位于猪7号染色体上与总乳头数相关的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记及应用。

背景技术：

母猪的乳头是仔猪在哺乳期获取营养和免疫力的重要器官。近年来，对增加窝产仔猪数的选育加剧了母猪饲喂更多仔猪的负担。因此，使猪拥有足够数量的乳头一直是种猪选育的重要目标。总乳头数(totalteatnumber，ttn)是猪重要的繁殖性状，增加总乳头数是提高仔猪存活率、促进仔猪体重增加以及均匀生长的重要手段。因此，对总乳头数性状的选育十分必要，以提高猪生产性能。

母猪繁殖性能对猪场的生产效益有着重要的影响，而总乳头数是评价种猪繁殖性能的重要指标之一。充足的乳头数才能实现仔猪多产多活的需求，与仔猪的生长发育和免疫健康也密切相关。乳头数为中高等遗传力性状，遗传力在0.20～0.40之间，然而在实际生产工作中，育种工作者往往从表型上直接对乳头数进行选择，简单的淘汰与留种选择并不能满足生产需要，且未充分发挥猪的生产潜能。因此，采用遗传手段对核心猪群总乳头数进行性状改良，则能加快目标性状的选育进展。这不仅有利于充分挖掘猪繁殖性能还能提高仔猪存活率和生长性能，进而提高经济效益，增强商品猪生产的竞争力。

乳头数是典型的由多基因控制的数量性状。国内外研究人员利用qtl定位和候选基因法对影响乳头数的数量性状基因座(quantitativetraitloci，qtl)进行了研究，但是结果并不理想。近年来，随着猪全基因组序列的公布和高密度snp(singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态)芯片的开发，使得全基因组关联分析(genomic-wideassociationstudy，gwas)在鉴别影响复杂性状的分子标记和候选基因方面显示出强大的检测能力，并已广泛用到猪重要经济性状的遗传解析中。因此，采用gwas分析策略可以鉴别到与猪总乳头数相关的分子标记，效应大的snp可以运用到分子标记辅助选择和基因组选择中，从而加快猪总乳头数性状的遗传改良进展提高经济效益。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述snp分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记，其snp位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第97568284位g>a突变；

所述的位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的核苷酸序列如seqidno：1所示，其中序列中的m是a或g，导致猪总乳头数的不同；

所述的位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的snp位点为seqidno:1序列标注位置为131位的a131-g131的核苷酸突变；

所述的位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记在鉴定猪总乳头数性状和猪遗传育种中的应用；

利用上述位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记筛选高总乳头数性状的猪品种的方法，包含如下步骤：

检测猪7号染色体上上述位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记，所述分子标记的5’端第131位单核苷酸是g还是a，淘汰g保留a；

所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；

一种用于鉴定上述位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的引物对，包含引物p001-f和引物p002-r，其核苷酸序列如下所示：

p001-f：5’-ttgtggcggaggagaaagaga-3’；

p002-r：5’-cggacacctgaagtgctgat-3’；

所述的引物对在鉴定影响猪总乳头数性状中的应用；

所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对在提高猪总乳头数中的应用；

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第97568284位点为ag、aa基因型的种猪个体，淘汰在第97568284该位点为gg基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因a的频率，从而提高后代猪的总乳头数；

所述的种猪优选为加系杜洛克及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响猪总乳头数相关的分子标记位于猪的7号染色体上的核苷酸序列上，验证其对总乳头数性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪提高总乳头数的遗传改良中，可以快速准确地对猪进行选育，加快育种进程，提高后代猪的繁殖性能，提高企业利润，增加核心竞争力。具体可以为：通过逐代筛选该snp的优势等位基因，提高优势等位基因频率，进而提高猪总乳头数，提高猪的繁殖性能，加快猪遗传改良进展从而有效提高经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定上述位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对猪进行选育，加快育种进程。

附图说明

图1是加系杜洛克猪在7号染色体上关于总乳头数性状的全基因组关联分析(gwas)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logp值。

图2是不同基因型猪的总乳头数的表型比例结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克2153头，为种猪分公司核心群。

本实验所选取该资源群体中加系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

(2)样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50ksnp判型

从上述资源群体中选取的2153头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组dna，经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的dna的浓度和od比值(od260/280、od260/230)。经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪检测合格的dna样品，按照检测的浓度将dna稀释至50ng/μl左右。再将6μl已提取好的待测dna样品与2μlloadingbuffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150v电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察dna的完整性。

dna样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在illuminabeadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50ksnp芯片(illumina，美国)基因型判定。利用r语言genabel包中checkmarker对所有样本50k芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的snp，最终得到37325个snp的有效基因型数据。

(4)全基因组关联(gwas)分析

为了消除群体层化效应，本发明采用gemma软件中的线性混合模型进行gwas分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用bonferrini法确定snp与总乳头数性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效snp位点数量，即基因组显著水平阈值为1.34e-6，即0.05/37325(有效snp数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效snp位点数量，即染色体显著水平阈值为2.68e-5，即1/37325(有效snp数量)。

gwas分析结果如图1和图2所示。从图1和图2可知，在杜洛克中，在7号染色体中存在显著影响总乳头数的位点，最强关联的snp为g.131g>a(p＝1.10e-21)。

5、不同基因型与总乳头数表型的关联性分析

根据表1可知，分子标记的snp位点g.131g>a(seqno.1中第131位核苷酸，即对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第97568284位g>a突变)与总乳头数状极显著相关(p<0.01)，说明此分子标记显著影响猪的总乳头数性状，可以通过对猪的此snp位点的辅助选择，从而提高该群体的总乳头数，进而加快育种进程。

另外根据表1及图2可知，aa型、ga型比gg型的平均总乳头数高，gg型较aa型、ga型显著，aa型与ga型也显著，说明等位基因g对总乳头数是不利的。总乳头数是衡量猪繁殖性能的重要指标，总乳头数更高说明猪的繁殖性能更好。因此，淘汰gg基因型的猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰gg型的种猪，保留aa型、ga型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因a的频率。

表1分子标记的snp位点g.131g>a效应分析

实施例2目的dna序列扩增及测序

(1)引物设计

通过ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的7号染色体上seqidno:1的dna序列。并利用引物设计软件primerpremier6.0设计引物。设计的引物的dna序列如下所示：

p001-f：5’-ttgtggcggaggagaaagaga-3’；

p002-r：5’-cggacacctgaagtgctgat-3’；

(2)pcr扩增

10μl的反应体系中加入dna模板1μl，双蒸水3.4μl，2×tagpcrstanmixwithloadingdye5μl，引物p001-f和p002-r各0.3μl。pcr反应条件为：95℃预变性3min后，95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)dna序列测定

dna序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应snp位点的突变。测序结果如下所示：

注：序列表中标注的m为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的snp位点g.131g>a效应分析

本发明通过对seqidno:1序列中的第131个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的总乳头数性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。由表1可知，平均每头aa型种猪总乳头数比gg型种猪总乳头数多0.88个，且差异极显著。通过分子标记辅助选择，可促进杜洛克种猪的育种进程，增加猪的繁殖性能，从而促进猪肉生产，带动养猪产业经济效益更大化。具体表现为：

通过分子标记辅助选择，对群体内基因型为gg的猪进行淘汰，我们显著提高了群体的总乳头数，其中，每头猪的有效总乳头数提高在0.35～0.88个之间，10000头的能繁母猪每胎就能多哺乳3500～8800头仔猪，以这些仔猪直接育肥到100kg上市计算，按照80％的屠宰率估算，则一万头母猪每胎能够多提供280～704吨猪肉，这将给企业带来巨大的经济收入和效应，增加其核心竞争力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记及应用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>296

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>位于猪7号染色体上与总乳头数相关的snp分子标记的核苷酸序列

<400>1

ttgtggcggaggagaaagagaaaagggggaagctgcaagtttttttttttttaagtttat60

cttttcttttaaaaatttctaaaatttaaatagtcaattaaagttaaaaatccgtagttg120

caaaactgacmtgatctaaaagatttctggatctctgaccccaggtccaataaattattt180

tgacccttcatttcttacagaccaccccccacattttcagggtttttttttttttttttt240

tttttaagaaaccatgatctgaggtgatttgtaagtatcagcacttcaggtgtccg296

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