本发明属于青稞β-葡聚糖提取制备领域，具体涉及一种适宜应用于护肤品中的青稞β-葡聚糖提取物的制备。
背景技术：
：青稞（hordeumvulgare.l.var.nudumhook.f.）又称裸大麦、元麦，在植物分类学上属于禾本科小麦族大麦属大麦变种之一，主要分布于西藏、青海、甘肃、四川阿坝及甘孜州。青稞是藏区农牧民不可替代的主粮，它具有高蛋白质、高纤维、高维生素、低脂肪、低糖等特点。β-葡聚糖是青稞中主要活性成分之一，是胚乳和糊粉层细胞壁的主要成分，在糊粉层细胞壁（麸皮主要组成部分）中含量最高，青稞中β-葡聚糖远远高于皮大麦、小麦和燕麦。β-葡聚糖具有调节人体免疫力、降血糖、降血脂、抗肿瘤等作用。目前，针对青稞及其活性成分β-葡聚糖的制备工艺和应用的研究主要集中在食品、保健品领域。青稞β–葡聚糖在护肤品领域有极大的开发利用价值。现有技术中青稞β-葡聚糖主要制备方法有热水浸提法（酸提、碱提、中性条件提取）、微波提取法、超声波提取法、酶提取法以及多种提取方法协助提取等方法。现有技术中各提取方法均存在一定的不足之处，例如，现有提取工艺在提取前一般采用乙醇预处理青稞达到脱脂除杂的目的，提取完成后采用乙醇醇沉，分离纯化β–葡聚糖。工艺中引入乙醇具有一定危险性及工艺复杂性；微波炉提取、超声提取较难实现工业化生产，且噪音较大，长期生产会影响操作人员身体健康。此外，青稞中含有大量淀粉，如果直接将其在高温条件下提取，会导致淀粉糊化，不利于β-葡聚糖的提取，也导致提取物难以固液分离，给工业化生产带来不便；且纯水提取所得提取物热稳定性差，不适宜在护肤品中应用；碱性条件下青稞β-葡聚糖提取率较低；酶提取法条件温和，提取率高，易于工业化生产，现有技术中使用了果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、糖化酶等，具有较好的提取效果，但是制备工序较为复杂。如专利“复合酶法提取青稞β-葡聚糖和膳食纤维的方法”经过17步工序得到最终成品，提取过程中先高温（55-90℃）糊化处理，再加入淀粉酶，除去淀粉，淀粉糊化不利于固液分离，板框过滤法无法进行，工业化生产时，离心过滤也存在料液得率较低、设备操作难度较大、噪音大、占地面积大等缺陷，现有酶法提取产品稳定性也不能满足在护肤品中应用的需求。综上，由于青稞β-葡聚糖制备中存在的问题造成青稞β-葡聚糖在护肤品中的应用及大生产存在局限，如何开发适用于工业化大生产的青稞β-葡聚糖的制备方法、提高青稞β-葡聚糖的提取率以及如何开发更适宜应用于护肤品中的青稞β-葡聚糖产物，是亟待解决的技术问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种青稞β-葡聚糖提取物的制备方法。本发明青稞β-葡聚糖提取物的制备方法既提高了青稞β-葡聚糖的提取率，更适用于工业化生产，又提升了β-葡聚糖提取产物的稳定性，使其满足护肤品对原料的稳定性需求。本发明的另一目的在于提出一种利用上述方法制备得到的青稞β-葡聚糖提取物。本发明第三目的在于提出上述β-葡聚糖提取物在护肤制剂中的应用。为了实现上述目的，本发明采用如下具体技术方案：第一方面，本发明提供了一种青稞β-葡聚糖提取物的制备方法，包括以下步骤：（1）原料预处理：青稞50~70℃烘干，粉碎，过0.5~1.5mm孔径筛网；（2）酶法提取：预处理后的原料进行水提，料液比m/m为1：10~1：80，调节ph7~8，加入溶剂水量0.01~0.10wt%的脂肪酶，40~60℃反应1~5h，调节ph5~6，加入溶剂量0.01~0.10wt%的果胶酶，50~60℃反应1~5h；（3）粗滤：固液分离得粗滤液。青稞β-葡聚糖提取物制备工艺中酶的种类及组合、酶的加入顺序、料液比等对青稞β-葡聚糖的提取率、料液得率以及稳定性具有较大影响，发明人经过反复的试验和研究得到上述制备工艺。在本发明的提取步骤（2）中，料液比为1：10~1：80，例如可以是1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19、1：20、1：21、1：22、1：23、1：24、1：25、1：26、1：27、1：28、1：29、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：44、1：45、1：46、1：47、1：48、1：49、1：50、1：51、1：52、1：53、1：54、1：55、1：56、1：57、1：58、1：59、1：60、1：61、1：62、1：63、1：64、1：65、1：66、1：67、1：68、1：69、1：70、1：71、1：72、1：73、1：74、1：75、1：76、1：77、1：78、1：79、1：80，以及上述数值之间的点值。优选的，料液比为1：10~1：30，更优选为1：15。步骤（2）中先加入脂肪酶，再加入果胶酶。脂肪酶的用量为所加入溶剂水的用量的0.01~0.10wt%。例如可以是0.01wt%、0.02wt%、0.03wt%、0.04wt%、0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.10wt%，以及上述数值之间的点值。优选的，脂肪酶的用量为0.05%。果胶酶的用量为所加入溶剂水的用量的0.01~0.10wt%。例如可以是0.01wt%、0.02wt%、0.03wt%、0.04wt%、0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.10wt%，以及上述数值之间的点值。优选的，果胶酶的用量为0.05%。步骤（3）采用本领域常规的固液分离方法都可以实现。优选的，步骤（3）中过滤采用装有15~25μm孔径滤纸板的板框过滤。进一步的，为提高提取物的稳定性，使所得产品更适宜应用于化妆品中，青稞β-葡聚糖提取物制备过程还包括以下步骤：（1）除淀粉、脱色：向粗滤液中加入溶剂水量0.02~0.05wt%的α-耐高温淀粉酶，80~90℃反应5~15min，再加入粗滤液重量百分比为1~3%的活性炭，80~100℃脱色0.5~1h，采用装有0.3~0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；（2）脱盐：将脱色液以1-5t/h流速依次通过阳离子树脂001×7、阴离子树脂d309。控制电导率≤200μs/cm，收集脱盐溶液；（3）浓缩：50~80℃，真空度-0.04~-0.1mpa，浓缩终点为固含量≥3.0%；（4）精滤：采用装有0.3~0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，得精滤液，即得。淀粉的去除方式，如酶的种类、酶的加入时间、酶的用量等对于青稞β-葡聚糖的提取率及其稳定性、工业化生产中的过滤难度具有较大的影响。发明人意外的发现，α-高温淀粉酶的加入既能保障青稞β-葡聚糖的提取率，又可以达到有效去除淀粉、提高提取产物稳定性的效果。发明人对淀粉酶的添加时间和添加量进行研究发现，α-高温淀粉酶较佳添加量为0.02~0.05wt%，例如可以是0.02wt%、0.03wt%、0.04wt%、0.05wt%，以及上述数值之间的点值，优选的，α-高温淀粉酶的添加量为0.02wt%。更优选的，α-高温淀粉酶在提取过程结束后加入，在保障淀粉去除效果的同时，可以降低β-葡聚糖损失率。另一方面，本发明提供了上述制备工艺得到的青稞β-葡聚糖提取物。再一方面，本发明提供了所述青稞β-葡聚糖提取物在护肤制剂的中的应用。经安全性、稳定性及功效性评价试验证实，本发明制备得到的青稞β-葡聚糖提取物安全性及稳定性良好，且具有良好的清除自由基、防辐射功效，可以广泛的应用于护肤品中。所述护肤制剂由本发明制备青稞β-葡聚糖及其常规辅料组成，所述护肤制剂的剂型可以是护肤水、乳液、膏霜、啫喱、喷雾剂等。本发明又一方面，提供了一种护肤制剂。该护肤制剂由以下组分组成：a相水to100卡波姆0.50~1.00wt%b相水5.00~12.00wt%透明质酸钠0.02~0.08wt%甘油1.00~5.00wt%c相edta二钠0.01~0.05wt%d相氢氧化钠1.50~2.50wt%e相本发明青稞β-葡聚糖提取物2.00～20.00wt%f相甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.05~1.00wt%苯氧乙醇/乙基己基甘油0.2~0.50wt%。本发明另一方面提供了上述护肤制剂的制备工艺，该制备工艺包括以下步骤：（1）将d相氢氧化钠配制成10%的水溶液；（2）a相卡波姆加入快速搅拌的水中，搅拌水合；（3）b相透明质酸钠加入到甘油中搅拌均匀后，加水；（4）将b相、c相加入到a相中搅拌至溶解；（5）加入d相原料，调节ph值为6.0-6.8，搅拌；（6）加入e相原料，搅拌；（7）加入f相原料，搅拌；（8）过滤出料。本发明的有益效果为：本发明所述青稞β-葡聚糖提取物的制备工艺可显著提高β-葡聚糖的提取率，易于实现工业化大生产，且所得产物稳定性强、具有良好的清除自由基及防辐射功效，可广泛应用于护肤品中。附图说明图1为abts自由基清除率结果图。具体实施方式为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。所述涉及到的仪器设备也是本领域的技术人员公知且能够掌握和运用的设备。本案具体实施方式中使用原料及设备购买厂家见表1和表2。表1本发明使用原料及来源表2本发明使用仪器本发明青稞β-葡聚糖测定方法：刚果红法；本发明料液得率的计算方法为：料液得率=某工序后得到的溶液质量或体积/投料溶剂质量或体积×100%；本发明青稞β-葡聚糖提取率计算公式：β-葡聚糖提取率=×10-3×100%；注：c为从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，mg/ml；v为所得样品溶液体积，ml；m为样品除去水分后的质量，g。实施例1青稞β-葡聚糖提取物制备（1）原料预处理：青稞50℃烘干，粉碎，过0.5mm孔径筛网，备用；（2）酶法提取：预处理后的原料进行水提，料液比m/m为1：15，调节ph7.5，加入投入水量的0.05wt%脂肪酶，50℃反应1h，调节ph5.5，加入投入水量的0.05wt%果胶酶，50℃反应1h；（3）粗滤：采用装有15μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集得到粗滤液；（4）除淀粉、脱色：向粗滤液中加入重量百分比为0.02%的α-耐高温淀粉酶，85℃反应10min，再加入粗滤液重量百分比为2%活性炭，升温至95℃脱色1h，采用装有0.3μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；（5）脱盐：将脱色液以3t/h流速依次通过阳离子树脂001×7，再通过阴离子树脂d309。控制电导率≤200μs/cm，收集脱盐溶液；（6）浓缩：70℃，真空度-0.08mpa，浓缩终点为固含量≥3.0wt%；（7）精滤：采用装有0.3μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，即得。实施例2青稞β-葡聚糖提取物制备（1）原料预处理：青稞70℃烘干，粉碎，过1.5mm孔径筛网，备用；（2）酶法提取：预处理后的原料进行水提，料液比m/m为1：30，调节ph7，加入投入溶剂量的0.01wt%脂肪酶，60℃反应3h，调节ph5.0，加入投入溶剂量的0.10wt%果胶酶，55℃反应3h；（3）粗滤：采用装有25μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集得到粗滤液；（4）除淀粉、脱色：向粗滤液中加入重量百分比为0.05%的α-耐高温淀粉酶，90℃反应5min，再加入粗滤液质量百分比为3%活性炭，升温至100℃脱色1h，采用装有0.4μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；（5）脱盐：将脱色液以5t/h流速依次通过阳离子树脂001×7，再通过阴离子树脂d309。控制电导率≤200μs/cm，收集脱盐溶液；（6）浓缩：50℃，真空度-0.04mpa，浓缩终点为固含量≥3.0wt%；（7）精滤：采用装有0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，即得。实施例3青稞-β葡聚糖提取物制备（1）原料预处理：青稞60℃烘干，粉碎，过1.0mm孔径筛网，备用；（2）酶法提取：预处理后的原料进行水提，料液比m/m为1：10，调节ph8，加入投入溶剂量的0.10wt%脂肪酶，40℃反应5h，调节ph6.0，加入投入溶剂量的0.01wt%果胶酶，60℃反应5h；（3）粗滤：采用装有20μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集得到粗滤液；（4）除淀粉、脱色：向粗滤液中加入重量百分比为0.03%的α-耐高温淀粉酶，80℃反应15min，再加入粗滤液质量百分比为1%活性炭，升温至80℃脱色0.5h，采用装有0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；（5）脱盐：将脱色液以1t/h流速依次通过阳离子树脂001×7，再通过阴离子树脂d309。控制电导率≤200μs/cm，收集脱盐溶液；（6）浓缩：80℃，真空度-0.1mpa，浓缩终点为固含量≥3.0wt%；（7）精滤：采用装有0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，即得。经检测实施例1-3青稞β-葡聚糖的提取率分别为5.30%、5.15%、4.98%。实施例4-6啫喱制剂制备实施例4-6啫喱制剂组成见下表：其中，实施例4采用实施例1制备β-葡聚糖提取物，实施例5采用实施例2制备β-葡聚糖提取物，实施例6采用实施例3制备β-葡聚糖提取物。啫喱制剂制备工艺如下：（1）预先准备：将d相氢氧化钠提前配制成10%的水溶液；（2）a相将卡波姆加入快速搅拌的水中，快速搅拌使卡波姆完全水合；（3）b相透明质酸钠加入到甘油中搅拌均匀后，缓慢加入水，搅拌均匀；（4）将b相和c相加入到a相中搅拌至完全溶解；（5）加入d项原料，中和至ph值为6.0-6.8，搅拌均匀；（6）加入e相原料，搅拌；（7）加入f相原料，搅拌均匀；（8）过滤出料。对比例1-13：实验条件及实验结果见表3为提高β-葡聚糖的提取率，并同时保障所得产品的稳定性，发明人对青稞β-葡聚糖的制备工艺进行了反复的对比研究，并观测了不同试验条件下的β-葡聚糖得率、料液得率以及稳定性观测结果。下述对比例中青稞原料预处理条件及其他未经特殊说明的制备过程同实施例1，实验结果见表3。对比例1~3研究了现有技术中水提方法的提取效果：以纯水为溶剂（料液比m/m为1：15），控制ph值为5.5，在50℃条件下，料液得率可达69.5%，提取物中β-葡聚糖含量为2.86mg/ml，提取率为3.0%；在70℃条件下，料液得率仅为16.7%，β-葡聚糖含量为2.90mg/ml，提取率为0.7%；在90℃条件下，β-葡聚糖含量为3.38mg/ml，提取率为0.8%，远远低于本发明提取率。稳定性观察结果显示，纯水提取所得提取物高温条件下均变浑浊，热稳定性差，不适宜应用于护肤品中。对比例4研究了在碱性条件下提取效果：控制ph值为10.5，在50℃条件下提取2h，提取物中β-葡聚糖含量为1.30mg/ml，料液得率和提取率均很低，高温条件下出现浑浊，热稳定性较差。可见，碱水提取工艺不能满足产品工艺要求，提取率较低，提取物稳定性差，不适宜应用于护肤品中。青稞中还含有淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素等，本发明另外研究了不同酶处理下青稞β-葡聚糖的制备工艺。对比例5、6研究了淀粉酶对提取效果的影响，尝试在低于淀粉糊化温度条件下采用淀粉酶除去提取物中淀粉，分别选取了普鲁兰酶、中温淀粉酶，结果发现均能有效的除去淀粉，但提取物中β-葡聚糖未检出，可见，并不是所有淀粉酶都适宜应用于青稞β-葡聚糖的制备。对比例7、8分别研究对比了木聚糖酶、纤维素酶对提取效果的影响，结果发现木聚糖酶提取率有所提升，但样品溶液热稳定性差；纤维素酶亦能提高料液得率，但提取物中β-葡聚含量未检出。对比例9-11研究了不同蛋白酶对提取效果的影响，复合蛋白酶、中性蛋白酶提取后提取物中β-葡聚糖含量非常低；碱性蛋白酶料液得率61.8%，β-葡聚糖提取率仅为2.6%。对比例12、13分别研究了果胶酶、脂肪酶对提取效果的影响，果胶酶试验结果显示，料液得率70%，提取率为3.1%；脂肪酶提取，料液得率仅为33.3%，β-葡聚糖提取率1.2%，样品稳定性差，脂肪酶提取效果不佳。表3不同工艺条件提取效果比较注：样品高温稳定性考察的是最终成品样品的稳定性，高温稳定考察条件为95℃保温30min。上述结果表明，传统的纯水浸提法最终样品热稳定性差，产品在护肤品中的应用性不佳；单一酶法也不能同时保障料液得率以及β-葡聚糖提取率和热稳定性。发明人继续对复合酶法提取工艺进行了研究和优化。对比例14-17下述对比例中青稞原料预处理条件及其他未经特殊说明的制备过程同实施例1。从表4中结果可知，对比例14所示木聚糖酶+果胶酶组合，料液得率可达81.7%，样品稳定性好，但β-葡聚糖提取率仅为1.1%；对比例15、16研究了不同试验条件下，果胶酶+脂肪酶+碱性蛋白酶组合的提取效果：对比例15试验条件下β-葡聚糖提取率为4.2%，料液得率为76.7%。对比例16试验条件：先添加0.05%果胶酶，控制ph5.5，50℃，提取1h，加入0.05%脂肪酶，控制ph7.6，50℃，提取1h，再加入0.1%碱性蛋白酶，控制ph10.5，50℃，提取1h；最后，升温至70℃，提取1h，试验结果显示，提取物中β-葡聚糖含量可达4.13mg/ml，但料液得率较低，仅为38.3%，分析原因可能是，分段酶处理后，高温提取，能够增加提取物中β-葡聚糖含量，但料液中淀粉糊化，大大降低料液得率，同时也加大了固液分离难度。对比例17为购于杭州某食品公司的青稞β-葡聚糖粉末，β-葡聚糖含量为40%，将其配置成1%水溶液，溶液不透亮，大量不溶物，95℃处理30min，亦有大量不溶物，溶液浑浊，将其过滤后测得过滤液β-葡聚糖含量2.18mg/ml，产品水溶性差，不满足护肤品要求。脂肪酶+果胶酶组合提取，料液得率和提取率分别为82.5%、5.3%，均明显提升，与果胶酶+脂肪酶+碱性蛋白酶组合相比，提取率提高了1.1%，提取时间缩短。复合酶提取提取率大小依次为：脂肪酶+果胶酶＞果胶酶+脂肪酶+碱性蛋白酶＞木聚糖酶+果胶酶（减效）。因此本发明优选脂肪酶+果胶酶组合提取β-葡聚糖。表4酶组合工艺条件提取效果比较除淀粉工艺优化由于提取物中含有大量淀粉，不利于提取物的稳定性，提取过程中除去淀粉试验显示，普鲁兰酶、中温淀粉酶均能除去提取物中淀粉，但同时也使提取物中β-葡聚糖含量损失殆尽，因此不能选取普鲁兰酶、中温淀粉酶除去淀粉。α-耐高温淀粉酶在高温条件下（80~90℃）具有较好除去淀粉能力，发明人发现不同工序阶段加入α-耐高温淀粉酶对除淀粉效果和对β-葡聚糖具有较大影响。按如实施例1所述的提取工艺进行提取，并分别在不同阶段加入α-耐高温淀粉酶1）提取过程中加入：果胶酶反应结束，加入0.02%（以提取时加入纯水量计算）α-耐高温淀粉酶85℃反应10min；2）提取完成后加入：固液分离后，向所得提取物中加入0.02%（以所得提取物的量计算）α-耐高温淀粉酶85℃反应10min。采用碘液反应测定淀粉除去效果，从表5中结果可知，提取过程中加入0.02%α-耐高温淀粉酶，淀粉未除尽，且有高温过程，不利于后续工序中料液的固液分离，β-葡聚糖损失率为39.0%，提取完成后加入0.02%α-耐高温淀粉酶，淀粉除尽，高温过程不影响后续工序中的固液分离，β-葡聚糖损失率为仅为14.7%，损失率减少了24.3%。优选在提取完成后加入α-耐高温淀粉酶。表5α-耐高温淀粉加入方式对提取率的影响脱色脱盐提取物的中含有大量离子（电导率高），颜色较深，为满足护肤品的市场需求，采用活性炭脱色。阴阳离子树脂脱盐，具体为将脱色后提取物保持温度40~45℃，以1~2t/h流速依次通过阳离子树脂001×7，再通过阴离子树脂d309，收集脱盐溶液并控制电导率≤200μs/cm。表6中数据显示，脱色前后相比色度值降低了160pcu，去除率约为57.1%，脱色效果能达到产品要求。提取物中含有大量盐离子，电导率高，必须除去提取物中大部分盐分，以保证产品的稳定性和在护肤品中的适用性，从表6中数据可知，脱盐前电导率为3130μs/cm，脱盐后仅为193μs/cm，盐分除去率达93.8%，而β-葡聚糖损失率仅为1.8%。对脱色前、脱色后（脱盐前）、脱盐后所得提取物在95℃条件下处理30min，观察提取物是否变浑浊，结果显示仅脱盐后样品不变浑浊，热稳定性好。即脱盐工序除去了93.8%的盐分，保留了98.2%的β-葡聚糖，提高了产品的稳定性。表6脱色脱盐工序理化指标比较青稞β-葡聚糖分子量测试采用凝胶色谱（waterse2695示差折光检测器waters2414refractiveindexdetector和十八角度激光光散射检测器（wyattdawnheleos-ii）对青稞样品检测，青稞β-葡聚糖平均分子量约为28万。表7青稞β-葡聚糖凝胶色谱结果样品稳定性考察护肤品中对所添加的提取物稳定性有非常高的要求，尤其是产品外观性能，如澄清度、颜色、气味等在不同环境下始终要求长期保持高稳定性。稳定性考察方法：将实施例1所得制备样品（添加12wt%甘油和0.9wt%pehg，90~100℃搅拌灭菌40min）用100ml样品瓶盛装，盛装量不少于80ml，贴好样品信息标签。考察条件分别为：日常环境（把样品瓶放入室温未避光环境下）、暗环境（把样品瓶放入室温避光环境中）、冷藏环境（把样品瓶放入4±1℃冰箱中）、光照环境（把样品瓶放入28±1℃光照培养箱）、热环境为（样品瓶放入45±1℃不透光烘箱中）。定期对各个样品进行观测，记录观测结果。稳定性数据见表8。日常环境、暗条件、冷条件样品样品观测数据显示，6个月内均为澄清透亮，无沉淀产生，颜色气味无明显变化，浊度均小于5fnu；色度值显示，热条件变化较大，上升了120pcu，样品颜色在可接受的范围内，其余条件色度值变化不明显。其他理化指标变化均不明显，β-葡聚糖含量也能稳定保存。本发明制备得到的青稞β-葡聚糖提取物稳定性好，暗、冷、光、日常条件下6个月内各项指标无明显变化，可以在室温条件下长时间保存，热条件下颜色会加深，但半年内在可接受范围内，运输过程中可能面临的高温天气，也能保证产品质量。发明人用本发明其它实施例重复同样的实验，得到相同的结论。表8青稞β-葡聚糖稳定性观测数据功效及安全评价uvb角质形成细胞保护试验（1）制备细胞悬液：取角质形成细胞对数生长期细胞消化后接种至6孔板；（2）将实施例1所得青稞β-葡聚糖提取物，采用冷冻干燥法制备青稞β-葡聚糖冻干粉，试验时，现配成0.031%、0.063%、0.125%青稞β-葡聚糖溶液，分别用s1、s2、s3表示，备用；（3）待细胞铺板率达到40%时进行给药。给药完成后将培养板放置在37℃、5%的co2培养箱中继续培养24h；（4）辐照：按实验设计（表9）对有uvb刺激条件的组别进行uvb辐照（辐照剂量为300mj/cm2），之后将所有组别的孔中液体均更换为新鲜的角质形成细胞培养液。37℃，5%co2继续培养；（5）检测：分别继续培养24h，弃掉上清，加入2ml事先配好的mtt工作液，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加1.5ml二甲基亚砜，酶标仪490nm读取od值。计算公式：细胞活力=（给药孔od-调零孔od）/（对照孔od-调零孔od）×100%。表9细胞活力检测实验设计检测结果如表10所示。与bc组相比，nc组在uvb辐照后，细胞活力显著下降（p＜0.05），提示造模成功；与nc组相比，青稞β-葡聚糖样品浓度为0.063%的给药浓度下，细胞活力显著提高（p＜0.05）；在0.031%、0.125%给药浓度下，细胞活力提高。说明青稞β-葡聚糖具有防晒作用，能抗紫外线伤害。发明人用本发明其它实施例制备得到的青稞β-葡聚糖提取物重复同样的实验，得到相同的结论。表10相对活力值汇总表abts清除自由基试验：样品来源分别为实施例1所得青稞β-葡聚糖提取物，用30%乙醇分别稀释成20%，10%，5%浓度样品。将一定量的7mmol/labts和140mmol/lk2s2o混合，置于暗处反应一段时间后，形成abts自由基储备液。取一定量的abts自由基储备液，用30%乙醇进行稀释，使最终测试的阴性对照吸光值在在734nm下为0.70±0.02。按照表11中各种试剂添加量配置反应体系，摇匀，在724nm波长处测定吸光值。表11反应体系添加试剂受试样品（ml）30%乙醇（ml）反应液（ml）样品组0.50.00.5阴性对照0.00.50.5空白对照0.50.50.0以下公式计算清除率（clearancerate，cr），自由基清除率如图1。cr(%)=[1－（od受试样品-od空白对照）/od阴性对照]×100从图1中结果可知，青稞β-葡聚糖具有一定的abts自由基清除能力，添加浓度越大清除能力越强。样品浓度为20%（青稞β-葡聚糖含量约为0.15%），清除率可达54%（s1：样品浓度为20%，s2：样品浓度为10%，s3：样品浓度为5%）。发明人用本发明其它实施例制备得到的青稞β-葡聚糖提取物重复同样的实验，得到相同的结论。安全评价试验：对实施例1所得提取物（添加12wt%甘油和0.9wt%pehg，90~100℃搅拌灭菌40min）进行多次皮肤刺激、鸡胚het-cam、光毒3t3试验、人体斑贴等安全性试验。试验中青稞β-葡聚糖提取物样品浓度均为20%。通过相关安全试验评估，以保证产品的安全性。多次皮肤刺激：采用豚鼠涂抹方式考察豚鼠皮肤红斑、水肿情况。方法参照《化妆品安全技术规范》（2015版），第六章第4节，皮肤刺激性/腐蚀性试验。多次皮肤刺激试验结果见表12：受试样品对豚鼠未表现出刺激反应。表12多次皮肤刺激试验结果光毒3t3：本试验的目的是测试受试物在uva照射下产生的毒性改变细胞活力的能力，描述了评价被估物质潜在光毒性要素和过程。方法参照《化妆品安全技术规范》（2015版），第六章第18节，护肤品用化学原料体外3t3中性红摄取光毒性试验方法和oecdguidelinesfortestingofchemicals.no.432:invitro3t3nruphototoxicity[s],2004.体外3t3中性红摄取光毒性试验结果：溶剂对照的od540数值均大于0.4；阳性对照ic50（+uv）=1.0317μg/ml，ic50（–uv）=57.051μg/ml，pif=56.013，mpe=0.802。均符合oecd的标准，体系成立。受试样品在无光照及光照条件下的ic50均大于1000.0μg/ml，pif值均为*1，mpe值均小于0.1。根据试验评价标准，受试样品预期无光毒性，具体结果见表13。表13体外3t3中性红摄取光毒性试验结果注：*1：在达到允许的最高浓度值（1000.0μg/ml）也不表现细胞毒性；+：预期存在光毒性；–：预期无光毒性。het-cam鸡胚绒毛尿囊膜试验:本试验的目的是测试受试物引起鸡胚绒毛尿囊膜毒性变化的能力，描述了评价被评估物质潜在的眼刺激性的要素和过程。方法参照eurl-ecvamdb-almmethodsummaryn°96:hen'seggtestonthechorioallantoicmembrane(het-cam)。het-cam鸡胚绒毛尿囊膜试验结果：het-cam鸡胚绒毛尿囊膜试验结果显示受试样品无刺激，具体结果见表14。表14het-cam鸡胚绒毛尿囊膜试验结果样品名称es试验结果青稞β-葡聚糖提取物（20%）3无刺激注：es≤6表示无刺激；6＜es≤12表示轻度刺激；12＜es＜16表示中度刺激；es≥16强刺激性/腐蚀性人体封闭式斑贴试验：方法参照：《化妆品安全技术规范》（2015版），第七章第2节，人体皮肤封闭型斑贴试验方法。以实施例4所得青稞β-葡聚糖啫喱为试验组样品，同时以不添加青稞β-葡聚糖的啫喱基质为对照组。人体封闭式斑贴试验结果：根据《护肤品卫生规范（2007版）》的结果解释，受试样品均对人体皮肤无不良反应。具体结果见表15。表15不同时间点测试结果汇总注：阴性反应，评分等级0；可疑反应；仅有微弱红斑，评分等级1；弱阳性反应：红斑、浸润、水肿、可有丘疹，评分等级2；强阳性反应：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；反应可超出受试区，评分等级3；极强阳性反应：明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区，评分等级4。安全性试验结果：受试样品多次皮肤刺激未表现出刺激反应，体外3t3中性红摄取光毒性试验表现为无光毒，het-cam鸡胚绒毛尿囊膜试验显示无刺激，人体封闭式斑贴试验显示对人体皮肤无不良反应。即制备的青稞β-葡聚糖提取物是安全的，满足护肤品中安全要求。当前第1页12