一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种特异性引物及鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用。

背景技术：

红铃虫甲腹茧蜂chelonuspectinophorae(cushman)为一种跨卵-幼虫期寄生蜂，其寄主除了红铃虫pectinophoragassypiella(saunders)，还包括鼎点金刚钻eariascupreoviridis(walker)、甘蔗小卷蛾argyroploceschistaceana(snellen)、棉大卷叶螟syleptaderogata(fabricius)、大豆食心虫leguminivoraglycinivorella(matsumura)等大量鳞翅目害虫，是一种非常具有潜力的天敌昆虫。该寄生蜂在我国湖北、安徽、河南、四川、江苏、浙江、江西及台湾等地区均有分布。

在寄生蜂人工繁殖中，寄生率和孵化率是十分重要的指标，常常被用以评价该寄生蜂商品价值的高低。通常，会采用该寄生蜂后代的啮出数量、结茧或出蜂数量作为其产卵能力的评判依据。但和大多卵寄生蜂一样，红铃虫甲腹茧蜂对中间寄主红铃虫进行产卵后，其孵化的幼虫还需继续在中间寄主红铃虫体内进行取食，发育到一定阶段才从红铃虫寄主体内啮出，继而化茧。在这一系列生长发育过程中，甲腹茧蜂后代生长进程受中间寄主所在的环境温度、湿度、光照及食物等条件影响较大。因此，选用寄生蜂啮出率、化茧率及出蜂率作为卵寄生蜂红铃虫甲腹茧蜂寄生能力的评判依据，在一定程度上并不能真正反映其真实的控害能力。为了评价红铃虫甲腹茧蜂对红铃虫的控害潜能，选择一种操作简便、科学有效的分子检测技术用于鉴定卵寄生蜂对寄主的寄生能力则显得必要和实用。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性引物，以及提供一种快速鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用。

为了实现本发明的目的，发明人首次提出针对甲腹茧蜂dead-box家族pl10基因，设计了特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-2，对不同处理的红铃虫卵dna样本进行扩增检测，发现只有在被甲腹茧蜂寄生处理过的红铃虫dna样本中才能扩增出pl10基因的目的条带。具体地，本发明的技术方案概括如下：

两对特异性引物，所述的特异性引物包括pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-，其中pg-pl10-f2的序列如seqidno:1所示，pg-pl10-r2-1的序列如seqidno:2所示，pg-pl10-r2-3的序列如seqidno:3所示。

从本发明的研究结果来看，利用上述特异性引物扩增pl10基因，可实现对红铃虫甲腹茧蜂进行种类鉴定，进而用来判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况。在统计卵寄生蜂寄生率方面，避免了卵寄生蜂后代受寄主自身条件、食物等条件影响，导致统计出蜂情况与寄生率不符的情况发生。因此进一步地，本发明还提供了上述的特异性引物在检测红铃虫是否被甲腹茧蜂寄生或/和甲腹茧蜂的产卵量中的应用。

另外，本发明还提供了一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，该方法包括利用上述的特异性引物对红铃虫卵dna进行pcr扩增，通过检测是否得到扩增产物，判断红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生。

进一步优选地，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其具体包括如下步骤：

(1)提取红铃虫卵组织中全部dna；

(2)以步骤(1)所得dna为模板，利用上述的特异性引物，进行pcr扩增反应；

(3)取pcr反应扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(4)根据电泳条带中是否出现甲腹茧蜂pl10基因片段的特征条带，判断红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生。

在本发明最优选的实施方式中，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其特征在于，所述pcr反应的反应条件为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；分别在60℃下，退火30s；72℃，延伸30s；循环35个，72℃延伸10min。

在本发明最优选的实施方式中，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其特征在于，所述pcr反应的反应体系：10×extaqbuffer2.5μl，2.5mmdntps2μl，extaq酶0.125μl，正反引物各1μl，dna1.5μl或cdna1.5μl，补充ddh2o至25μl。

由于利用上述特异性引物可实现判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况，因此本发明还提供了一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性引物。进一步优选地，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的试剂盒，其还包括dntps、taqdna聚合酶、pcr反应缓冲液。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著的进步：

(1)本发明基于甲腹茧蜂和红铃虫的pl10片段序列差异，设计出可快速、准确检测甲腹茧蜂寄生的特异性引物，并在此基础上建立了pcr检测体系，可从田间红铃虫卵快速、准确地检测出甲腹茧蜂是否寄生。

(2)本发明首次提出利用甲腹茧蜂pl10基因的dna条形编码对红铃虫甲腹茧蜂进行种类鉴定，进而用来判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况。

(3)本发明在统计卵寄生蜂寄生率方面，避免了卵寄生蜂后代受寄主自身条件、食物等条件影响，导致统计出蜂情况与寄生率不符的情况发生，有利于实现快速准确统计寄生蜂寄生田间红铃虫卵的寄生率。这种检测方法具有方便、快捷、经济、准确等优点。

附图说明

图1：兼并引物pg-v-f、pg-v-r1对甲腹茧蜂模板扩增情况；其中m：marker(dl2000),1-3：甲腹茧蜂dna，4-6：甲腹茧蜂cdna,7-8：空白对照。

图2：兼并引物pg-v-f、pg-v-r2对甲腹茧蜂模板扩增情况；其中m：marker(dl2000),1-3：甲腹茧蜂dna，4-6：甲腹茧蜂cdna,7-8：空白对照。

图3：兼并引物对红铃虫模板扩增情况；其中m：marker(dl2000)，1-7为利用兼并引物pg-v-f、pg-v-r1的扩增情况(1-3：红铃虫dna，4-6：红铃虫cdna,7：空白对照)，8-14为利用兼并引物pg-v-f、pg-v-r2的扩增情况(1-3：红铃虫dna，4-6：红铃虫cdna,7：空白对照)；

图4：甲腹茧蜂pl10基因扩增特异性引物筛选情况；其中m：marker(dl2000),1--6：pg-pl10-f1和pg-pl10-r1-1(1-3为甲腹茧蜂，4--6为红铃虫，三个孔依次为52℃、55℃、58℃下产物，下同)；7--12：pg-pl10-f1和pg-pl10-r1-2(7-9为甲腹茧蜂，10--12为红铃虫)；13--18：pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1(13-15为甲腹茧蜂，16--18为红铃虫)19--24：pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-2(19-21为甲腹茧蜂，22--24为红铃虫)。

图5：对甲腹茧蜂寄生处理的红铃虫卵进行检测(红铃虫卵action基因扩增情况)；其中m：marker(dl2000),1-4：甲腹茧蜂寄生的单头红铃虫卵，5-8：甲腹茧蜂未寄生的单头红铃虫卵，9：空白对照。

图6：特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1对红铃虫卵pl10基因扩增情况；其中m：marker(dl2000),1-4：甲腹茧蜂寄生的单头红铃虫卵，5-8：甲腹茧蜂未寄生的单头红铃虫卵，9：空白对照。

图7：特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-2对红铃虫卵pl10基因扩增情况；其中m：marker(dl2000),1-4：甲腹茧蜂寄生的单头红铃虫卵，5-8：甲腹茧蜂未寄生的单头红铃虫卵，9：空白对照。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例一：甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测试验

1、试验材料

棉红铃虫pectinophoragossypiella(saunders)于2003年9月底采自湖北省潜江市棉田，在实验室内人工继代饲养至今。

红铃虫甲腹茧蜂于2013年从湖北天门、湖南安乡、安徽安庆3个棉区采集滞育红铃虫幼虫，发现该种寄生蜂，并在实验室内建立种群。成虫用5％蜂蜜水补充营养，产卵条件为温度(28±1)℃，相对湿度60％～80％，光周期13l:11d。

2、试验方法

2.1使用兼并引物对红铃虫、甲腹茧蜂dead-box基因扩增

2.1.1甲腹茧蜂和红铃虫dna、rna提取

dna提取按照血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，dp304)说明书进行。

总rna提取采用trizol法，提取试剂盒购自invitrogen。反转录参考promega公司的reversetranscriptionsystem试剂盒说明书进行。

2.1.2甲腹茧蜂目的片段扩增

根据已报到的果蝇等物种的dead-box家族基因cdna序列，选择保守性高的位点设计2对兼并引物，分别为pg-v-f和pg-v-r1，pg-v-f和pg-v-r2，引物序列见表1。

反应体系：10×taqbuffer2.5μl，dntpmix(2.5mmol·l-1each)2μl，taq酶0.125μl，正反引物各1μl，dna2μl或cdna1μl，补充ddh2o至25μl。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35个，最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

表1：dead-box家族基因兼并引物

扩增结果显示：

利用引物pg-v-f、pg-v-r1对甲腹茧蜂dna及cdna进行扩增，其产物经凝胶电泳检测显示，甲腹茧蜂dna(1、2、3)cdna(4、5、6)都能扩增出预期的目的条带，片段大小基本一致(400bp左右)(图1)。

同样，利用引物pg-v-f和pg-v-r2对甲腹茧蜂dna及cdna进行扩增，其产物经凝胶电泳检测显示，甲腹茧蜂dna(1、2、3)cdna(4、5、6)也都可以扩增出预期的目的条带，片段大小基本一致(400bp左右)(图2)。

利用gelextractionkit凝胶回收试剂盒对目的条带进行回收，纯化产物连接t-easy克隆载体，转入dh5α感受态细胞，涂布到含有amp+抗性的lb固体培养基培育过夜。挑取白色单菌落，放入到含有amp+抗性的lb液体培养基中，37℃，200r/min培养12h。再进行菌液pcr验证，将检测含有目的条带的样品送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

根据测序结果，利用美国国家生物技术信息中心(ncbi)的blastx程序搜索序列同源相似性，其结果如下：

测序结果1：(未登录)

比对分析为atp-dependentrnahelicasepll0基因，片段大小为398bp。

atggcatgcgcgcaaacaggctcaggtaaaacagcggcatttttggtgccaatattaaatcagatttatgaaagcggtccacgtgcacctccaccacaagctggtagtggaagacgcaaacaataccctttgggcttagttttagctccaacacgagaattagcaacacaaatctacgatgaagcacgtaaatttgcttatcgatctcgtatgcgacctgcagttgtctatggtggatcaaatattgccgatcaaatgcgtgaacttgatcgtggatgtcatttattggttgctacacctggtcgacttgtggatatgcttggccgtggtaaaataggactacacaattgtcgatttttagttctagatgaggctgatcggatgttggatatgggttt

测序结果2：(未登录)

比对分析为vasa基因，片段大小为383bp。

aagcccatgtccagcatactgtccgcctcgtccagcacgaagaagcgaatggacgagaacgtgacgcgacctcgatttacgaaatcgttaagccggccaggagtggcgaccagaatatggcagcctttcattagcgtattcgcctgatggaatgacgccgtgcctccgtaagcgatgcagatcttcagtatgctcccatgagcaaacttccgggcctcgttgaagatctgaatagctaattctcgagtagggctgaggattataacttgcggttcaacaccggattcgtgtatgatggcatcttgaggtttgtcaagaattgtgttgatcataggcaccaaaaaagcagcagtttttcctgatcctgtttgtgcgcaggccat

对测序结果进行序列比对发现，无论是甲腹茧蜂dna还是cdna，其测序结果大部分为测序结果1。这在一定程度上说明，相对vasa基因(测序结果2)，pl10基因(测序结果1)所在组织中的分布和表达量较为稳定。故初步选择pl10作为下一步试验的靶标基因。

2.1.3扩增红铃虫目的基因片段

利用兼并引物pg-v-f和pg-v-r1、pg-v-r2分别对红铃虫dna、cdna模板进行pcr扩增，扩增条件同2.1.2，其产物经凝胶电泳检测的结果见图3。

从图3中可以发现，兼并引物pg-v-f和pg-v-r1对红铃虫dna(1、2、3)、cdna(4、5、6)模板都可以扩增出预期的目的条带，其片段大小约为400bp。同样，利用pg-v-f和pg-v-r2对红铃虫dna(7、8、9)、cdna(10、11、12)模板也可以扩增出预期的目的条带，其片段大小约为400bp。对相应的目的条带进行胶回收，再经连接转化后，挑取目的克隆送于测序公司测序。其测序结果为：

测序结果3：(未登录)

比对分析为atp-dependentrnahelicaseddx53/ddx43，片段大小371bp。

atggcatgcgcacaaacaggcactggtaagacattagcttttcttcttcctgcattgattcacattgaagggcagactgtccctcgagatcaaagaaaaggtcccacagtgctcatcttggctccaacaagagaactggctttgcagattgataaagaagtatccaaatacagttacagaggaatcacttctgtttgcttgtatggaggaggagacaggaaggagcagattaaagttgtttccaaaggtgtggacatagtcattgcaacaccaggaagactcaatgatttaattatggcacggcatcttaacataatcaacttttcctacattgttcttgatgaagcagatcggatgttggacatgggttt

测序结果4：(未登录)

比对分析为atp-dependentrnahelicasepll0基因，片段大小392bp。

atggcatgcgcgcaaacaggctccgggaagactgccgcgttcctcgtccccatactcaaccagatgtacgaggctggacccgttaagcatatggggccgtacaaccgacgcaagcagtaccctctgggcttggttctagctccgacacgcgaactcgccacccaaatttatgacgaggctaggaaattcgcctaccgctcccgtgtgcgaccctgtgtcgtgtacggcggctccccgatacatgaacaattccgcgaactggagtgcgggtgccacctgctggtcgcgacgccgggccggctcgtggacatgctgtcccgcgggcgcgtggcgctcgaccactgccgccatcttgtgctcgacgaggccgatcggatgctagacatgggctt

2.2甲腹茧蜂pl10基因特异性引物筛选

利用dnamanversion6，对甲腹茧蜂、红铃虫pl10基因片段核苷酸序列进行同源比对分析，根据其序列差异，利用primer5.0设计甲腹茧蜂pl10特异性引物。分别设计了四组特异性引物pg-pl10-f1、pg-pl10-r1-1、pg-pl10-r1-2和pg-pl10-f2、pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-2(表2)。利用设计的上述引物分别对甲腹茧蜂、红铃虫dna样品进行扩增。

表2：甲腹茧蜂pl10基因扩增特异性引物

反应体系：2xestaqmastermix(dye)10μl，正、反引物各1μl，dna1μl，ddh2o7μl。反应条件：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；分别在52℃、55℃、58℃下，退火30s；72℃，延伸30s；循环35个，72℃延伸10min。

其扩增产物凝胶电泳检测结果显示：

利用pg-pl10-f1和pg-pl10-r1-1、pg-pl10-r1-2引物以及pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-2引物分别对甲腹茧蜂、红铃虫dna扩增pl10基因的电泳图见图4。从图4中可以看出，pg-pl10-f1和pg-pl10-r1-1、pg-pl10-r1-2引物对甲腹茧蜂样品(泳道1、2、3和7、8、9，三个孔依次为52℃、55℃、58℃下扩增产物，下同)都能扩增出单一的pl10基因片段，片段大小分别为200bp，但红铃虫样品(泳道4、5、6和泳道10、11、12)也能扩增出对应大小的目的条带，并有非特异性扩增条带，故该引物特异性不强，无法区分甲腹茧蜂红红铃虫dna样品。同样，利用pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-2引物对甲腹茧蜂样品(泳道13、14、15和泳道19、20、21)的扩增产物为单一条带，而红铃虫样品(泳道16、17、18和泳道22、23、24)未能扩增出对应大小的目的条带，仅有一条非特异条带，其片段大小与预期的目的片段大小差异较大。说明这两对引物在扩增甲腹茧蜂pl10基因时特异性较好，可以选择其作为甲腹茧蜂dna条形码检测。

2.3对甲腹茧蜂寄生处理的红铃虫卵检测

2.3.1红铃虫卵dna提取

红铃虫卵：按照animaldirectpcrkit试剂盒(美国herogenbiotech公司)说明书操作，挑取单粒被甲腹茧蜂寄生和未寄生的红铃虫卵，用无菌白色枪头压破后，吸取27ul裂解液a溶解处理的红铃虫卵组织物质，吸置于0.2mlpcr管中，95℃中处理15min，加入3ul溶液b，漩涡器混匀，-20℃备用。

2.3.2对红铃虫卵进行pl10基因检测

以红铃虫action作为看家基因，并根据其核酸序列设计acs1和acr1引物。引物情况具体见表3。

表3：甲腹茧蜂pl10基因检测相关引物

2.3.3对甲腹茧蜂寄生的红铃虫卵进行检测

随机取红铃虫甲腹茧蜂寄生处理过的红铃虫卵和未寄生处理的红铃虫卵各4粒，按照2.3.1方法进行dna提取。分别对红铃虫卵进行action基因、pl10基因扩增，其扩增产物凝胶电泳图见图5、图6和图7。图5的检测结果显示，寄生和未寄生的红铃虫卵dna提取效果较好，均可以扩增出红铃虫action内标基因。从图6中可以看出，特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1可以很好地区分红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生，其中，被甲腹茧蜂寄生过的红铃虫卵(1、2、3、4)样品可以扩增出预期的pl10基因片段，未寄生的红铃虫卵(5、6、7、8)则不能扩增出预期的片段。同样，从图7中可以看出，特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-2可以很好地区分红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生，其中，被甲腹茧蜂寄生过的红铃虫卵(1、2、3、4)样品可以扩增出预期的pl10基因片段，未寄生的红铃虫卵(5、6、7、8)则不能扩增出预期的片段。对特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-2扩增的pl10基因预期目的片段进行回收，经连接转化后送于测序公司进行序列分析。测序结果显示其基因片段大小为142bp和234bp，序列经美国国家生物技术信息中心(ncbi)的blastx程序搜索序列同源相似性，其结果均显示为pl10基因。

综上，本研究针对甲腹茧蜂dead-box家族pl10基因，设计了两对特异性引物pg-pl10-f2和pg-pl10-r2-1、pg-pl10-r2-2，分别对不同处理的红铃虫卵dna样本进行扩增检测，发现仅仅被甲腹茧蜂寄生处理过的红铃虫卵dna样品才可以扩增出pl10基因预期的目的片段。从研究的结果来看，利用pl10基因的dna条形编码可以对红铃虫甲腹茧蜂进行种类鉴定，进而用来判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况。在统计卵寄生蜂寄生率方面，避免了卵寄生蜂后代受中间寄主自身条件、食物等环境条件影响导致统计出蜂情况与寄生率不符的情况发生。这种检测方法具有方便、快捷、经济、准备等优点，具有一定的可行性。

序列表

<110>湖北省农业科学院植保土肥研究所

<120>一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctggtagtggaagacgcaaac22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttgatccaccatagacaactgc22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tttaccacggccaagcatat20