虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，特别涉及虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：对虾偷死病(cmd)是由“偷死野田村病毒(cmnv)”引起的一种病毒性疾病。偷死野田村病毒属于野田村病毒科α野田村病毒属，是一种单链rna病毒，病毒粒子为球形(二十面体)，无囊膜，直径32纳米。对虾偷死病是近年来我国养殖对虾中出险的一种新发病害。2003年或更早的时候，该病在海南、广西等地高密度养殖的凡纳滨对虾中出现，2008-2009年我国南方各省市的养殖对虾中大规模爆发，2010年后开始传播到我国山东、河北和天津等地。分子流行病学调查显示，凡纳滨对虾、中国对虾、日本对虾、斑节对虾、脊尾白虾、罗氏沼虾和梭子蟹中均能检出cmnv阳性，这说明cmnv不仅能够感染目前我国养殖对虾的主要经济种类，还能感染其他甲壳类动物，由此可见cmnv宿主范围可能非常广泛。目前对cmnv引起的对虾病害尚无有效的治疗方法，只能以预防为主；而这又主要依赖于早期快速的诊断和筛查。近年来基于临床组织病理学、免疫学以及pcr技术等的各种诊断方法已被用于cmnv的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而pcr方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般pcr技术相比，荧光pcr检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。虹彩病毒病是一种广泛存在于水生动物且危害较大的病毒性疾病。目前，虹彩病毒成为一些鱼类、两栖类动物的新型病原体，特别是水产养殖业中的经济类品种再加上其特殊的生物学特性，因此越发引起人们的关注和重视。对虾感染虹彩病毒，最早于1993年lightner和redman在靠近厄瓜多尔对虾养殖场发现了被虹彩病毒感染的原糙对虾(protrachypeneprecipuaburkenroad)。这是首次报道十足目动物能够感染虹彩病毒。对感染虹彩病毒的原糙对虾组织病理学观察发现，表皮上皮细胞(鳃、胃内层甚至遍布全身)呈现典型的虹彩病毒的感染；造血组织，触角腺上皮组织，以及心脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰腺中的结缔组织细胞和吞噬细胞也被虹彩病毒感染。2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾上发现一种新病毒，相关研究报道称新分离的病毒属于虹彩病毒科，但不属于虹彩病毒科下已建立的五个属，感染该病毒的虾造血组织、鳃丝、肝胰腺、附肢和肌肉的血细胞中出现嗜碱性包涵体和核固缩现象，因此命名为虾血细胞虹彩病毒(shiv)。该病毒与2014年国家海洋局第三海洋研究所的科研人员从红螯螯虾中分离的红螯螯虾虹彩病毒(cqiv)的基因序列一致，属于同一种病毒的不同分离株。虾诺达病毒是一种无囊膜的rna病毒，呈二十面体状，直径约为22nm，其基因组由两条单链rna组成；该病毒能引起虾的肌肉坏死，对虾感染该病毒后的症状与感染了传染性肌肉坏死病毒(infectiousmyonecrosisvirus，imnv)后的症状非常相似，主要表现为为病虾尾部出现白色、不透明的病理损伤，组织病理学表现为骨骼肌肌肉呈多病灶坏死、血细胞纤维化，此外横纹肌、淋巴器官及结缔组织中可见嗜碱性的胞浆包涵体；该病毒的感染可引起对虾50％以上的死亡率。所以研究并建立pvnv的快速检测预警技术，加强虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，有效切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。综上所述，建立一种对虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提出一种虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒及其应用，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：一种虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒，包括分别针对虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的荧光pcr检测用正、反向引物，其中，虾偷死野田村病毒正、反向引物序列如seqidno:1～2所示，虾血细胞虹彩病毒正、反向引物序列如seqidno:4～5所示，虾诺达病毒正、反向引物序列如seqidno:7～8所示。所述三重荧光pcr检测试剂盒还包括有分别针对虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的荧光pcr检测用的探针，其中，虾偷死野田村病毒的探针序列如seqidno:3所示，虾血细胞虹彩病毒的探针序列如seqidno:6所示，虾诺达病毒的探针序列如seqidno:9所示，且检测各病毒的探针序列在5'端标记有荧光报告基团，在3'端标记有荧光淬灭基团。进一步地，虾偷死野田村病毒的探针序列中荧光报告基团为fam荧光基团，荧光淬灭基团为bhq1；虾血细胞虹彩病毒的探针序列中荧光报告基团为vic荧光基团，荧光淬灭基团为bhq1；虾诺达病毒的探针序列中荧光报告基团为rox荧光基团，荧光淬灭基团为bhq2，此外，其他不影响结果判断的荧光报告基团和荧光猝灭基团亦可。进一步地，所述三重荧光pcr检测试剂盒还包括有rt-pcr检测试剂、酶混合液、阴性对照品、阳性对照品中的至少一种。进一步地，所述rt-pcr检测试剂含有一步法rt-pcr缓冲液和h2o。进一步地，所述酶混合液至少包括逆转录酶和taqdna聚合酶。其有多种商品化酶或酶制品可供选择，如primescripttmiihighfidelityonesteprt-pcrkit(takara,r026a)。进一步地，所述阳性对照品为虾偷死野田村病毒对照质粒，和/或虾血细胞虹彩病毒对照质粒，和/或虾诺达病毒对照质粒；所述虾偷死野田村病毒对照质粒为含有seqidno:10序列所示目标片段的质粒，所述虾血细胞虹彩病毒对照质粒为含有seqidno:11序列所示目标片段的质粒,所述虾诺达病毒对照质粒为含有seqidno:12序列所示目标片段的质粒。进一步地，所述阴性对照品为灭菌去离子水或depc水或灭菌te液等等不含相关病毒的核酸溶液。本发明的虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒的引物和探针序列如下：seqidno:1：5'-caaaatgccgccgataaagatg-3'。seqidno:2：5'-tttaccgtctcgggatgaatt-3'。seqidno:3：5'-荧光报告基团-atgttcaacgtcctttgtgcccgca-荧光淬灭基团-3'。seqidno:4：5'-aaattacacatgatttgcaacaagct-3'。seqidno:5：5'-actttcgaatggaataaccctgatt-3'。seqidno:6：5'-荧光报告基团-caatcaaggatgccgatcaagcaacg-荧光淬灭基团-3'。seqidno:7：5'-aaagtatgcccgtcacgagt-3'。seqidno:8：5'-taacgttgggacgagaataggaa-3'。seqidno:9：5'-荧光报告基团-tggcgctcctttgcaagctctcac-荧光淬灭基团-3'。本发明的虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒的目的检测序列如下：对虾偷死野田村病毒：5'-caaaatgccgccgataaagatgctatgttcaacgtcctttgtgcccgcactcaaattcatcccgagacggtaaa-3'(seqidno:10)。虾血细胞虹彩病毒：5'-aaattacacatgatttgcaacaagcttccagcaatcaaggatgccgatcaagcaacgtggaatcgaatcagggttattccattcgaaagt-3'(seqidno:11)。虾诺达病毒：5'-aaagtatgcccgtcacgagtaatggcgctcctttgcaagctctcacttcctattctcgtcccaacgtta-3'(seqidno:12)。使用本发明的虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒的应用方法如下：1)提取待测样本的核酸，得到核酸模板溶液；2)加样，制备反应体系；3)rt-pcr检测。试剂盒检测时，上述三种病毒的引物和探针是混合在一起使用。检测的对象是病毒核酸，当取得某一样品核酸时，加入混合的三种病毒的引物和探针，因为三种病毒在阳性时都会发出荧光，偷死病毒探针用fam：虹彩病毒探针用vic：诺达病毒探针用rox。三种探针的波长不同，产生不同的检测通道信号，即可判定是何种病毒。本发明rt-pcr检测的待测样本来自待检样本组织。样本的核酸提取技术为现有病毒dna/rna提取技术，具体可根据取样方式不同，按各核酸提取说明书操作进行。加样的方法为：取一步法rt-pcr反应液12.5μl；虾偷死野田村病毒上游引物(10μm)0.5μl，虾偷死野田村病毒下游引物(10μm)0.5μl，虾偷死野田村病毒探针(10μm)0.5μl；血细胞虹彩病毒上游引物(10μm)0.5μl，血细胞虹彩病毒下游引物(10μm)0.5μl，血细胞虹彩病毒探针(10μm)0.5μl；诺达病毒上游引物(10μm)0.5μl，诺达病毒下游引物(10μm)0.5μl，诺达病毒探针(10μm)0.5μl；灭菌去离子水2μl。把上述溶液涡旋震荡混匀10秒，3000rpm瞬时离心2秒。制备得到荧光pcr检测混合液。取19μl荧光pcr检测混合液与1μl逆转录酶和taqdna聚合酶的混合液(即pcr酶)，振荡混匀10秒，3000rpm瞬时离心2秒，获得混合液，取混合液20μl置于pcr管中，然后将5μl的dna/rna模板溶液、阳性对照品、或者阴性对照品加入pcr反应管中，盖好pcr反应管盖，立即进行pcr扩增反应。本发明推荐循环参数设置为：50℃30min；95℃2min；95℃×15sec和60℃×45sec，交替循环40次，单点荧光检测在60℃，反应体系为25μl。pcr反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线。本发明针对虾偷死野田村病毒、虾血细胞虹彩病毒、虾诺达病毒三重荧光pcr检测的试剂盒采用的是taqman荧光定量pcr原理，分别针对虾偷死野田村病毒对照质粒、虾血细胞虹彩病毒对照质粒、虾诺达病毒基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计taqman探针，并标记荧光报告基团，位于上、下游引物之间。探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记非荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'→3'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量pcr技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。附图说明图1为本发明实施例3中扩增片段的电泳图；图2为本发明实施例4中荧光pcr检测结果图。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。实施例1一种虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒，包括分别针对虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的荧光pcr检测用正、反向引物以及探针，其中，虾偷死野田村病毒正、反向引物序列如seqidno:1～2所示，虾偷死野田村病毒的探针序列如seqidno:3所示，虾血细胞虹彩病毒正、反向引物序列如seqidno:4～5所示，虾血细胞虹彩病毒的探针序列如seqidno:6所示，虾诺达病毒正、反向引物序列如seqidno:7～8所示，虾诺达病毒的探针序列如seqidno:9所示，且检测各病毒的探针序列在5'端标记有荧光报告基团，在3'端标记有荧光淬灭基团。虾偷死野田村病毒的探针序列中荧光报告基团为fam荧光基团，荧光淬灭基团为bhq1；虾血细胞虹彩病毒的探针序列中荧光报告基团为vic荧光基团，荧光淬灭基团为bhq1；虾诺达病毒的探针序列中荧光报告基团为rox荧光基团，荧光淬灭基团为bhq2，此外，其他不影响结果判断的荧光报告基团和荧光猝灭基团亦可。本实施例中，三重荧光pcr检测试剂盒还包括有rt-pcr检测试剂、酶混合液、阴性对照品、阳性对照品中的至少一种，其中的rt-pcr检测试剂包括有一步法rt-pcr缓冲液和h2o；酶混合液至少包括逆转录酶和taqdna聚合酶。其有多种商品化酶或酶制品可供选择，如primescripttmiihighfidelityonesteprt-pcrkit(takara,r026a)；所述阳性对照品为虾偷死野田村病毒对照质粒，和/或虾血细胞虹彩病毒对照质粒，和/或虾诺达病毒对照质粒；所述虾偷死野田村病毒对照质粒为含有seqidno:10序列所示目标片段的质粒，所述虾血细胞虹彩病毒对照质粒为含有seqidno:11序列所示目标片段的质粒,所述虾诺达病毒对照质粒为含有seqidno:12序列所示目标片段的质粒；所述阴性对照品为灭菌去离子水或depc水或灭菌te液等等不含相关病毒的核酸溶液。虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒的引物和探针序列如下：seqidno:1：5'-caaaatgccgccgataaagatg-3'。seqidno:2：5'-tttaccgtctcgggatgaatt-3'。seqidno:3：5'-荧光报告基团-atgttcaacgtcctttgtgcccgca-荧光淬灭基团-3'。seqidno:4：5'-aaattacacatgatttgcaacaagct-3'。seqidno:5：5'-actttcgaatggaataaccctgatt-3'。seqidno:6：5'-荧光报告基团-caatcaaggatgccgatcaagcaacg-荧光淬灭基团-3'。seqidno:7：5'-aaagtatgcccgtcacgagt-3'。seqidno:8：5'-taacgttgggacgagaataggaa-3'。seqidno:9：5'-荧光报告基团-tggcgctcctttgcaagctctcac-荧光淬灭基团-3'。虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒的目的检测序列如下：对虾偷死野田村病毒：5'-caaaatgccgccgataaagatgctatgttcaacgtcctttgtgcccgcactcaaattcatcccgagacggtaaa-3'(seqidno:10)。虾血细胞虹彩病毒：5'-aaattacacatgatttgcaacaagcttccagcaatcaaggatgccgatcaagcaacgtggaatcgaatcagggttattccattcgaaagt-3'(seqidno:11)。虾诺达病毒：5'-aaagtatgcccgtcacgagtaatggcgctcctttgcaagctctcacttcctattctcgtcccaacgtta-3'(seqidno:12)。实施例2病毒核酸提取采集疑似阳性虾苗用95％乙醇保存，运输、保存待检。将疑似阳性虾苗用rnase-free研磨器研磨匀浆，然后10,000rpm(～11,200×g)离心1分钟。取上清备用。用天根生物的“病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp35)”试剂盒提取上述步骤制备的组织匀浆液上清。按照试剂盒说明书操作。每个样本取200μl匀浆上清液用于核酸提取，最后提取到50μl核酸溶液。实施例3阳性对照品制备按实施例2方法提取阳性样本核酸。分别按下述比例配制扩增反应液：onesteprt-pcr反应液12.5μl虾偷死野田村病毒上游引物(10μm)0.5μl虾偷死野田村病毒下游引物(10μm)0.5μl灭菌去离子水5.5μlpcr酶1μl虾偷死野田村病毒核酸溶液5μlonesteprt-pcr反应液12.5μl血细胞虹彩病毒上游引物(10μm)0.5μl血细胞虹彩病毒下游引物(10μm)0.5μl灭菌去离子水5.5μlpcr酶1μl血细胞虹彩病毒核酸溶液5μlonesteprt-pcr反应液12.5μl诺达病毒上游引物(10μm)0.5μl诺达病毒下游引物(10μm)0.5μl灭菌去离子水5.5μlpcr酶1μl诺达病毒核酸溶液5μlpcr扩增程序取pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，于凝胶成像仪中观察结果，结果如图1所示，其中，泳道1为偷死野田村病毒扩增产物，泳道2为诺达病毒扩增产物，泳道3为血细胞虹彩病毒扩增产物，m为20bp梯度dnamarker，具体为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、300、400、500。pcr扩增产物回收凝胶电泳后，对目的片段进行胶回收，回收片段大小约为：对虾偷死野田村病毒片段75bp；血细胞虹彩病毒片段91bp；诺达病毒片段70bp。在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，用吸水纸吸尽凝胶表面的液体，称取凝胶的重量，该重量近似等于凝胶的体积，然后置于一洁净的1.5ml的离心管中，切碎。用天根生物的“普通dna产物纯化试剂盒(dp204)”试剂盒回收产物，按照试剂盒说明书操作。连接将上述回收产物连接到pmd-18t载体上，在pcr管中建立一个20μl体系：pmd-18t载体1μl，胶回收产物9μl，solutionⅰ10μl，充分混合均匀，16℃连接过夜。转化将50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞与5μl连接产物混合均匀(冰上操作)，冰上静置30min，然后迅速放入42℃水浴锅中热刺激90s，迅速重放回冰上静置2min，然后在超净工作台中加入800μl含有amp+的lb液体培养基，于37℃、200r/min摇床上复苏60min。复苏完毕，转移到离心管中，5000r/min。离心10min，使细菌扩大培养，然后用移液器吸取200μl均匀地涂布于琼脂糖平板上，之后37℃温箱中培养过夜(14～16h)。挑菌待琼脂糖平板上长出单个的、针尖大小的白色菌落时，即可挑菌。用无菌枪头分别挑取2～3个单菌落置于含有amp+的lb液体培养基中进行克隆。然后将其置于37℃、180r/min摇床上震荡培养16h。重组质粒提取用天根生物的“质粒小提试剂盒(dp103)”提取质粒，按照试剂盒说明书操作。将提取的质粒分别稀释至合适浓度用作阳性对照。实施例4样本检测将待检测样本按照实施例2的方法提取样本核酸，备用。配制反应液。按下述比例配制扩增反应液：onesteprt-pcr反应液12.5μl虾偷死野田村病毒上游引物(10μm)0.5μl虾偷死野田村病毒下游引物(10μm)0.5μl虾偷死野田村病毒探针(10μm)0.5μl血细胞虹彩病毒上游引物(10μm)0.5μl血细胞虹彩病毒下游引物(10μm)0.5μl血细胞虹彩病毒探针(10μm)0.5μl诺达病毒上游引物(10μm)0.5μl诺达病毒下游引物(10μm)0.5μl诺达病毒探针(10μm)0.5μl灭菌去离子水1μlpcr酶2μl样本核酸溶液5μlpcr扩增程序为：50℃30min；95℃2min；95℃×15sec和60℃×45sec，交替循环40次，荧光检测在60℃。检测通道分别设置为fam，vic，rox，检测结果如图2所示。参比荧光设置为none(在有需要的荧光pcr仪上(如abi系列的荧光pcr仪)需要设置参比荧光参数)。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>湛江出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>虾偷死野田村病毒、血细胞虹彩病毒、诺达病毒的三重荧光pcr检测试剂盒及其应用<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caaaatgccgccgataaagatg22<210>2<211>21<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tttaccgtctcgggatgaatt21<210>3<211>25<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atgttcaacgtcctttgtgcccgca25<210>4<211>26<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaattacacatgatttgcaacaagct26<210>5<211>25<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5actttcgaatggaataaccctgatt25<210>6<211>26<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6caatcaaggatgccgatcaagcaacg26<210>7<211>20<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aaagtatgcccgtcacgagt20<210>8<211>23<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8taacgttgggacgagaataggaa23<210>9<211>24<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tggcgctcctttgcaagctctcac24<210>10<211>74<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caaaatgccgccgataaagatgctatgttcaacgtcctttgtgcccgcactcaaattcat60cccgagacggtaaa74<210>11<211>90<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aaattacacatgatttgcaacaagcttccagcaatcaaggatgccgatcaagcaacgtgg60aatcgaatcagggttattccattcgaaagt90<210>12<211>69<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aaagtatgcccgtcacgagtaatggcgctcctttgcaagctctcacttcctattctcgtc60ccaacgtta69当前第1页12