一种促进少根根霉高产油脂的发酵方法及所用培养基与流程

本发明涉及一种促进少根根霉高产油脂的发酵方法及所用培养基，属于微生物发酵技术领域。

背景技术：

近年来，能源过度消耗和使用化石燃料带来一系列环境问题，开发新的、对环境无害非石油类能源及清洁可再生能源迫在眉睫。生物柴油因其独特优越性，作为化石燃料潜在替代能源，其开发研究受到越来越多关注。目前，国内外用于生产生物柴油原料主要仍为动、植物油，但其成本较高。廉价废弃油脂来源广泛，但是生产利用率低，且油脂成分较复杂，也难以形成大规模工业化生产。微生物油脂（microbialoils）又叫单细胞油脂（sco），是产油微生物在特定环境下，利用碳水化合物和一般油脂为碳氮源以及一定的无机盐类，在微生物细胞内产生的油脂，可运用于药物、保健食品和生物柴油原料等领域，具有潜在的商业价值。

微生物油脂是微生物的一种代谢产物，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，仍以c16、c18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸为主，但是，有些微生物油脂中含不饱和脂肪酸，如ara、γ-lna、epa和dha等含量很高，因也具有重要的生理功能和很高的经济价值。微生物油脂作为可再生清洁能源的资源，与常规植物油和动物油生产相比，具有以下优势：①微生物油脂含有植物、动物不能合成或少量合成的脂肪酸；②与大豆油、棕榈油、葵花籽油等商品油相比，微生物油脂营养价值更高；③微生物生长所需原料来源比较广泛，能利用便宜的零成本的原料进行生产，如农副产品及发酵工业的废弃物，生产成本较低；④产油微生物细胞生长十分迅速、生长周期较短，能连续大规模生产，生产成本较低；⑤微生物油脂的生产可人工高效调控，不受季节、气候、地理环境的限制；⑥利用生物技术改良菌种或选择不同培养基，可使微生物生产出经济价值高的功能性油脂和有特殊用途的油脂。而且，由于人口增长使得日益增加的油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾愈发尖锐，开辟微生物油脂这一新的油脂资源更具有重要的现实意义。

产油微生物的种类多种多样，包括细菌（嗜酸乳杆菌、混浊红球菌、弧菌等）、酵母（弯假丝酵母、浅白色隐球酵母、胶黏红酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母等）、霉菌（深黄被孢霉、高山被孢霉、少根根霉、米曲霉、土曲霉、雅致枝霉等）和藻类（盐生杜氏藻、粉核小球藻、等鞭金藻、三角褐指藻、新月菱形藻等），目前研究较多的是酵母菌、霉菌和藻类，产油细菌报道较少。霉菌油脂中脂肪酸类型要比酵母菌丰富很多，油脂含量超过25%的霉菌约有64种，很多霉菌油脂含量在20%~25%。霉菌主要用于生产高比例的不饱和脂肪酸，不同霉菌的脂肪酸组成有很大差别，如土曲霉的脂肪酸组成与食用植物油特别相近，被孢霉菌属、毛霉属、根霉属能产生相对量较高的γ-亚麻酸、花生四烯酸等功能性多不饱和脂肪酸。

产油微生物与其他普通生物一样，在生长、代谢和繁殖过程中需要最基本的营养物质和能量的供给，如碳源、氮源、无机盐、生长因子和水，有的产油微生物还需要有光照条件，从而有利于油脂的产生和积累。微生物生产油脂主要包括细胞增殖和脂质累积两个阶段，细胞增殖阶段需要消耗培养基中的碳源、氮源，维持微生物的正常生长代谢，当氮源不足的条件下，微生物没有进一步繁殖，而是将过量的碳水化合物转化为脂类，就形成了油脂。因此培养基中碳源、氮源的种类和浓度以及c/n比都是影响微生物油脂含量的重要因素。此外，向培养基中添加一些脂肪酸合成的中间产物或者调控物质也会影响油脂的积累。现代液体/深层发酵技术具有氧供应充足、发酵周期短、不受季节限制等特点，已成为大多化工和生物产品发酵的主要手段。随着微生物发酵技术的发展，利用微生物发酵生产油脂的工艺也逐步进入工业生产阶段。发酵过程中的温度、ph值、溶氧量对微生物产油率和油脂量都有一定的影响，培养时间也对微生物产油量有较大的影响。培养时间短，则菌株总数量减少，产油量相应下降；培养时间过长，微生物自身会发生畸变、溶胀等不良现象，导致油脂收集困难，也影响了微生物油脂的品质和收率。

本研究小组发现，现有技术中用于发酵生产油脂的霉菌多集中在被孢霉或毛霉，而以少根根霉为菌种发酵生产油脂的研究较少。少根根霉也是一种重要的产油微生物资源，鉴于不同种类的霉菌对碳源、氮源、无机盐、微量元素等其它营养物质的偏好性不同，最适合的培养条件也不尽相同，因此有必要研究出适合于少根根霉发酵产脂的方法。

技术实现要素：

针对现有的技术不足，本发明要解决的问题是提供一种适用于少根根霉的发酵培养基以及能够促进少根根霉高产油脂的发酵方法，为少根根霉的工业生产奠定基础。

本发明是通过下述技术方案实现的：

一种促进少根根霉高产油脂的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）少根根霉菌种的活化：挑取少量的少根根霉的菌丝或孢子接入装有斜面培养基的试管中，置于培养箱中培养5-7d，直至长出大量的孢子，培养温度为26-30℃；

（2）摇瓶培养：用无菌水洗下斜面上的孢子接入装有种子培养基的三角瓶中，100ml三角瓶装液10ml，置于摇床上培养48h，得到一级种子液；将一级种子液按5%的接种量再接入装有种子培养基的三角瓶中，500ml三角瓶装液100ml，置于摇床上培养48h，得到二级种子液；

（3）发酵培养：将二级种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为65-75%，培养温度为26-30℃，发酵前期即发酵的0-72h溶氧量控制在40-50%，发酵后期即发酵的73-120h溶氧量控制在20-30%，溶氧量变化通过搅拌转速和通气量控制来实现，并采用溶氧电极进行在线监控；在发酵的73-84h内向发酵培养基中一次性添加钨酸钠0.25-0.35g/l；

（4）菌体分离：发酵培养结束后，将发酵液用布氏漏斗进行减压抽滤，并用蒸馏水反复冲洗3次，收集湿菌体，放入烘箱80℃烘干至恒重，采用常规方法提取油脂。

所述步骤（1）中斜面培养基的配方为（按1l计）：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸镁1.5g，琼脂20g，ph自然。

所述步骤（2）中种子培养基的配方为（按1l计）：葡萄糖50-60g，硝酸铵2.7-3.3g，酵母浸膏1.8-2.2g，氯化钠0.5-1.0g，磷酸二氢钾1.9-2.3g，硫酸镁0.6-1.0g，氯化钙30-50mg，三氯化铁18-30mg，edta20-35mg，硫酸铜0.1-0.2mg，硫酸锌0.2-0.4mg，硫酸锰0.2-0.4mg，烟酸0.05-0.1mg，4-氯苯氧乙酸5.0-7.0mg，烯腺嘌呤2.0-4.0mg，ph6.0-7.0。

所述步骤（2）中摇瓶培养的温度为26-30℃，摇床转速为140-180rpm。

所述步骤（3）中二级种子液的接种量为10%。

所述步骤（3）中发酵培养基的配方为（按1l计）：玉米淀粉70-90g，葡萄糖15-25g，硝酸铵2.7-3.3g，花生粕酶解物35-45g，硫酸镁0.9-1.3g，氯化钠17-23g，磷酸二氢钾0.7-1.0g，三氯化铁18-30mg，edta20-35mg，硫酸铜0.1-0.2mg，硫酸锌0.2-0.4mg，硫酸锰0.2-0.4mg，4-氯苯氧乙酸5.0-7.0mg，烯腺嘌呤2.0-4.0mg，无水甲醇6-14ml，褪黑素0.8-1.2μmol，黄腐酸1.3-1.7g，2-巯基乙醇0.4-0.6g，n-甲基吗啉1.7-2.3g，槐糖脂4.5-5.5g，初始ph5.5-6.5。

所述步骤（3）中发酵前期的搅拌转速为190-210rpm，通气量为1.6-2.0vvm，发酵后期的搅拌转速为140-160rpm，通气量为0.7-1.1vvm。

所述发酵培养基中花生粕酶解物的制备方法为：将花生粕与蒸馏水按质量体积比1:6-1:10配成混合液，在所述溶液中添加花生粕质量4-6%的碱性蛋白酶，调节所述混合液的ph为7.5，在55-65℃的条件下酶解6-8h，所得产物用双层纱布过滤，弃去滤渣，滤液即为花生粕酶解物。

有益效果：

（1）本发明在发酵培养过程中对溶氧量进行分段调控，发酵前期较高的溶氧量能够刺激少根根霉菌体快速增值，有利于少根根霉生物量积累；发酵后期生物量达到一定程度，菌体内油脂合成加快，降低溶氧量能够重新平衡菌体生长及油脂合成过程中的活性氧需求，有利于油脂积累。

（2）本发明对所用的种子培养基和发酵培养基进行了优化，种子培养基中添加了适量的钙、铁、铜等微量元素以及4-氯苯氧乙酸、烯腺嘌呤，能够促进少根根霉菌体生长，提高种子液的活力；发酵培养基以玉米淀粉和葡萄糖作为复合碳源，降低了以葡萄糖为单一碳源的生产成本；以花生粕酶解物作为有机氮源，不仅降低生产成本，而且其中的功能性物质还可促进少根根霉的油脂积累；发酵培养基中添加了适量的4-氯苯氧乙酸、烯腺嘌呤、无水甲醇、褪黑素、黄腐酸、2-巯基乙醇、n-甲基吗啉和槐糖脂，对于促进少根根霉菌体生长、调控少根根霉油脂合成、提高少根根霉的油脂含量都具有重要作用，使得少根根霉的油脂产量得以大幅度提高。

（3）本发明在发酵后期向发酵培养基中添加了适量的钨酸钠，钨酸钠是硝酸还原酶的抑制剂，可以限制少根根霉对氮的吸收，而氮限制对油脂合成有重要的调节作用，因此，可以促进少根根霉油脂的积累。

附图说明

图1是花生粕酶解物浓度对少根根霉发酵产脂的影响；

图2是4-氯苯氧乙酸浓度对少根根霉发酵产脂的影响；

图3是褪黑素浓度对少根根霉发酵产脂的影响；

图4是钨酸钠浓度对少根根霉发酵产脂的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中的少根根霉菌种购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心（编号：cgmcc3.15655）

实施例1

一种促进少根根霉高产油脂的发酵方法，包括如下步骤：

（1）少根根霉菌种的活化：挑取少量的少根根霉的菌丝或孢子接入装有斜面培养基（按1l计配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3.0g，硫酸镁1.5g，琼脂20g，ph自然）的试管中，置于培养箱中培养5-7d，直至长出大量的孢子，培养温度为28℃。

（2）摇瓶培养：用无菌水洗下斜面上的孢子接入装有种子培养基（按1l计配方为：葡萄糖55g，硝酸铵3.0g，酵母浸膏2.0g，氯化钠0.75g，磷酸二氢钾2.1g，硫酸镁0.8g，氯化钙40mg，三氯化铁24mg，edta27mg，硫酸铜0.15mg，硫酸锌0.3mg，硫酸锰0.3mg，烟酸0.075mg，4-氯苯氧乙酸6.0mg，烯腺嘌呤3.0mg，ph6.5）的三角瓶中，100ml三角瓶装液10ml，置于摇床上培养48h，得到一级种子液；将一级种子液按5%的接种量再接入装有种子培养基的三角瓶中，500ml三角瓶装液100ml，置于摇床上培养48h，得到二级种子液；培养温度为28℃，摇床转速为160rpm。

（3）发酵培养：将二级种子液以10%的接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量为70%，培养温度为28℃，发酵前期即发酵的0-72h溶氧量控制在45%，搅拌转速为200rpm，通气量为1.8vvm，发酵后期即发酵的73-120h溶氧量控制在25%，搅拌转速为150rpm，通气量为0.9vvm，并采用溶氧电极进行在线监控；在发酵培养的78h向发酵培养基中一次性添加钨酸钠0.3g/l；发酵培养基的配方为（按1l计）：玉米淀粉80g，葡萄糖20g，硝酸铵3g，花生粕酶解物40g，硫酸镁1.1g，氯化钠20g，磷酸二氢钾0.85g，三氯化铁24mg，edta27mg，硫酸铜0.15mg，硫酸锌0.3mg，硫酸锰0.3mg，4-氯苯氧乙酸6.0mg，烯腺嘌呤3.0mg，无水甲醇10ml，褪黑素1μmol，黄腐酸1.5g，2-巯基乙醇0.5g，n-甲基吗啉2.0g，槐糖脂5.0g，初始ph6.0；花生粕酶解物的制备方法为：将花生粕与蒸馏水按质量体积比1:8配成混合液，在所述溶液中添加花生粕质量5%的碱性蛋白酶，调节所述混合液的ph为7.5，在60℃的条件下酶解7h，所得产物用双层纱布过滤，弃去滤渣，滤液即为花生粕酶解物。

（4）菌体分离：发酵培养结束后，将发酵液用布氏漏斗进行减压抽滤，并用蒸馏水反复冲洗3次，收集湿菌体，放入烘箱80℃烘干至恒重，用微量分析天平称量并计算生物量。生物量（g/l）＝菌体干重（g）/发酵液体积（l）。

（5）菌体油脂提取：利用酸热法提取油脂，取干菌体研磨，按每克菌体加入5ml4mol/l的盐酸，放于180r/min摇床中震荡6h，然后沸水浴10min，-20℃速冷10min，重复3次，加入2倍体积氯仿-甲醇（1:1）溶液，充分振荡后，5000rpm离心5min，取底部氯仿层，加等体积0.1%氯化钠溶液，混匀，5000rpm离心5min，取氯仿层，置于80℃烘箱中烘干，除去氯仿即得油脂，称重。油脂含量（%）=油脂重量/菌体干重×100%；油脂产量（g/l）＝菌体生物量×油脂含量×100%。

实施例2：花生粕酶解物浓度对少根根霉发酵产脂的影响

参照实施例1，不同之处在于发酵培养基中分别添加浓度为20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l的花生粕酶解物，其它成分不变，进行发酵培养。发酵结束后测定菌体生物量、油脂含量以及油脂产量，结果见图1。

从图1可知，当花生粕酶解物浓度为50g/l时，少根根霉的菌体生物量大为20.52g/l，此浓度下油脂含量为33.66%，油脂产量也较高，为6.91g/l；当花生粕酶解物浓度为40g/l时，少根根霉的油脂含量最高为38.81%，此浓度下油脂产量也最高为7.44g/l，生物量为19.16g/l。花生粕酶解物作为一种有机氮源供少根根霉利用，当花生粕酶解物浓度过高或过低时都不利于菌体的生长和油脂的合成。因此，从油脂产量考虑，试验确定花生粕酶解物的最佳浓度为40g/l。

实施例3：4-氯苯氧乙酸浓度对少根根霉发酵产脂的影响

参照实施例1，不同之处在于发酵培养基中分别添加浓度为3.0mg/l、6.0mg/l、9.0mg/l、12.0mg/l的4-氯苯氧乙酸，以不添加4-氯苯氧乙酸作为对照，其它成分不变，进行发酵培养。发酵结束后测定菌体生物量、油脂含量以及油脂产量，结果见图2。

4-氯苯氧乙酸是一种植物生长调节剂，其生物活性持续时间较长，生理作用类似于内源激素，刺激细胞分裂和组织分化，在花卉、作物和果树上都有广泛的应用，而通过试验发现4-氯苯氧乙酸对少根根霉同样具有促进生长的作用。从图2可知，与不添加4-氯苯氧乙酸相比，在试验浓度范围内，少根根霉的菌体生物量随着4-氯苯氧乙酸浓度的升高呈先增大后减小的趋势，表明适当地添加4-氯苯氧乙酸对少根根霉菌体生长具有明显的促进作用，过量添加对少根根霉菌体生长具有一定的抑制作用。而4-氯苯氧乙酸对少根根霉的油脂含量略有影响，但不显著。当4-氯苯氧乙酸浓度为6.0mg/l时，少根根霉的菌体生物量大为19.25g/l，此浓度下油脂产量也最高为7.42g/l，因此，试验确定4-氯苯氧乙酸的最佳浓度为6.0mg/l。

实施例4：褪黑素浓度对少根根霉发酵产脂的影响

参照实施例1，不同之处在于发酵培养基中分别添加浓度为0.5μmol、1.0μmol、1.5μmol、2.0μmol的褪黑素，以不添加褪黑素作为对照，其它成分不变，进行发酵培养。发酵结束后测定菌体生物量、油脂含量以及油脂产量，结果见图3。

褪黑素是一种必需氨基酸——色氨酸的衍生物，褪黑素作为一种调节剂不仅能够调控微生物的生长代谢，还能够调控油脂合成的关键酶（如乙酰辅酶a羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）基因的表达，从而促进少根根霉菌体中油脂的积累。从图3可知，与不添加褪黑素相比，在试验浓度范围内，少根根霉的菌体生物量和油脂含量均有所提高，表明添加褪黑素对少根根霉菌体生长以及油脂合成都有促进作用，并且对油脂合成的促进作用更为显著。当褪黑素浓度为1.0μmol时，少根根霉的菌体生物量最大为19.10g/l，油脂含量和油脂产量也达到最高，分别为38.90%和7.43g/l，因此，试验确定褪黑素的最佳浓度为1.0μmol。

实施例5：钨酸钠浓度对少根根霉发酵产脂的影响

参照实施例1，不同之处在于在发酵培养的78h向发酵培养基中一次性添加浓度为0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l的钨酸钠，以不添加钨酸钠作为对照，其它成分不变，进行发酵培养。发酵结束后测定菌体生物量、油脂含量以及油脂产量，结果见图4。

钨酸钠是硝酸还原酶的抑制剂，硝酸还原酶是氮代谢过程中的一个重要调节酶和限速酶，可直接调节硝酸盐还原来调节氮代谢，可以抑制硝酸还原酶的活性，即钨酸钠可以限制微生物对氮的吸收，而氮限制对油脂合成有重要的调节作用，因此，在发酵后期油脂积累阶段，可以通过添加适量的钨酸钠来促进少根根霉菌体内油脂的合成，提高油脂产量。从图4可知，与不添加钨酸钠相比，在试验浓度范围内，少根根霉的菌体生物量随着钨酸钠浓度的升高呈减小的趋势，表明钨酸钠对少根根霉菌体的生长具有一定的抑制作用；而油脂含量随着钨酸钠浓度的升高呈先增大后减小的趋势，表明适当地添加钨酸钠对少根根霉菌油脂合成具有明显的促进作用。当钨酸钠浓度为0.3g/l时，少根根霉的油脂产量最高为7.49g/l，此浓度下菌体生物为19.27g/l，油脂含量为38.85%，因此，从油脂产量考虑，试验确定钨酸钠的最佳浓度为0.3g/l。

实施例6：溶氧量调控对少根根霉发酵产脂的影响

参照实施例1，不同之处在于发酵培养过程中不进行溶氧量调控，即发酵的0-120h溶氧量均控制在45%，搅拌转速为200rpm，通气量为1.8vvm，均保持不变，进行发酵培养。发酵结束后测定菌体生物量、油脂含量以及油脂产量，与实施例1进行对比，结果见表1。

从表1可知，实施例1中少根根霉的菌体生物量为19.21g/l，油脂含量为38.85%，油脂产量为7.46g/l，与实施例2相比有显著提高，说明溶氧量调控策略对少根根霉的生物量和油脂产量的提升有明显的促进效果。本发明在发酵培养过程中对溶氧量进行分段调控，发酵前期较高的溶氧量（40-50%）能够刺激少根根霉菌体快速增殖，有利于少根根霉生物量积累；发酵后期生物量达到一定程度，菌体内油脂合成加快，降低溶氧量（20-30%）能够重新平衡菌体生长及油脂合成过程中的活性氧需求，有利于油脂积累。

实施例7：不同发酵培养基对少根根霉发酵产脂的影响

参照实施例1，不同之处在于发酵培养采用常规发酵培养基，其配方为葡萄糖40g/l，硫酸铵2g/l，酵母粉2.4g/l，硫酸二氢钾0.8g/l，硫酸镁0.4g/l，硫酸锌0.05g/l，硫酸亚铁0.01g/l，初始ph6.0（参考文献《少根根霉产油脂液体深层发酵技术的研究》）。发酵结束后测定菌体生物量、油脂含量以及油脂产量，与实施例1进行对比，结果见表2。

从表2可知，实施例1中无论是少根根霉的菌体生物量，还是油脂含量与油脂产量都较实施例7有了显著提高。本发明的发酵培养基是经过大量试验优化的结果，以玉米淀粉和葡萄糖作为复合碳源，降低了以葡萄糖为单一碳源的生产成本；以花生粕酶解物作为有机氮源，不仅降低生产成本，而且其中的功能性物质还可促进少根根霉的油脂积累；发酵培养基中添加了适量的4-氯苯氧乙酸、烯腺嘌呤能够促进少根根霉菌体生长，有利于菌体生物量的积累；还添加了适量的无水甲醇、褪黑素、黄腐酸、2-巯基乙醇、n-甲基吗啉和槐糖脂，对于调控少根根霉油脂合成、提高少根根霉的油脂含量都具有重要作用，使得少根根霉的油脂产量得以显著提高。