔尼菲篮状菌感染，死亡率高达80％，是导致当地艾滋病患者死亡的重要因素。近年来，由于免疫抑制剂的广泛使用，没有明显免疫缺陷的病人感染马尔尼菲篮状菌的频率越来越高。但是，国内外对马尔尼菲篮状菌的致病机理知之甚少。

基因敲除技术是研究马尔尼菲篮状菌感染机制、免疫逃逸机制和基因功能研究的基础，马尔尼菲篮状菌细胞壁坚固难以消化；且原生质体长时间暴露菌体外易损伤、在固体培养基中易破碎、难以成活等，导致该方法转化效率不高，如何在短时间内提高马尔尼菲篮状菌原生质体的制备效率以及促进基因转化后的成活成为关键的技术问题。国内现有的原生质体转化法基因敲除技术，使用的酶解液(包涵纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶)配制复杂且不易保存，破壁时间需要4-6小时，花费时间长，不易于原生质体再生。在基因转化后，现有转化方法直接将悬液在固体培养基上涂板，容易形态失衡破裂，导致复生率下降。

技术实现要素：

为了至少解决上述技术问题之一，提高马尔尼菲篮状菌原生质体的制备效率，促进基因转化后的成活，本发明旨在提供一种新的马尔尼菲篮状菌基因敲除方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种提高马尔尼菲篮状菌基因敲除转化率的方法，包括步骤：(1)马尔尼菲篮状菌菌体制备；(2)原生质体制备；(3)原生质体转化；(4)原生质体复生；

所述的步骤(2)，采用破壁酶lysingenzymesfromtrichodermaharzianum与马尔尼菲篮状菌菌体混合，对马尔尼菲篮状菌菌体的细胞壁进行溶解消化1.5-2h；

所述的步骤(4)，将转化后的原生质体用stc缓冲液重悬，加入含有1-1.5mol/l山梨醇的sdb培养液基，并于25-30℃摇床80-120rpm/min震荡培养1-2天恢复生长，之后将孢子悬液接种至anm-u固体培养基中，筛选阳性转化子，完成克隆筛选。

作为优选，所述的一种提高马尔尼菲篮状菌基因敲除转化率的方法，具体包括以下步骤：

(1)马尔尼菲篮状菌菌体制备：取马尔尼菲篮状菌孢子液转移至蔗糖sd+u再生培养基中，37℃摇床200rpm/min震荡40小时；收集菌体，用浓度为0.6mol/l的mgso4溶液洗涤，重悬菌液2次。

(2)原生质体制备：取破壁酶lysingenzymesfromtrichodermaharzianum至烧瓶，用osmo缓冲液溶解，将收集到的马尔尼菲篮状菌菌体转移至烧瓶中与破壁酶混合，在30℃、200rpm/min的条件下消化1.5-2h；收集原生质体，加入stc，吹打均匀，在4℃、4500rpm/min条件下离心收集10min，洗涤两次；底部沉淀用stc溶解，按照每100ul原生质体加入25ul的量加入40％ptc，并吹打均匀，得原生质体混合液。

(3)原生质体转化：取原生质体混合液加入到含dna的离心管中，拍打均匀，冰浴20-30min；将混合液取出加入40％ptc，拍打均匀，置室温20-30min；加stc缓冲液，颠倒混匀，在4℃、6000rpm/min条件下离心5min。

(4)原生质体复生：将转化后的原生质体用stc缓冲液重悬，加入含有1.2mol/l山梨醇的sdb培养液基，并于28℃摇床100rpm/min震荡培养1天恢复生长，之后将孢子悬液接种至anm-u固体培养基中，筛选阳性转化子，完成克隆筛选。

此外，本发明还要求保护上述方法在马尔尼菲篮状菌原生质体基因转化上的应用。

本发明具备以下有益效果：

(1)本发明采用一种新的破壁酶lysingenzymesfromtrichodermaharzianum(sigma.america)，该酶具有强大的溶解细胞壁的功能，配制方便，可以在1.5-2h溶解细胞壁，大量释放原生质体，完成制备过程，减少原生质体菌丝体外的损伤，提供优质原生质体，为转化提供保障。

(2)本发明在基因转化后利用高渗透压的液体培养基(含有1.2mol/l山梨醇的sdb培养液基)扶持原生质体保持形态，并于28℃摇床100rpm/min震荡培养1天恢复生长，将孢子悬液接种至anm-u固体培养基中，完成克隆筛选，从而提高该方法的转化效率。

基因敲除技术是研究基因功能的基础，但国内现有的基因敲除技术具有原生质体制备率低，成活难，转化效率低的技术难题。本发明能够切实可行地解决以上技术难题，为研究马尔尼菲篮状菌感染机制、免疫逃逸机制和基因功能提供技术支持，具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1是消化酶消化1h后形成的原生质体显微镜镜像图。

图2是消化酶消化2h后形成的原生质体显微镜镜像图。

图3是消化酶消化4h后形成的原生质体显微镜镜像图。

图4是原生质体复生后涂于蔗糖sd+u再生培养基培养得到的菌落生长形态图，可见大量菌落生长。

图5是基因转化后原生质体经过复生，涂于蔗糖sd-u再生培养基培养得到的阳性转化株生长形态图，可见大量阳性转化株。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明。

本发明所述的一种提高马尔尼菲篮状菌基因敲除转化率的方法，按照以下步骤进行：

1、马尔尼菲篮状菌菌体制备：取马尔尼菲篮状菌孢子液1ml转移至400mlsd+u再生培养基中，37℃摇床200rpm/min震荡40小时。收集菌体，用0.6mol/lmgso4洗涤，重悬菌液2次。

2、原生质体制备：取100-120mg破壁酶lysingenzymesfromtrichodermaharzianum至100ml烧瓶，用2-3mlosmo缓冲液溶解，将步骤1中菌体转移至烧瓶中，与破壁酶混合，30℃,200rpm/min,消化1.5-2h。在消化作用下，马尔尼菲篮状菌可释放大量优质原生质体，如图1、图2和图3所示。收集原生质体，加入10-15mlstc，缓慢吹打均匀，4℃,4500rpm/min，离心收集10min，洗涤两次。底部沉淀用200-400ulstc溶解，按照每100ul原生质体加入25ul的量加入40％ptc，并温和吹打均匀。

3、转化：取100ul原生质体混合液加入到含dna(2ug)的离心管中，轻轻拍打均匀，冰浴20-30min。将混合液取出加入100ul40％ptc，轻轻拍打均匀，置室温20-30min。加入1mlstc缓冲液，轻轻颠倒混匀，4℃,6000rpm/min，离心5min。

4、复生：用stc重悬后，将转化的原生质体加入含有1.2mol/l山梨醇的sdb，并于28℃摇床100rpm/min震荡培养1天恢复生长，之后将孢子悬液接种至anm-u固体培养基中，筛选阳性转化子，完成克隆筛选。

如图4所示，将复生后的原生质体涂于蔗糖sd+u再生培养基培养，可见大量菌落生长。如图5所示，基因转化后的原生质体经过复生，涂于蔗糖sd-u再生培养基培养，可见大量阳性转化株。