一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法与流程

本发明属于生物学领域，具体涉及一种在山羊毛囊干细胞中特异性的降低cmtm3基因表达水平以促进山羊毛囊干细胞增殖的方法。

背景技术：

毛囊是研究体干细胞的理想系统，毛囊干细胞与毛囊周期状态密切相关，毛囊干细胞在受到外界刺激如皮肤损伤或者剪毛等，毛囊干细胞发生募集，促进皮肤修复和毛发生成。

在一些癌症中发现cmtm3基因丢失，被认为是一种可能的肿瘤抑制基因，有研究报道cmtm3在胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、食管癌、结肠癌和肾癌中被抑制或下调，睾丸癌细胞中发现cmtm3通过增加g2期细胞比例，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。其途径主要是通过甲基化，其表达与启动子cpg甲基化状态呈负相关。

雄性激素主要是指由性腺(睾丸)合成的一类内分泌激素，主要由睾丸间质细胞合成，此外，肾上腺皮质和卵巢也能合成少量的雄性激素，要包括睾酮、雄烯二酮和脱氢表雄酮，睾酮是其最主要的形式，雄激素功能的行使需依靠5α还原酶的作用。激素的生物活性是由其细胞内受体(核受体)所介导，该受体属于配体依赖的转录因子超家族，雄激素和雄激素受体(androgenreceptor，ar)结合后通过一系列受体后机制，将ar转移到核内，配体-受体复合物和dna上的配体结合区域结合，激活激素应答元件，进而调控基因表达和影响蛋白质合成。

雄激素对毛发的正常生长起重要的调节作用，不同时期对不同部位的毛发生长具有特定的刺激或抑制作用。普遍认为，雄激素的作用机制是通过毛细血管到达毛乳头细胞并和毛乳头细胞中ar结合，促发激素应答元件，改变dpc旁分泌产生可溶性的调节性分子作用于毛囊上皮成分而影响毛发生长。

腺病毒(adenovirus)是一种，直径为70～90nm的无包膜的双链线性dna病毒，由252个壳粒呈二十面体排列构成基因组长约36kb。腺病毒外源基因装载容量大，且能够感染绝大多数哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的细胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒适用于在难以转染的细胞中进行rna干扰、过表达特定基因或过表达特定microrna研究和invivo实验。

常用重组腺病毒系统包括腺病毒骨架载体(携带腺病毒主要功能基因)又称为整合载体、穿梭载体(转移外源基因表达盒到骨架载体上)。目前应用最为广泛的是admax腺病毒载体系统，骨架质粒和穿梭载体共转染293细胞后，在细胞内中通过cre/loxp实现载体重组，进而产生重组腺病毒。通过裂解细胞收获病毒粒子，病毒粒子经过反复扩增与纯化可得到高滴度的腺病毒。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，即一种在山羊毛囊干细胞中特异性的降低cmtm3基因表达量以促进山羊毛囊干细胞增殖的方法。

本发明的技术方案如下：

一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，构建cmtm3基因的干扰表达载体pdc316-zsgreen-shrna-cmtm3，将该载体导入山羊毛囊干细胞，通过降低毛囊干细胞中cmtm3基因的表达水平，从而促进山羊毛囊干细胞的增殖。

优选地，所述载体为阳性重组载体，其获得过程如下：

山羊毛囊干细胞总rna提取，再反转录获得cdna，针对cmtm3设计3个干扰靶点，合成后的引物退火形成双链dna后与双酶切线性化的pdc316-zsgreen-shrna载体连接形成重组质粒pdc316-zsgreen-shrna-cmtm3，将连接好的重组质粒转化到top10感受态细胞中，经测序选择阳性菌株并大量抽提重组质粒，最后经过腺病毒包装、扩增和纯化、细胞转染，最后进行荧光定量pcr以判断干扰效果，毛囊干细胞转染干扰载体后做细胞活力检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测，以判断对毛囊干细胞增殖的影响。

优选地，所述细胞活力检测做法如下：取正常培养的处于对数期的细胞在96孔板中接种细胞，37℃、5％co2(体积浓度)的培养箱中预培养24小时，每孔加入10μl不同的待测物质；将培养板在培养箱孵育4小时，每孔加入10μlcck溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

优选地，所述细胞周期检测做法如下：贴壁细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，离心去上清，再用70％、4℃预冷的表达量乙醇中，4℃固定12h，离心去上清，然后用碘化丙啶染色液染色，最后用流式细胞仪检测。

优选地，所述细胞凋亡检测做法如下：把经过培养的细胞培养基转到15ml离心管中，用0.25％胰蛋白酶洗细胞一次，吸尽胰蛋白酶到15ml离心管，再加1ml0.25％胰蛋白酶消化细胞，转移到15ml离心管，1200rpm离心5min，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次；

加入1ml预冷的孵育缓冲液，1200rpm离心5min，弃上清。加入195μl孵育缓冲液，5μl的annexinv-fitc混匀，避光，室温孵育10min。加入10μl的pi染液，冰浴避光待测，用300目尼龙网过滤样品，用孵育缓冲液将样品重悬到约0.2ml体积，最后用流式细胞仪检测。

本发明提供了一段可以特异性的降低山羊毛囊干细胞中cmtm3基因mrna的表达水平的shrna，将目的片段与pdc316-zsgreen-shrna质粒连接，构建干扰载体pdc316-zsgreen-shrna-cmtm3，并将阳性重组质粒导入山羊毛囊干细胞内，以特异性降低cmtm3基因mrna在山羊毛囊干细胞中表达水平，增加山羊毛囊干细胞的细胞活力，促进细胞增殖，减少细胞凋亡率，从而促进山羊毛囊干细胞的增殖。在培养基中添加生理浓度的雄激素也能增加细胞活力，促进毛囊干细胞增殖，减少细胞凋亡率。当二者同时作用时在所有处理组中促增殖效果最明显，二者作用相互协同。本发明所发现的shrna为后续的转基因山羊育种材料(胚胎、个体)的获得提供了技术支撑。

本发明中为了获得阳性重组载体具体的过程是：质粒pdc316-zsgreen-shrna用psti和bamhi内切酶进行双酶切,切胶回收线性化的质粒。引物退火后与线性化的pdc316-zsgreen-shrna质粒连接形成重组质粒，将连接好的载体转化到top10感受态细胞中，菌液pcr检测并测序鉴定选择阳性菌株并扩增，再进行腺病毒包装、扩增与纯化，最后用荧光稀释法测定病毒滴度。

为了验证本发明的效果，用山羊毛囊干细胞做转染，荧光定量pcr检测干扰效果，用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果表明转染干扰载体pdc316-zsgreen-shrna-cmtm3后，cmtm3在山羊毛囊干细胞中的表达水平显著降低，细胞周期结果显示处于分裂期的细胞比例显著升高，细胞凋亡检测结果显示细胞凋亡速率明显下降，说明采用本方法可以促进山羊毛囊干细胞的增殖，为后续的转基因山羊育种材料(胚胎、个体)的获得提供了技术支撑。

附图说明

图1为本发明中山羊毛囊干细胞提取总rna；

图2为本发明中针对cmtm3设计的3个干扰靶点；

图3为本发明中荧光定量检测cmtm3表达水平；

图4为本发明中病毒感染细胞荧光检测；

图5为本发明中荧光稀释法测定病毒滴度；

图6为本发明中各组山羊血液中雄激素含量的测定；

图7为本发明中各处理组中细胞活性检测；

图8为本发明中各处理组中pi染色检测细胞周期；

图9为本发明中各处理组中细胞凋亡检测。

具体实施方式

1.根据ncbi中山羊cmtm3mrna全序列(geneid：102174055)，应用ncbi中的primer-blast在线设计引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，荧光定量引物序列如表1(针对cmtm3设计的qpcr引物序列如表1所示)。

表1.cmtm3荧光定量检测引物

2.山羊毛囊干细胞的培养：毛囊干细胞来源于本实验室前期分离培养的长江三角洲白山羊毛囊干细胞。复苏细胞时，用37℃温水快速解冻细胞，并与9倍体积的细胞培养液混合孵育10min后离心收集细胞，按5×10⁵个/ml的细胞密度接种于培养瓶。

3.山羊毛囊干细胞总rna的提取和检测：trizol法提取山羊毛囊干细胞总rna，并检测提取质量和浓度，od值在1.8-2.0之间，使用体积浓度百分比为1％琼脂糖凝胶电泳分析rna完整性及污染情况检测，三条带28s，18s和5s都清晰可见，而且28s亮度是18s的两倍，说明了总rna的质量可靠，可用于后续的实验。电泳检测结果见图1。

4.rnai靶位点设计：从genebank中查询cmtm3基因的上下游序列，通过thermo网站(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress)针对cmtm3设计3个干扰靶点，如图2所示。其中干扰效果最明显的是cmtm3-sh1，干扰效率达到了70％以上。5.引物退火形成双链dna：合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温，引物退火形成双链dna。

6.pdc316-zsgreen-shrna载体双酶切线性化：体系如下表2(37℃温育2-4h)

表2.pdc316-zsgreen-shrna载体双酶切线性化体系

7.退火产物与载体进行连接：通过t4dnaligase将双酶切线性化的载体和退火双链dna连接，16℃连接1-3h。退火产物与载体进行连接反应体系如表3：

表3.退火产物与载体进行连接反应体系

8.转化及验证：将要转化的dna片段加入到装有top10感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需要25ngdna)，体积应不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴冷却1-2min。每管加入200μllb液体培养基，37℃摇床水浴45min，将适当体积已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的lb培养基上37℃培养过夜挑取菌落测序验证。

9.质粒扩增：将测序正确的菌液(腺病毒穿梭载体)转接于10ml含氨节霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，浓度大于1μg/μl，a260/280在1.7-1.8之间方可用于病毒包装。

10.腺病毒包装：培养的293a细胞密度达到70％-80％时转染。向1.5ml离心管中加入500μldmem(无血清)，然后添加pdc316-zsgreen-shrna质粒(腺病毒穿梭载体)1.5μg和pbhgloxdeltae1,3cre质粒(腺病毒骨架载体)6μg，混匀。与lip2000无血清培养基稀释混合，室温静止20min。将质粒和脂质体混合物添加到293a细胞中，轻轻摇晃培养基混匀。将293a细胞置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。培养6-10h后，更换正常培养液(dmem+10％fbs)培养，24h后可观察gfp荧光(载体携带gfp基因)确定转染效率，连续培养10天后，显微镜下观察细胞发生大面积的噬斑，则收集细胞。将收集的细胞置于-80℃-37℃反复冻融3次破碎细胞释放病毒粒子，离心并保留上清，为p0代种子病毒保存液。

11.腺病毒扩增与纯化：10cm平皿培养293a细胞，待细胞汇合度达到90％以上，添加p0代病毒液，moi＝1-2，2-3天后细胞病变，且有50％细胞漂浮，收集细胞，保留1ml培养基重悬细胞，-80℃-37℃反复冻融3次破碎细胞，释放病毒粒子，离心，保留上清，为p1代病毒液。如此扩增三次后得到p3代病毒，配置氯化铯密度梯度溶液，15℃、35000rpm离心2h。纯化后的病毒液置于pbs中透析24h，期间更换三次透析液。用500μlpbs重选病毒沉淀，于-80℃保存。

12.qpcr测定cmtm3表达水平：收集的细胞提取总rna，反转录为cdna，以实时荧光定量pcr检测各组中目的cmtm3基因的表达变化。荧光定量pcr结果如图3所示，三个位点中只有cmtm3-sh1的干扰效果最好，但是依然达不到实验要求(3，a)，使用1号靶点加长感染时间继续筛选，结果显示cmtm3的干扰效率达到70％(3，b)，表明所构建的cmtm3过表达载体和干扰载体可以用于下一步的实验。

13.病毒感染细胞荧光检测：检测结果如图4所示，可以观察到绿色荧光，表明cmtm3干扰载体在毛囊干细胞内可稳定表达，可以用于下一步的实验。

14.荧光稀释法测定病毒滴度：将生长状态良好的毛囊干细胞接种到96孔板，使细胞浓度为10⁴个/孔，于37℃5％co2培养箱培养24h。取10μl浓缩得到的腺病毒液，dmem稀释病毒液，10倍稀释10个梯度，即最低稀释至10^-9。吸去原培养基后，加入100μl稀释的腺病毒扩增液，感染24小时后，各孔加入100μl完全培养基。37℃5％co2培养箱中继续培养48h观察细胞状态，10^-1稀释后培养24h细胞即变圆。培养72h后在荧光显微镜下观察拍照。计算病毒滴度。梯度稀释的腺病毒感染细胞72h后，观察荧光并选取部分稀释孔(某一视野)进行拍照，结果图5所示：8号孔中表达绿色荧光的细胞至少为50个，因此病毒的滴度为5×10¹⁰pfu/ml。计算公式：50/(10×10^-10)ml＝5×10¹⁰pfu/ml。

15.雄激素浓度的测定：采集6-8月龄的长江三角洲白山羊优质与非优质笔料毛公羊血液以及相同饲养环境、相近年龄的母羊、去势公羊血液各5ml，用冰盒带回实验室后，使用山羊雄激素酶联免疫分析试剂盒(江莱生物)进行雄激素的测定。检测结果如图6所示，优质笔料毛组的雄激素水平最高平均值为1216ng/l，且优质笔料毛组雄激素水平显著高于其他三组(p＜0.05)。

16.细胞活性检测：取正常培养的处于对数期的细胞在96孔板中接种细胞，根据核实的铺板细胞数(约5×10⁴)，每孔约100μl细胞悬液。将培养板放在37℃、5％co2的培养箱中预培养24小时，每孔加入10μl不同的待测物质；将培养板在培养箱孵育4小时，每孔加入10μlcck溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。检测结果如图7所示，转染干扰载体和转染干扰载体并添加生理浓度的雄激素可以促进细胞增殖。在培养基中单独添加生理浓度的雄激素也能促进细胞的增殖，在转染干扰载体并添加生理浓度的雄激素后能促进细胞的增殖，在所用处理组中促生长作用最为显著，表明抑制cmtm3基因的表达可以促进毛囊干细胞的增殖，同时在培养基中添加生理浓度的雄激素后也能促进毛囊干细胞的增殖，并且它们之间存在协同作用。

17.pi染色检测细胞周期：用0.25％胰酶消化细胞(贴壁细胞)，1200rpm离心5min，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次。用300μlpbs重悬细胞，加入预冷70％乙醇5ml，于4℃固定过夜。1200rpm离心5min收集细胞，用5ml的pbs洗细胞两次。加入500μlpi染色液(含50μg/ml溴化乙锭(pi)，100μg/mlrnasea，0.2％tritonx-100)4℃避光冰上孵育30分钟。过300目筛网，用200μlpbs重悬细胞。流式细胞仪分析。检测结果如图8所示，转染过干扰载体后g1期的细胞比例显著下降，在添加生理浓度的雄激素后g1期的细胞比例显著下降，s期的细胞比例显著上升，同时g2期细胞也有所上升。转染过干扰载体并添加雄激素后g1期的细胞比例显著下降，g2期细胞比例也显著上升。表明cmtm3在毛囊干细胞中的表达水平降低可以使细胞g2和s期细胞比例增加，说明抑制cmtm3在毛囊干细胞中的表达水平和添加雄激素都可以促进毛囊干细胞的增殖，并且它们的调节作用互补。

18.annexinv/pi双染色法检测细胞凋亡：细胞培养基转到15ml离心管中(培养基中有一些凋亡飘起来细胞)，用0.25％胰酶(不含edta)洗细胞一次，吸尽胰酶到离心管，再加1ml0.25％胰酶消化细胞，要控制消化时间以防过度消化损伤细胞。1200rpm离心5min，弃上清，用预冷pbs洗细胞两次。加入1ml预冷的孵育缓冲液，1200rpm离心5min，弃上清。加入195μl孵育缓冲液，5μl的annexinv-fitc混匀，避光，室温孵育10min。加入10μl的pi染液，冰浴避光待测，用300目尼龙网过滤样品，用孵育缓冲液将样品重悬到约0.2ml体积。流式细胞仪分析。检测结果如图9所示，表明cmtm3在毛囊干细胞中的表达水平升高可以促进细胞凋亡，但是添加雄性激素可以使凋亡率下降。

上述结果表明，所构建的方法，可以促进山羊毛囊干细胞的增殖，为后续的转基因山羊育种材料(胚胎、个体)的获得提供了技术支撑。