山沉香抗肿瘤提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药山沉香抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤细胞株药物中的应用。维吾尔药山沉香经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用体积比100：20的石油醚：乙酸乙酯洗脱，继用体积比100：100的石油醚：乙酸乙酯洗脱，石油醚：乙酸乙酯100：100洗脱液干燥后即得。
【专利说明】
山沉香抗肿瘤提取物及其组合物的医药用途和制备方法
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药山沉香抗肿瘤提取物及其组合物 的制备方法和其在制备预防或/和治疗脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫 颈癌、肝癌等恶性肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 本品为木樨科植物羽叶丁香，学名Syringa pinnatifolia Hemsl.的根。主要分布 在宁夏、陕西、四川。山沉香辛，微温，主要用于降气，温中，暖胃。主治胃腹胀痛，寒喘。外 用治皮肤擦伤，烧烟熏治子宫脱垂、脱肛。
[0003] 但对其抗肿瘤研究却是空白，本发明通过系统地筛选研究，出人意料地发现了山 沉香的有效提取物，可以应用于肿瘤的预防和治疗。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是提供一种山沉香提取物，该提取物具有抗脑胶质瘤、 乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤的作用。
[0005] 本发明还提供了以山沉香提取物作为活性成分的药物组合物及其制备方法。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 维吾尔药山沉香经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂=100:0-0:100梯度洗脱（石油醚：乙酸乙酯，具体比例 见表1)，各石油醚：乙酸乙酯比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外抗肿瘤活性筛 选体系测试其抗肿瘤活性，意外地发现先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:0-100:20，体积比）洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯， 100:25-100:100,体积比）洗脱，石油醚：乙酸乙酯100:25-100:100洗脱液回收有机溶剂， 干燥得到的提取物，具有抗肿瘤活性，即抗肿瘤活性化合物，而其他比例的洗脱提取物，没 有抗肿瘤活性。该活性提取物可以通过以上方法，得到富集，从而与其他杂质类成分分离 开。该活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。TLC分析条件：GF254硅胶板， 展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6 :1 :1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0008] 具体，发现过程如下：
[0009] 1、维药山沉香经甲醇超声提取物的制备
[0010] 取维吾尔药山沉香20g，经200ml甲醇超声提取15min，药渣再用200ml水加热提 取2h，经大孔树脂处理，提取液浓缩后，得提取物SN0228A 0. 6540g，SN0228B 0. 3223g，合 并共 976. 3mg，留样 98. lmg，剩余 878. 2mg。
[0011] 2、石油醚乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱方法和结果
[0012] 取维吾尔药山沉香20g，经200ml甲醇超声提取15min，药渣再用200ml水加热提 取2h，经大孔树脂处理，提取液浓缩后，得提取物SN0228A 0. 6540g，SN0228B 0. 3223g，合 并共976. 3mg，留样98. lmg，剩余878. 2mg。上柱，甲醇溶解，共用甲醇15ml。上硅胶柱色 谱，拌样硅胶I. 5g，空白硅胶5g，玻璃柱内径I. 5cm，石油醚：乙酸乙酯系统梯度洗脱（条件 见表1)，柱体积12. 5ml，每个梯度洗脱100ml，得到各个梯度洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即 得，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱提取物，重量见表1，TLC分析结果见图2和图3。色谱条件： 硅胶板GF 254，展开系统：石：乙：丙=6:1:1，显色方法：浓硫酸香草醛。色谱条件：硅胶板 GF254，展开系统：石：乙：丙=3:1:1，显色方法：浓硫酸香草醛。
[0013]表 1
[0015] 3、抗肿瘤活性筛选方法和结果
[0016] 1)实验条件
[0017] a)细胞株信息
[0018] 大鼠脑胶质瘤细胞株C6购于中国典型培养物保藏中心细胞库。
[0019] b)药品及试剂
[0020] 样品无菌条件下，DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL，使用时用RPMI-1640培 养液稀释至所需浓度（DMSO彡1%。）。
[0021] RPMI Medium 1640培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马 生物技术研究所。Trypsin 1 :250、二甲基二苯基四氮唑溴盐（MTT)。
[0022] c)仪器
[0023] CO2培养箱（SANYO,日本）
[0024] 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）
[0025] 倒置生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）
[0026] 低/高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）
[0027] 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）
[0028] 酶标仪（伯乐生命医学产品有限公司）
[0029] 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）
[0030] 鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）
[0031] PH 计（SART0RIUS，德国）
[0032] 2)实验方法和过程
[0033] 大鼠脑胶质瘤细胞株C6以4000/孔的密度铺于96孔板，每孔IOOul，12h后使用。 各组分以DMSO溶解为lOOmg/mL储存液，保存于-20°C待用。铺板后12h，观察细胞汇合率 约为40%，加药，浓度均为100yg/mL，每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组（培 养基+细胞；含〇. 1% DMSO培养基+细胞），3个空白孔（只有培养基）。加入药物24小 时后，加入20 μ 1四甲基偶氮唑盐化学名为3- (4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide，ΜΤΤ)，继续培养 4 小时。完全弃去上清液，加入100 μ I DMS0,混匀使MTT完全溶解，去气泡。490nm测定OD 值。
[0034] 抑制率（IR)= A对照-A贼 x 100:: % A ^ A Sti
[0035] 3)实验结果
[0036] 表 2
[0042] 结果发现：维吾尔药山沉香经有机溶剂超声提取，再用水提取，水提液经大孔树脂 处理，浓缩合并后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油 醚：乙酸乙酯，100:25,体积比）洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯， 100:100,体积比）洗脱，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液经回收有机溶剂，干燥，得到高活 性提取物，即为该抗肿瘤的提取物。该活性部位从未见文献报道，其100:100洗脱液的TLC 分析表征如图1。
[0043] 4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研究
[0044] 1)提取溶剂的种类研究
[0045] 分别用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有 机溶剂提取，并测试提取物的对C6细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0046] 表 3
[0048] 研究结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水 混合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0049] 2)提取溶剂的用量研究
[0050] 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/体积比）有机溶剂提取，并测试提取物 对C6细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0051] 表 4
[0055] 提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。
[0056] 3)干燥方法的研究
[0057] 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到 的抗肿瘤活性部位进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干燥 法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对C6细胞的抗肿瘤活性提取物进行干燥，其 中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0058]表 5
[0060] 因此，山沉香抗肿瘤提取物的制备方法为：
[0061] 维吾尔药山沉香经有机溶剂超声提取，再用水提取，水提液经大孔树脂处理，浓缩 合并后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:25,体积比）洗脱2-50倍体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:100,体积比）2-50倍体积洗脱。以上条件最优为先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂 (石油醚：乙酸乙酯，100:25,体积比）洗脱10倍体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石 油醚：乙酸乙酯，100:100,体积比）15倍体积洗脱，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液回收 有机溶剂，干燥即得到有效提取物。其中，
[0062] 1)提取物提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶 剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。提取物提取用有机溶剂用量为药材重量 的2-50倍（重量/体积比）。
[0063] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0064] 5.山沉香抗肿瘤有效提取物（洗脱液为0 :100时干燥获得的提取物）的抗肿瘤 活性研究
[0065] 利用各种肿瘤细胞，如脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝 癌等恶性肿瘤细胞株，分别测试山沉香抗肿瘤提取物的抗肿瘤活性，IC 5。结果如下：
[0066] 表 6
[0067]
[0068] 因此，我们发现，山沉香抗肿瘤提取物具备抗肿瘤活性，可望用于各种肿瘤如脑胶 质瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤细胞株的预防及治疗。 [0069] 6、山沉香抗肿瘤有效提取物的组合物及其制备方法研究
[0070] 1)固体分散体
[0071] 处方
[0073] 制备方法：
[0074] 称取山沉香提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1 :2、1 :4、1 :6的质量比 分别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至山沉香提取物和载体完全溶解，转入旋 蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得山沉香提取物PVP包合物。
[0075] 2)环糊精包合物
[0076] 处方：
[0078] 制备方法：
[0079] 将β -环糊精与1~5倍水研匀，加山沉香提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0080] 3)分散片处方：
[0081] 山沉香提取物 100
[0082]
[0083] 制备方法：
[0084] 1.山沉香提取物淀粉分散体的制备，精密称取山沉香提取物，加入适量的十二烷 基硫酸钠，用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温度下蒸 干，粉碎，过100目筛；
[0085] 2.称取处方量，山沉香提取物淀粉分散体，交联聚维酮，预胶化淀粉，用70%乙 醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60°C烘箱烘干 45min，16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
[0086] 7、山沉香抗肿瘤有效提取物的检测方法研究
[0087] 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示山沉香抗肿瘤有效提取物 的特征。见图1。
[0088] 具体条件为：色谱条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6 :1 :1) 显色方法：香草醛-硫酸显色。
【附图说明】：
[0089] 图1山沉香C6抑制活性提取物的TLC色谱图；
[0090] 图2山沉香得到的化学组分的TLC色谱图；
[0091] 图3山沉香得到的化学组分的TLC色谱图。
【具体实施方式】
[0092] 以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0093] 实施例1 :
[0094] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液经回收有机溶 剂，真空干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提取物，收率为0. 04%。
[0095] 实施例2 :
[0096] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL乙醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液经回收有机溶 剂，冷冻干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提取物，收率为I. 1 %。
[0097] 实施例3 :
[0098] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL丙酮超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯， 100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液经回收有机溶剂，鼓 风干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提取物，收率为0. 006%。
[0099] 实施例4 :
[0100] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL氯仿超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙 酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液经回收有机溶 剂，离心干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提取物，收率为0. 004%。
[0101] 实施例5:
[0102] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL乙酸乙酯超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶 柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙 酸乙酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸 乙酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯100:100洗脱液经回收有机溶 剂，旋蒸干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提取物，收率为0. 006%。
[0103] 实施例6:
[0104] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL甲醇水混合溶剂（甲醇：7jC= 1 :1)超声提取 15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙 酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸 乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯 100:100洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提 取物，收率为0.026%。
[0105] 实施例7 :
[0106] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1 :1)超声提取 15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙 酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸 乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯 100:100洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提 取物，收率为0.017%。
[0107] 实施例8:
[0108] 取维吾尔药山沉香20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=90 :10)超声提取 15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚：乙 酸乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯，100:25,体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸 乙酯混合溶剂（石油醚：乙酸乙酯，100:100,体积比）洗脱15倍柱体积，石油醚：乙酸乙酯 100:100洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，得到的高活性提取物，即为该C6抑制活性的提 取物，收率为0.010%。
[0109] 实施例9 :固体分散体
[0110] 称取山沉香提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1 :2、1 :4、1 :6的质量比 分别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至山沉香提取物和载体完全溶解，转入旋 蒸仪中出去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得山沉香提取物PVP包合物。
[0111] 实施例10 :环糊精包合物
[0112] 将环糊精与1~5倍水研匀，加山沉香提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0113] 实施例11:分散片
[0114] 1.称取干燥的山沉香提取物，加入适量的十二烷基硫酸钠，使用70%的乙醇充分 溶解，加入水溶性淀粉与山沉香提取物（I : 1)，搅拌混合均匀，在70°C下干燥，粉碎，过100 目筛，得山沉香提取物分散体。
[0115] 2.精密称取处方量，山沉香提取物分散体，交联聚维酮，可压性淀粉，用70%乙醇 做湿润剂，边加入边搅拌，14目筛制成湿颗粒，室温下放置15min后，70°C烘箱烘干45min， 16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
【主权项】
1. 一种维吾尔药山沉香提取物，其特征为，维吾尔药山沉香经有机溶剂超声提取， 提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用体积比100:0-100:20的石油醚：乙 酸乙酯洗脱，继用体积比100:25-100:100的石油醚：乙酸乙酯洗脱，石油醚：乙酸乙酯 100:25-100:100洗脱液回收有机溶剂，干燥即得。2. 如权利要求1所述的一种维吾尔药山沉香提取物，其特征为，所述的提取用有机溶 剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，优选甲醇或95% 乙醇，提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。3. 如权利要求1所述维的维吾尔药山沉香提取物，其特征为，先用石油醚-乙酸乙酯 混合溶剂(石油醚：乙酸乙酯，100:25,体积比）洗脱，继用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油 醚：乙酸乙酯，100:100,体积比）洗脱，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚-乙酸乙酯， 100:100,体积比）洗脱的洗脱液经回收溶剂，干燥即为该提取物。4. 如权利要求1所述的维吾尔药山沉香提取物，其特征为，先用体积比为 100:0-100:20的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂2-50倍洗脱，继用体积比100:25-100:100的 石油醚-乙酸乙酯混合溶剂2-50倍洗脱，优选先用体积比为100:0-100:20的石油醚-乙 酸乙酯混合溶剂10倍洗脱，继用体积比100:25-100:100的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂15 倍洗脱。5. 如权利要求1所述的维吾尔药山沉香提取物，其特征为，先用体积比为100:20的石 油醚-乙酸乙酯混合溶剂2-50倍洗脱，继用体积比100:100的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂 2-50倍洗脱，优选先用体积比为100:20的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂10倍洗脱，继用体积 比100:100的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂15倍洗脱。6. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药山沉香 提取物和药学上可接受的载体。7. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的松香提取物或权利 要求6所述的药物组合物。8. 如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述的制剂为固体分散体、环糊精包合 物、分散片。9. 权利要求1-5任何一项所述提取物或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述 的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠 癌、胰腺癌、Η颈癌或肝癌。10. 如权利要求1-5任何一项所述的维吾尔药山沉香提取物，其特征在于，用TLC法检 测，其色谱条件为：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6 :1 :1)显色方法：香 草醛-硫酸显色。
【文档编号】A61P35/00GK105982966SQ201510081719
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月15日
【发明人】王金辉, 黄健, 孙富周
【申请人】沈阳药科大学