含有虾红素的提取物的组成物及其用图
【专利摘要】本发明涉及一种含有虾红素的提取物的组成物及其用途。首次揭示了一种可以大幅度改善女性不孕的天然组成物，所述组成物以含有虾红素的提取物作为主要的活性成分。所述的提取物为天然成份，因此可以较安全地改善不孕症状，具有极好的药用前景。
【专利说明】
含有虾红素的提取物的组成物及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及药物学领域，更具体地，本发明涉及含有虾红素的提取物的组成物及 其用途。
【背景技术】
[0002] 女性不孕主要由性激素分泌异常，染色体异常，排卵障碍，慢性炎症，精神压力等 生理或心理原因引起。为了治疗女性的不孕，本领域进行了大量的研究。虽然辅助生殖医 疗技术已发展到一定的高度，但即使是这些技术也存在较多难以治疗的病例。
[0003] 为了提高女性身体怀孕的可能性，本发明人找到了天然的组成物。作为代表例，其 中有维生素 C，维生素 E等，虽然都在研究这类物质对女性不孕的改善的有效性，但至今为 止还没有从这类物质中找到可以大幅度（显著性）改善女性不孕的有效物质。
[0004] 因此，本领域有必要进一步地研究针对女性不孕不育真正有效的物质，特别是毒 副作用低的天然物质。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种含有虾红素的提取物的组成物及其用途。
[0006] 在本发明的第一方面，提供含有虾红素的提取物在制备治疗或改善女性不孕的组 成物中的用途。
[0007] 在一个优选例中，所述的组成物还用于：
[0008] 提高卵泡对促性腺激素的反应性；
[0009] 促进女性排卵（临床表现为：统计学上提高从女性体内的平均获卵数）；
[0010] 提高卵子质量（临床表现为：统计学上提高正常受精卵子数、统计学上增加平均 可移值胚胎数以及平均优质胚胎数）；或
[0011] 提尚胚胎的着床率和/或提尚临床妊娠率。
[0012] 在另一优选例中，所述的含有虾红素的提取物是雨生红球藻提取物。
[0013] 在另一优选例中，所述的组成物中还包括维生素 E、维生素 C和糊精。
[0014] 在另一优选例中，所述的组成物中包括：
[0015] 虾红素： 3-20重量份；较佳地为4-15重量份；
[0016] 维生素 E : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0017] 维生素 C : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0018] 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。
[0019] 在另一优选例中，当所述的含有虾红素的提取物是雨生红球藻提取物时，所述的 虾红素存在于雨生红球藻提取物中，所述的组成物中包括：
[0020] 雨生红球藻提取物：167-1112重量份；较佳地为222-834重量份；
[0021] 维生素 E : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0022] 维生素 C : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0023] 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。
[0024] 在另一优选例中，所述的组成物中还包括调味剂；较佳地所述调味剂包括（但不 限于）：可可粉，香蕉粉，玉米粉；更佳地，组成物中包含可可粉500-2500重量份（更佳地为 800-1800 重量份）。
[0025] 在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或改善女性不孕的组成物，所述的组成 物中包括：
[0026] 虾红素： 3-20重量份；较佳地为4-15重量份；
[0027] 维生素 E : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0028] 维生素 C : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0029] 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。
[0030] 在一个优选例中，当所述的含有虾红素的提取物是雨生红球藻提取物时，所述的 虾红素存在于雨生红球藻提取物中，所述的组成物中包括：
[0031] 雨生红球藻提取物：167-1112重量份；较佳地为222-834重量份；
[0032] 维生素 E : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0033] 维生素 C : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0034] 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。
[0035] 在另一优选例中，所述的组成物中还包括调味剂，较佳地所述调味剂包括（但不 限于）：可可粉，香蕉粉，玉米粉；较佳地，组成物中包含可可粉500-2500重量份（更佳地为 800-1800 重量份）。
[0036] 在本发明的另一方面，提供一种制备用于治疗或改善女性不孕的组成物的方法， 所述的方法包括，将虾红素或含有虾红素的提取物、维生素 E、维生素 C以及糊精混合，各成 分的用量为：
[0037] 虾红素： 3-20重量份；较佳地为4-15重量份；
[0038] 维生素 E : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0039] 维生素 C : 5-20重量份；较佳地为6-15重量份；
[0040] 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。
[0041] 在一个优选例中，提取物、维生素 E、维生素 C以及糊精还与可可粉混合，可可粉为 500-2500重量份（更佳地为800-1800重量份）。
[0042] 在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或改善女性不孕的药盒，所述的药盒中 包括：
[0043] 容器，以及装于该容器中的所述的组成物。
[0044] 在另一优选例中，所述的药盒中还有使用说明书，其中记载了所述的组成物的服 用量，有效成分含量等。
[0045] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0046] 图1、患者1-8在摄取含有虾红素的提取物组成物之前（Pre)和之后（Post)的获 卵数（纵坐标：个）比较。数值以平均值土标准误差（SEM)计算。
[0047] 图2、患者在摄取含有虾红素的提取物组成物之前（Pre)和之后（Post)的受精卵 数（纵坐标：个）。数值以平均值土标准误差（SEM)计算。
[0048] 图3、在服用本发明的组成物的之前（Pre)和之后（Post)，患者的可移植胚胎数 (纵坐标：个）。数值以平均值土标准误差（SEM)计算。
[0049] 图4、服用本发明的组成物之前（Pre)和之后（Post)患者的高质量胚胎的数量。 数值以平均值土标准误差（SEM)计算。
【具体实施方式】
[0050] 本发明人经过深入的研究，首次揭示了虾红素是一种可大幅度改善女性不孕的物 质，将含有虾红素的提取物作为主要的活性成分，可在临床上显著地促进妊娠成功率。
[0051] 含有虾红素的提取物及其应用
[0052] 虾红素（Astaxanthin，又称虾青素）是类胡萝卜素的一种，是生物界中分布广泛 的一种叶黄素颜色素，存在于水产动物的虾、蟹、鱼和绿藻及一种酵母中，暗红色。
[0053] 虾红素的化学名称为3, 3' -二羟基-4, 4' -二酮基-β，β ' -胡萝卜素。
[0054] 虾红素是一种非维生素 Α原的类胡萝卜素。它具有独特的着色功能和很多重要生 理功能（抗氧化、防癌变、抵御紫外线伤害等），在饲料、食品、化妆品，等领域中有应用。虾 红素与维生素一样，动物不能自行合成，必需从食物中摄取，绿藻中的单细胞藻-雨生红球 藻所含的虾红素很高，高出甲壳类动物数10倍。
[0055] 本发明中，所述的含有虾红素的提取物的来源可以多种途径的，例如可以是通过 商购购买获得的，也可以是分离提取自雨生红藻、甲壳类动物等。
[0056] 目前，含有虾红素的提取物已经可以商业购买，其提取方法也是本领域已知的，例 如日本专利申请特开2010-43032中提供了从雨生红球藻中获得含有虾红素的提取物的方 法。此外，所述的雨生红球藻提取物也可通过化学合成的方式获得。
[0057] 可将含有虾红素的提取物直接给药；或者可将含有虾红素的提取物进行提纯和加 工，制成纯净形式的虾红素或各种形式的以虾红素为活性成分的制剂后，用于给药。
[0058] 本发明中，首次提出将含有虾红素的提取物应用于改善女性的不孕，其可以作为 药品、食品或保健品来大幅度改善女性不孕。较佳地，在含有虾红素的提取物的组成物中还 含有维生素 C维生素 E等的抗氧化物质。
[0059] 含有虾红素的提取物的组成物
[0060] 如本文所用，术语"本发明的组成物"包括药物组成物、饮食补充剂、保健品组成 物，只要它们含有有效量的含有虾红素的提取物作为治疗或改善女性不孕的主要活性成 分。
[0061] 如本文所用，属于"组成物"可与"组合物"互换使用。
[0062] 本发明中，"药学上或食品学上可接受的"成分是适用于人和/或动物而无过度不 良副反应（如毒性、刺激和变态反应）即有合理的效益/风险比的物质。
[0063] 本发明中，"药学上或食品学上可接受的载体"是用于将本发明的含有虾红素的提 取物传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体 或固体。
[0064] 本发明中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组成物中。 因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"中。
[0065] 虾红素是通过十二指肠来吸收消化的，本发明人在研究中发现，糊精能够帮助虾 红素在十二指肠的吸收。因此，作为本发明的优选方式，本发明所述的组成物中，不仅含有 对女性不孕有有效作用的含有虾红素的提取物，还含有可以调节虾红素吸收率的纤维成分 糊精，其有助于提高虾红素的体内吸收量，从而促进本发明的组成物的治疗或改善不孕的 效果。
[0066] 本发明人发现，虾红素虽然自身有着抗氧化作用，但其本身也容易氧化。因此，作 为本发明的优选方式，所述的组成物中还包括：维生素 E和维生素 C，该两种维生素的加入， 有助于阻止虾红素的自身氧化，从而有效保持虾红素的功效。
[0067] 另外，因为虾红素自身有着独特的味道，食用味道不是很理想，因此，在组成物中 加入调味剂是改善组成物口味的有效手段，所述的调味剂可以是本领域熟知的各种调味 剂，例如香蕉粉、草莓粉、可可粉、玉米粉、巧克力粉等等。本发明人在研究中发现，可可粉混 合于含有虾红素的提取物的组成物中，可以极其有效地掩盖虾红素的不良味道，从而避免 影响使用者的食欲。因此，作为本发明的优选方式，所述的组成物中还包括可可粉或可可颗 粒。另外，也可以采取添加其它带有水果味或可可味的方式进行掩味。
[0068] 本发明还提供了一种组成物，含有有效量的虾红素，或含有虾红素的提取物。
[0069] 作为本发明的优选方式，用于配制本发明的组成物的各组分的用量如表6所示。
[0070] 表 6
[0071]
[0072] 作为本发明的优选方式，当所述的含有虾红素的提取物是雨生红球藻提取物时， 所述的虾红素存在于雨生红球藻提取物中，所述的组成物中的各组分的用量如表7所示。
[0073] 表 7
[0074]
[0075] 在得知本发明的含有虾红素的提取物的组成物的组分及其配方以后，本领域技术 人员可方便地进行配制。
[0076] 从易于制备和给药的立场看，优选的药物组成物是固态组成物，尤其是片剂和固 体填充或液体填充的胶囊。为了能让对象容易摄取，上述的组成物可以做成颗粒或者粉剂。
[0077] 本发明所述的药物组成物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效 地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、 悬浮液、或气雾剂。其中含有虾红素的提取物可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释 液中。
[0078] 根据体重和对于虾红素的吸收率，受试对象的1天的摄取量也不同（每天6mg~ 12mg)，通常1天摄取6mg就能达到足够的效果。
[0079] 含有虾红素的提取物还可与其它活性成分或药物联合给药。当两种或两种以上的 药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。
[0080] 本发明的主要优点在于：
[0081] (1)首次揭示含有虾红素的提取物作为主要活性成分的组成物可以大幅度改善女 性不孕的各种问题。
[0082] (2)含有虾红素的提取物为天然成份，所以可以较为安全地改善不孕症状，具有极 好的药用前景。并且，本发明的含有虾红素的提取物对于肥胖，免疫力相关，也进行过很多 的临床试验，至今为止没有因虾红素引起并发症的报告。
[0083] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0084] 材料和试验方法
[0085] 主要活性物质：以下实施例中，所用的含有虾红素的提取物为雨生红球藻提取物。 该雨生红球藻提取物提取自雨生红球藻，提取方法参见日本专利申请特开2010-43032,制 备成含有恒定虾红素含量的提取物，即每克（g)该雨生红球藻提取物中虾红素含量为18毫 克（mg)。
[0086] 实施例1、配方1药物的制备和服用
[0087] 药物：含有虾红素的提取物（雨生红球藻提取物）的组成物1，配方如表1。表1 配方制成药包，每包2500mg。
[0088] 表 1
[0089]
[0090] 表中，含有雨生红球藻提取物333. 5mg，相当于含有6mg虾红素。
[0091] 实施对象：选择13例反复体外受精-胚胎移植（IVF-ET)失败的患者，共进行了 41 周期IVF-ET助孕，均未获妊娠。其中长方案促排卵11个周期，微刺激促排卵30周期。13 例患者中原发不孕5例，继发不孕8例；年龄27~40岁，平均（31. 5±3. 9)岁。平均不孕 年限4. 5年。不孕原因：输卵管因素3例，卵巢功能减退7例，多囊卵巢综合症2例，子宫内 膜异位症1例，不明原因2例。各患者情况如下：
[0092] 患者 1
[0093] 患者年龄：29岁。
[0094] 患者病情：原因不明的不孕，不孕时间5年。
[0095] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过1次长 方案促排卵、4次微刺激促排卵IVF-ET，进行1次冻融胚胎移植治疗，未获妊娠。
[0096] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行2次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0097] 患者 2
[0098] 患者年龄：30岁。
[0099] 患者病情：因为输卵管（右侧输卵管梗阻，左侧输卵畸形）问题引起的不孕。
[0100] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过1次长 方案促排卵、1次微刺激促排卵IVF-ET，进行2次冻融胚胎移植治疗，未获妊娠。
[0101] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行1次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0102] 患者 3
[0103] 患者年龄：40岁。
[0104] 患者病情：因尚龄问题引起不孕。
[0105] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过4次微 刺激促排卵IVF-ET，进行1次冻融胚胎移植治疗，未获妊娠。
[0106] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行2次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0107] 患者 4
[0108] 患者年龄：31岁。
[0109] 患者病情：右侧输卵管宫外孕术后伞端梗阻伴积水，左侧输卵管间质部梗阻，卵巢 功能减退。基础内分泌检查FSH11. 64, B超检查提示左侧卵巢窦卵泡储备3枚，右侧窦卵泡 储备2枚。
[0110] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过3次微 刺激促排卵IVF-ET，进行1次冻融胚胎移植治疗，未获妊娠。
[0111] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行1次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0112] 患者 5
[0113] 患者年龄：32岁。
[0114] 患者病情：因为男方少弱精子症，女方卵巢低反应引起的不孕。
[0115] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过2次长 方案促排卵IVF-ET ;1次获卵3枚，卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI)助孕，新鲜胚胎移 植2枚未孕；1次获卵6枚，再次ICSI助孕，获2枚可移植胚胎，冻融胚胎移植未孕。后又 进行1次微刺激促排卵体外受精助孕，取卵1枚，未获可移植胚胎。
[0116] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行1次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0117] 患者 6
[0118] 患者年龄：42岁。
[0119] 患者病情：因为尚龄原因引起的不孕。
[0120] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过2次微 刺激促排卵体外受精助孕，冻融胚胎移植1次未孕。
[0121] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行1次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0122] 患者 7
[0123] 患者年龄：31岁。
[0124] 患者病情：双侧输卵管切除术后，卵巢功能减退引起的不孕。基础内分泌检查 FSH7. 78, B超检查提示左侧卵巢窦卵泡储备5枚，右侧窦卵泡储备2枚。反复体外受精失 败史。
[0125] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过1次长 方案促排卵IVF-ET ;3次微刺激促排卵体外受精助孕，冻融胚胎移植1次未孕。
[0126] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行2次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0127] 患者 8
[0128] 患者年龄：35岁。
[0129] 患者病情：因为高龄、反复夫精人工受精失败、不明原因引起的不孕。
[0130] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过2次长 方案促排卵IVF-ET ;3次微刺激促排卵体外受精助孕，冻融胚胎移植1次未孕。
[0131] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1包），服用3个月后，再行2次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0132] 患者 9
[0133] 患者年龄：27岁。
[0134] 患者病情：结婚4年未避孕未孕，女方多囊卵巢综合症，多次促排卵因排卵障碍助 孕失败。
[0135] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过2次长 方案促排卵IVF-ET，进行1次新鲜胚胎移植，2次冻融胚胎移植治疗，未获临床妊娠。
[0136] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天2包），服用3个月后，再行1次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0137] 患者 10
[0138] 患者年龄：32岁。
[0139] 患者病情：结婚10年未避孕未孕，女方多囊卵巢综合症，多次促排卵因排卵障碍 助孕失败。
[0140] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过2次长 方案促排卵IVF-ET，微刺激方案促排卵2次，进行1次新鲜胚胎移植，4次冻融胚胎移植治 疗，未获临床妊娠。
[0141] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天2包），服用时间3个月后，再行1次微刺激 促排卵体外受精技术助孕。
[0142] 患者 11
[0143] 患者年龄：29岁。
[0144] 患者病情：结婚6年，未避孕未孕5年，女方卵巢功能减退，三次促排卵人工授精均 未孕。
[0145] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过3次人 工授精，2次微刺激方案促排卵IVF - ET，2次冻融胚胎移植治疗，未获临床妊娠。
[0146] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1/2包），服用时间3个月后，再行2次微刺 激促排卵体外受精技术助孕。
[0147] 患者 12
[0148] 患者年龄：34岁。
[0149] 患者病情：结婚10年未避孕未孕，男方严重少弱精子症，女方卵巢功能减退，基础 FSH12. 5, 7年前行1次人工授精未孕。
[0150] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过1次人 工授精，3次微刺激方案促排卵IVF，1次冻融胚胎移植治疗，未获临床妊娠。
[0151] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1/2包），服用时间3个月后，再行2次微刺 激促排卵体外受精技术助孕。
[0152] 患者 13
[0153] 患者年龄：29岁
[0154] 患者病情：因女方子宫内膜异位症IV期，左卵巢巧克力囊肿剥除术盆腔粘连松解 术后2年不孕。
[0155] 是否接受过辅助生育技术治疗：接受过。接受过的辅助生育技术是：接受过2次微 刺激方案促排卵IVF，1次冻融胚胎移植治疗，未获临床妊娠。
[0156] 治疗方案：服用表1中组成物1 (每天1/2包），服用时间3个月后，再行1次微刺 激促排卵体外受精技术助孕。
[0157] 长方案促排卵IVF-ET的具体做法是：黄体中期（前一月经周期第21天）进行垂 体降调节（促性腺激素释放激素激动剂GnRHa)，用药10~14天后，测FSH、LH、E2,显示抑 制满意，则开始给予皮下注射重组人促卵泡激素（Gonal-F，75IU/支）2-3支每天，定期B 超检查以及行血黄体生成素（LH)、孕酮（P)、雌二醇（E2)测定。当卵泡直径达到18_时，于 当晚注射HCG 10000IU。注射HCG后34~36小时在阴道B超引导下取卵。取卵后4~6 小时行IVF或卵细胞浆内单精子注射（ICSI)，18小时左右观察受精情况。将正常受精的卵 继续培养24~48小时后，显微镜下评估胚胎质量，移植到宫腔。移植后14天检测血HCG， 移植后21~24天B超检查，以确定临床妊娠。
[0158] 微刺激促排卵周期辅助生育技术手术：以月经来潮为第1天，第2天空腹女性生殖 激素检查，第3天给予克罗米芬，50mg/d，5天后经阴道B超检查，继续克罗米芬治疗，每日予 以尿促性腺素（HMG，75IU/支）或注射用重组人促卵泡激素 （Gonal -F，75IU/支）2-3支，定 期B超检查以及行血黄体生成素（LH)、孕酮（P)、雌二醇（E2)测定。当卵泡直径达到18_ 时，当日夜间予以绒毛膜促性腺素（HCG) 10000U注射，36h取卵。如卵泡液中未见卵母细胞， 用培养液冲洗卵泡腔，再抽取。取卵后4~6h行IVF或卵细胞浆内单精子注射（ICSI)，18h 左右观察受精情况。将正常受精的卵继续培养24~48h后，显微镜下评估胚胎质量，将可 移植胚胎进行全胚胎冷冻保存。下个月经周期进行冻融胚胎移植。
[0159] 实施对象的给药方式选自如下：
[0160] (a) -天服用1次，每次服用2500mg量（即1包），其中雨生红球藻提取物 333. 5mg，相当于含奸红素6mg。服用方法为：温水吞服。
[0161] (b) -天服用1次，每次服用5000mg量（即2包），其中雨生红球藻提取物667mg， 相当于含虾红素12mg。服用方法为：温水吞服。
[0162] (c) 一天服用1次，每次服用1250mg量（即1/2包），其中雨生红球藻提取物 166. 8mg，相当于含奸红素3mg。服用方法为：温水吞服。
[0163] 按照以上给药方式之一给予患者服用所述的组成物3个月之后，全部实施微刺激 促排卵周期辅助生育技术手术，具体方法同上描述。比较13例患者服用组成物1前后辅助 生育技术实施的结果，包括取卵数、可移植胚胎数、优质胚胎数及临床妊娠率等指标。
[0164] 实施例2、患者1-8用药（服用量1包）前后实施微刺激体外受精助孕获得卵子数 量变化
[0165] 患者1-8通过服用3个月组成物1后，同样进行微刺激体外受精技术助孕，考察患 者1-8用药前后平均每取卵周期的卵子获得数的变化。获得的8个患者的卵子数量统计总 数后计算平均数值。
[0166] 结果如图1所示，摄取所述的组成物之前和之后患者的平均获卵数有显着的增 加，从2. 2个增加到了 3. 8个。
[0167] 获卵数是显示患者卵巢生产正常的成熟的卵子的能力的一个指标。因此可见，通 过摄取本发明的组成物，患者卵巢的功能有显着的提高。
[0168] 实施例2、患者1-8用药（服用量1包）前后实施微刺激体外受精助孕获得正常受 精卵数量变化
[0169] IVF/ICSI卵母细胞获取的操作常规如下：
[0170] 1、操作液的准备
[0171] (1)子宫颈/ 口擦洗液：10ml培养液（M-HTF/HTF/P1液）/每病人。
[0172] (2)卵母细胞体外操作液（M-頂）：M_HTF液+10 % SSS (v/V)。
[0173] 根据病人治疗的情况准备M-頂液：IVF病人：5ml ;ICSI病人：7ml。
[0174] (3)卵母细胞体外受精液（頂）：HTF液+10% SSS(v/V)，10ml/每病人。
[0175] (4)胚胎体外培养液（GM) :P1/ECM液 +10% SSS(v/V)，5 ~6ml/ 每病人。
[0176] (5)矿物油：15~20ml/每病人。
[0177] 所有操作液和矿物油用15ml Falcon无菌试管分装，标上标签（名称、配制日期、 配置者姓名），于取卵的前一天置培养箱中（5% C02、37°C、100%湿度）平衡，其中M-頂等 带Hepes的培养液只需加温，无需平衡，盖紧盖子。
[0178] 2、卵母细胞的采集与处理
[0179] (1)取卵前应有专职的护士和实验室技师严格的审查接受治疗的夫妻双方的结婚 证、身份证、知情同意书以及其它必要的证件和文书，仔细阅读病历。
[0180] (2)取卵前30分钟，将经已检测的falcon3003培养皿于加热平台上预热。
[0181] (3)在温度调试好的工作区内，装M-頂液的falcon3001培养皿2~3个，培养皿 盖标上患者的姓名（如有重名，加标丈夫的姓名或操作者能区分的其它符号）、以及液体的 名称。
[0182] (4)将每管卵泡液倒入3003皿中，在体视显微镜下仔细检查，用巴氏德管将卵 丘-卵母细胞复合体（COCs)检至装M-頂液的3001培养皿中，详细记录卵泡的数目和卵母 细胞的数目，并及时与穿卵手术者通报捡卵情况。
[0183] (5)将取出的COCs在装M-頂液的3001培养皿中充分漂洗3~4遍，去除血细胞 和其它杂质，最后将漂洗过的COCs移入装頂液的干净falcon3037培养皿中。
[0184] (6)卵母细胞成熟度的观察与评价：
[0185] 适当调整体视显微镜倍数，对卵母细胞的成熟度进行评价，评价的依据为卵母细 胞、放射冠和卵丘细胞的形态特征。
[0186] I :未成熟卵母细胞：卵细胞呈深色；放射冠没有分散开；卵丘细胞紧密排列，颜色 偏深。
[0187] II :欠成熟卵母细胞：卵细胞颜色变浅；放射冠已呈不同程度的分散；卵丘细胞排 列变稀疏，颜色变浅。
[0188] III :成熟卵母细胞：卵细胞颜色很淡，形状为规则的圆形；放射冠呈完全分散状； 卵丘细胞团较大，排列稀松，颜色很淡，光镜下发亮。
[0189] IV :过熟卵母细胞：卵细胞颜色变深；放射冠分散；卵丘细胞团扩散，细胞团中有 黑色颗粒团，折光性较差，或卵丘细胞团已部分脱落，能见不均匀卵母细胞质。
[0190] 必要时切除颗粒细胞，观察第一极体，详细记录卵子成熟情况及捡卵过程。
[0191] (7)检卵者、手术者和助手在检卵记录上小结并签字。
[0192] (8)向病人通报取卵情况。
[0193] (9)卵母细胞的培养
[0194] 将装有COCs的3037培养皿迅速移入培养箱中（37°C、5% C02)培养。培养时间据 卵母细胞的成熟度而定，一般在取卵后再培养3~5小时，准备受精。
[0195] (10)取卵结束后立刻准备受精滴和胚胎培养滴
[0196] 原则上根据卵细胞的数量准备受精滴：
[0197] 当卵细胞数目小于6时，采用微滴法或四孔皿法受精。在3001培养皿中分别做頂 液（IVF病人用）和GM液（IVF和ICSI病人用）微滴（20~30 μ 1/每滴），上覆矿物油，移 入培养箱中平衡、备用。
[0198] 当卵细胞数目大于等于6时，采用3037培养皿法受精。在3037皿中间加1ml頂 液，旁边2ml頂液。卵细胞加入到中间lml頂液中备用。准备GM液微滴上覆矿物油，移 入培养箱中平衡、备用。
[0199] 所有培养皿盖均须标上患者的姓名（如有重名，加标丈夫的姓名或操作者能区分 的其它符号）、培养液的名称。
[0200] 获得受精卵的方法有体外受精（IVF)和卵胞浆内单精子注射（ICSI)两种：
[0201] IVF的受精操作常规如下：
[0202] (1)将预处理好的精子滴片观察。
[0203] (2)将经过培养的COCs移入頂微滴或3037皿。
[0204] (3)取卵数大于等于6枚，一般采用3037法受精；取卵数小于6枚，一般采用微滴 法或者四孔皿受精。加精终浓度为5X 105个/ml，加精后待精子团散开后，镜下观察，以两 个精子间的距离约为一个精子的长度为最佳浓度。
[0205] (4)将培养皿移入培养箱中（37°C、5% C02、100%湿度），精卵共培养16~18小 时。
[0206] (5)详细记录加精的时间，加精的浓度等操作过程，操作者和证人签名。
[0207] (6)受精后16~18小时后拆蛋（剥除卵母细胞周围的卵丘颗粒，暴露卵母细胞的 过程），先拉毛细管，毛细管的粗细以卵母细胞直径的1. 5倍、不损害卵母细胞为准；移卵的 毛细管的管径应大于卵母细胞，并过火钝化管口。
[0208] (7)精卵共培养16~18小时后，准备四孔板，其中一孔为M-頂液，另外三孔为GM 液，将卵子移入M-頂中，用毛细管同时反复吹打多枚卵子除去周围的卵丘细胞，注意动作 要轻柔。
[0209] (8)将卵子在GM液中洗涤约5~10次（用移卵管将卵子在GM液中吹吸），移入 GM液微滴中（每卵/每滴）。迅速移入培养箱。
[0210] 卵胞浆内单精子注射（ICSI)操作规程如下：
[0211] 1、卵细胞准备，颗粒细胞（放射冠）去除（拆蛋）：
[0212] (1)选用透明质酸酶和PVP均为商品化试剂，提前预温，透明质酸酶需在使用前1 小时放置于二氧化碳培养箱中平衡。
[0213] (2)拉制口径200~300 μ m毛细管数根。准备两个3037皿，分别标上ICSI前和 ICSI后以及患者姓名和日期。两个3037皿中间均加入lml GM并覆盖矿物油，移入培养箱 备用。
[0214] (3)在已预热的4孔板1、2和3号孔、中间孔中加入M-頂液各lml。在1号孔中 加入透明质酸酶工作液0. 5ml。4号孔中加入GM液lml。
[0215] (4)每次取COCs 4~5枚加入4孔板的1号孔，用较大口径毛细管反复吹打至去 除大部分卵丘颗粒细胞，20秒内移入中间孔洗涤，再到2号孔用200 μ m毛细管继续吹打至 颗粒细胞基本去除，15秒内再移入3号孔吹打洗涤至完全去除颗粒细胞。将卵母细胞在4 号孔中充分洗涤后移入ICSI前的3037皿中，随后移入培养箱中备用。
[0216] 2、显微注射准备：
[0217] (l)PVP:提前预温。
[0218] (2)显微注射皿的准备：采用1006皿制备显微注射皿。
[0219] (3)架针：调节附有显微注射器的倒置显微镜，先在普通4倍镜下调焦，清晰后换 至高4倍镜安装显微固定针及显微注射针，调节平行，特别注意调节显微注射针的水平位 置。安好后再依次换从普通4倍至20倍，检查注射针尖端是否锐利，固定针顶端是否光滑， 两针分别吸入少量培养液平衡压力。
[0220] 3、精子选择、制动与卵浆内注射：
[0221] (1)尽可能选择形态正常与活动好的精子，将此类精子移入PVP滴。
[0222] (2)注射针置于精子尾部中点，下压、水平快速拉过尾部制动，将精子从尾部吸入 注射刺针。
[0223] (3)取1枚或多枚（最多不能超过4枚）成熟卵移入ICSI皿的M-頂培养液滴中， 用固定针于9点处将1只卵固定，极体置于6或12点处。
[0224] (4)将已吸入一条经制动处理精子的注射针移入液滴（如发现精子仍活动，则须 返回PVP滴重新制动），检查推拉注射器（或吹吸）时精子是否前后移动（未粘于注射针内 壁），于3点或9点处刺入透明带、卵细胞膜，回吸部分卵胞浆（胞浆如能快速回吸入注射 针，则说明胞膜已破），然后将回吸的胞浆连同精子及尽量少的PVP -起注入胞浆，慢慢撤 出注射针。注射后卵细胞浆在1~5分钟内缓慢恢复正常形态，这时检查精子是否留在胞 浆内，如果精子被注射到卵周间隙，则需要重复注射一次。如一次移入几只卵，则重复上述 步骤至注射完所有卵细胞。每个M-頂滴每次只放1枚卵。
[0225] (5)将已注射的卵移入标有ICSI后的3037皿中反复洗涤，移入GM培养滴中，采用 单滴单卵法进行培养，培养皿迅速置于37°C，5% C02培养箱培养。
[0226] (6)无极体的未成熟卵可尝试生长液培养，待当晚或第二天出现第一极体后再行 精子注射。
[0227] 受精观察：
[0228] 在400倍下观察原核，有双原核的卵为正常受精的胚胎，单原核、多原核、无原核 (排除晚期卵裂）的卵则判为异常受精或不受精，详细记录观察时间及受精卵的异常情况 如透明带异常，大量空泡，胞浆颗粒粗、胚胎破裂或死亡、多核等。
[0229] 结果如图2所示，患者1-8平均的正常受精卵数量，受精的卵子数量从1. 5个增加 到3个，并且卵子的质量都是上乘的。
[0230] 实施例3、患者1-8用药（服用量1包）前后实施微刺激体外受精助孕获得可移植 胚胎数变化
[0231] 胚胎发育的观察、胚胎质量的评价：
[0232] -级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀、数目均等，细胞质均一、无空泡，碎片少于 5% ；
[0233] 二级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀或大致均匀、数目均等或大致均等，细胞质 均一、无空泡，碎片不超过10% ;
[0234] 三级：胚胎发育速度大致正常，卵裂球不均匀/均匀、数目不均等/均等，细胞质中 有少量空泡，少于15 %碎片；
[0235] 四级：胚胎发育速度异常，卵裂球不均匀、数目不均等，细胞质不均一、有大量空 泡，10~50 %碎片；
[0236] -级和二级统称为优质胚胎；一级，二级和三级统称为可移植胚胎。
[0237] 胚胎发育观察
[0238] (1)受精观察：在400倍下观察原核，有双原核的卵为正常受精的胚胎，单原核、多 原核、无原核（排除晚期卵裂）的卵则判为异常受精或不受精，详细记录观察时间及受精卵 的异常情况如透明带异常，大量空泡，胞浆颗粒粗、胚胎破裂或死亡、多核等。
[0239] (2)第二天观察胚胎发育情况，并打分，详细记录细胞数，碎片，细胞核情况。根据 胚胎发育速度，第二天2细胞胚胎最多评为II级胚胎，不能评为I级胚胎。受精卵数目少于 3个的可于第二天移植。准备ET液（Pl/ECM+50% SSS液，2ml/每病人）。
[0240] (3)第三天观察胚胎发育情况，挑选最好的胚胎移植，尽可能选择一级和二级优质 胚胎，其余多余的可移植胚胎可选择冷冻。融合胚胎不写明细胞数，可注明碎片比例，优先 选择移植。第三天小于4个卵裂球的细胞都算IV级胚胎。
[0241] (4)解冻胚胎在上午解冻后立即观察，解冻后存活卵裂球数大于冷冻前50%定义 为存活。第二天上午移植前观察，卵裂球数增多定义为胚胎生长，若未生长，评分应比冷冻 前降一级，尽量选择卵裂球数增多的胚胎移植。
[0242] 结果如图3所示，在服用本发明的组成物之前，患者只有0. 3个可移植胚胎数；在 服用后，上升到了 1个，并且胚胎的质量显着改善。
[0243] 实施例4、患者1-8用药（服用量1包）前后实施微刺激体外受精助孕获得高质量 胚胎数变化
[0244] 胚胎观察和评价同前。结果如图4所示，服用前后患者的平均优质胚胎数从0. 13 个上升到了 0. 48个。
[0245] 综上实施例1~4,8名患者服用组成物1三个月前后的微刺激体外受精实施结果 比较如表2。
[0246] 表 2
[0247]
[0248] 实施例5、患者2,4-8用药（服用量1包）前后着床率以及临床妊娠率比较
[0249] 参加试验的患者2,4_8,在服用本发明的组成物之前共计进行过6个周期冻融胚 胎移植，其着床率与临床妊娠都是0 %。
[0250] 服用本发明的组成物3个月后行微刺激体外受精技助孕，患者2,4-8再进行7个 周期的冻融胚胎移植，统计患者着床率以及妊娠率。
[0251] 玻璃化胚胎冷冻解冻操作常规如下：
[0252] 1、胚胎冷冻
[0253] (1)采用玻璃化的方法进行胚胎的冷冻和解冻。
[0254] (2)商品化的胚胎冷冻保护液按规定4°C低温保存，并严格在有效期内使用。
[0255] (3)观察完胚胎，确认需要冷冻后，冷冻前半~一小时将冷冻平衡液VI和玻璃化 冷冻液V2分别取lml移入标记好的四孔板的1和2号孔中，四孔板上详细记录患者姓名及 编号，置于室温下。冷冻时应该确保两种液体已经完全恢复室温。
[0256] (4)在载体和冷冻铝杆上做好标签，标签必须能耐受超低温而不褪色，标签上注明 患者姓名，编号。
[0257] (5)将胚胎移入VI中5分钟，随后迅速移入V2中，在一分钟内完成装管过程。然 后投入液氮中，套上套子。最后放入液氮罐保存。
[0258] (6) -根载体冷冻不能超过三枚胚胎。
[0259] (7)在冷冻登记本上详细的记录患者姓名，编号，储藏的位置，冷冻胚胎的数量和 质量以及冷冻者和证人签名。
[0260] 2、胚胎解冻
[0261] (1)冷冻胚胎解冻，提前一天配制培养液。配制BM(10% SSS的Blastocyst液） 两毫升，并根据冻胚的数量用3001培养皿做20-30 μ L的BM微滴；培养滴和培养液放入培 养箱中平衡过夜，备用。
[0262] (2)商品化的胚胎解冻液按规定4°C低温保存，并严格在有效期内使用。
[0263] (3)解冻前至少半小时将解冻液T1、T2、T3和T4分别取0. 5-lml移入四孔板的1、 2、3和4号孔中，置于室温下，四孔板上应标明患者姓名及编号、解冻液名称。解冻时应该确 保四种液体已经完全恢复室温。
[0264] (4)准备泡沫盒并装满液氮，将需解冻的载体从储存胚胎的液氮罐中迅速移入泡 沫盒中，再次确认载体上的标签是否正确。
[0265] (5)核对后将载体取出，在液氮中用镊子取下套子，胚胎移入1号孔中1-3分钟，然 后2号孔3分钟，3号孔3分钟，最后移入4号孔中。
[0266] (6)胚胎经过4号孔液体充分洗涤后移入BM微滴中，随后观察记录胚胎卵裂球的 数量以及形态等。
[0267] (7)详细记录解冻过程和解冻时间，解冻者和证人签名。
[0268] (8)第二天观察胚胎发育的情况，移植的胚胎必须是有卵裂球增殖的胚胎。
[0269] 胚胎移植操作常规如下：
[0270] (1)用于移植的胚胎应由实验室技师挑选，和临床医生沟通病人胚胎情况后由临 床医生和病人谈话，患者夫妇签署知情同意书，多余的胚胎经病人同意冷冻、捐献科研或者 废弃，须签署相应的文书和协议。
[0271] (2)将所要移植的胚胎提前1~2分钟移至ET液中备用。移植过程严格无菌操 作，严格遵循证人制度。
[0272] (3)用1ml注射器吸取0. 3mlET液，套上ET管，头部向上，吸入少量空气，轻弹注射 器，使气体排出，缓慢推动注射器，排出多余ET液，抽吸lcm空气。
[0273] (4)当手术室一切准备就绪后，吸胚胎和ET液（约5 μ L)，再吸lcm空气，最后吸 ET液5yL左右。
[0274] (5)临床医生在B超引导下，完成ET。
[0275] (6)ET结束后，实验室技师应迅速将ET的内、外套管带至实验室仔细检查，特别注 意血和粘液中是否有残留的胚胎，若有则应及时通知临床医生，准备二次ET。
[0276] (7)实验室技师和临床医生共同填写ET表，详细记录出血和黏液情况，实验室技 师和临床医生以及证人共同签字。
[0277] 表3是给摄取了本发明的组成物的患者进行胚胎移植时的着床率以及妊娠率的 图表。摄取后对6例患者进行7个周期冷冻胚胎移植，着床率为44. 44% (相当于移植9个 胚胎中4胚胎着床），临床妊娠率达到了 66. 67% (相当于6个移植周期中4个周期临床妊 娠）。
[0278] 表3、服用了本发明的组成物之前和之后着床率以及妊娠率
[0279]
[0280] 因此，本发明的组成物对于不孕患者有非常好的效果。
[0281] 实施例6、患者9-10用药（服用量2包）前后临床妊娠情况
[0282] 患者9服用本发明的组成物2包/天，服用时间3个月后，再行1次微刺激促排卵 体外受精技术助孕。
[0283] 患者10服用本发明的组成物2包/天，服用时间3个月后，再行1次微刺激促排 卵体外受精技术助孕。
[0284] 结果如表4。
[0285] 表 4
[0288] 由表4结果可见，本发明的组成物可以有效地提高胚胎质量，有效地促进临床妊 娠成功率。
[0289] 实施例7、患者11-13用药（服用量1/2包）前后临床妊娠情况
[0290] 患者11服用本发明的组成物1/2包/天，服用时间3个月后，再行2次微刺激促 排卵体外受精技术助孕。
[0291] 患者12服用本发明的组成物1/2包/天，服用时间3个月后，再行2次微刺激促 排卵体外受精技术助孕。
[0292] 患者13服用本发明的组成物1/2包/天，服用时间3个月后，再行1次微刺激促 排卵体外受精技术助孕。
[0293] 结果如表5。
[0294] 表 5
[0295]
[0296] 由表5结果可见，本发明的组成物可以有效地提高胚胎质量，有效地促进临床妊 娠成功率。
[0297] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 含有邮红素的提取物在制备治疗或改善女性不孕的组成物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组成物还用于： 提高卵泡对促性腺激素的反应性； 促进女性排卵； 提高卵子质量；或 提高胚胎的着床率和/或提高临床妊娠率。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的含有邮红素的提取物是雨生红球藻 提取物。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组成物中还包括维生素E、维生素C 和糊精。5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的组成物中包括： 虫下红素： 3-20重量份；较佳地为4-15重量份； 维生素 E; 5-20重量份；较佳地为6-^重量份； 维生素 C: 5-20重量份；较佳地为6-15重量扮； 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。6. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的组成物中还包括调味剂；较佳地所述 调味剂包括：可可粉，香蕉粉，玉米粉；更佳地，组成物中包含可可粉500-2500重量份。7. -种用于治疗或改善女性不孕的组成物，其特征在于，所述的组成物中包括： 师红素： 3-20重量份；较佳地为4-15重量份； 维生素 E: 5-誠重量份；较佳地为6-15重量份； 维生素 C; 5-20重量份：较佳地为6-15重量份； 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量粉。8. 如权利要求7所述的组成物，其特征在于，所述的组成物中还包括调味剂，较佳地所 述调味剂包括：可可粉，香蕉粉，玉米粉；较佳地，组成物中包含可可粉500-2500重量份。9. 一种制备用于治疗或改善女性不孕的组成物的方法，其特征在于，所述的方法包括， 将邮红素或含有邮红素的提取物、维生素E、维生素C W及糊精混合，各成分的用量为： 邮红素； 3-20重量份；较佳地为4-15重量份； 维生素 E; 5-20重量份；较佳地为6-15重量份； 维生素 C: 5-20重量份；较隹地为6-15重量份； 糊精： 800-2500重量份；较佳地为1000-1800重量份。10. -种用于治疗或改善女性不孕的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括： 容器，W及装于该容器中的权利要求7或8所述的组成物。
【文档编号】A61K31/355GK106031721SQ201510107072
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月11日
【发明人】蔡立义, 高桥祐司, 石井好智, 张帆
【申请人】上海瑞亦康生物科技有限公司