SERPINC1iRNA组合物及其使用方法与流程

相关申请

本专利申请要求于2012年4月26日提交的美国临时申请号61/638,952、于2012年7月9日提交的美国临时申请号61/669,249、于2012年12月7日提交的美国临时申请号61/734,573以及于2013年3月15日所提交的美国申请号13/837,129的优先权。通过引用将前述申请的每个的全部内容结合在此。

背景技术：

serpinc1是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的一个成员。serpinc1是一种血浆蛋白酶抑制剂，其抑制凝血酶以及凝固系统的其他激活的丝氨酸蛋白酶，例如因子x、ix、ⅺ、xii和vii，并且从而调节凝血级联(参见例如图1)。通过肝素和催化凝血酶：抗凝血酶(tat)复合体形成的其他相关糖胺聚糖的存在增强serpinc1的抗凝活性。

出血性障碍(无论遗传性的或获得性的)是存在不完全血液凝结的病况。例如，血友病是一组世代相传的遗传性出血性障碍，其损害身体控制血液凝结或凝固的能力。血友病a是一种隐性伴x的遗传性障碍，涉及缺失机能性凝血因子viii，并代表80％的血友病案例。血友病b是一种隐性伴x的遗传性障碍，涉及缺失机能性凝血因子ix。它包括大约20％血友病案例。血友病c是一种常染色体遗传性障碍，涉及缺失机能性凝血因子xi。血友病c是不完全隐性的，因为杂合的个体也显示增加的出血。

尽管目前不存在对血友病的治愈，但它可以用定期输注缺失的凝结因子例如血友病a中的因子viii得以控制。然而，一些血友病患者发展了针对给予他们的替代因子的抗体(抑制剂)，并从而对替代凝结因子变得不应。因此，在这类受试者中的出血不能被恰当地的控制。

高效价抑制剂(例如，对于因子viii和其他凝结因子)的发展是血友病疗法最严重的并发症，并且使得治疗出血非常具有挑战性。当前，在这类受试者中停止出血的唯一策略是使用“旁路剂”，例如因子八抑制剂旁路活性(feiba)以及激活的重组因子vii(rfviia)、血浆去除术、连续因子替代、以及免疫耐受疗法，这些中没有一个是完全有效的。因此，本领域需要用于患有出血性障碍例如血友病的受试者的替换治疗。

技术实现要素：

本发明提供了irna组合物，该irna组合物影响serpinc基因的rna转录本的rna诱导沉默复合体(risc)介导的切割。该serpinc1基因可以在细胞例如受试者(例如人)体内的细胞的内部。本发明还提供了一种使用和运用本发明的irna组合物来抑制serpinc1基因表达和/或治疗患有将从抑制或减少serpinc1表达受益的障碍例如出血性障碍(例如血友病)的受试者的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了用于抑制serpinc1表达的双链核糖核酸(dsrna)。该dsrna包括有义链和反义链，其中该有义链包括与seqidno：1的核苷酸序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包括与seqidno：5的核苷酸序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了用于抑制serpinc1表达的双链核糖核酸(dsrna)。该dsrna包括有义链和反义链，该反义链包括一个互补区域，该互补区域包括与表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个列出的反义序列中的任意一个差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。

在一个实施例中，该有义和反义链包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：ad-50487.1、ad-50477.1、ad-50483.1、ad-50475.1、ad-50495.1、ad-50476.1、ad-50499.1、ad-50478.1、ad-50489.1、ad-50501.1、ad-50507.1、ad-50484.1、ad-50515.1、ad-50540.1、ad-50528.1、ad-50549.1、ad-50539.1、ad-50534.1、ad-50527.1、ad-50514.1、ad-50509.1、ad-50529.1、ad-54944、ad-56813、ad-57205、ad-57214、和ad-57213，以及表3、4、8、11、12、14、15、20、以及21中任一个列出的序列，或与那些序列至少95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列中的任一个。在本发明的某些实施例中，该dsrna包括至少一个经修饰的核苷酸。在一个实施例中，该修饰的核苷酸中的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-o-甲基修饰的核苷酸、包括5′-硫代磷酸基团的核苷酸和与胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。在另一个实施例中，该修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸、以及包括非天然碱基的核苷酸。

该dsrna的互补区域可以是至少17个核苷酸长度、在19个和21个核苷酸长度之间、或19个核苷酸长度。

在一个实施例中，dsrna的每条链不多于30个核苷酸长度。

dsrna的至少一条链可包括至少1个核苷酸或至少2个核苷酸的3’突出。

在某些实施例中，dsrna进一步包括一个配体。在一个实施例中，该配体共轭至该dsrna的有义链的3’末端。

在一些实施例中，该配体是通过二价或三价分支连接物而附接的一个或多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。在具体实施例中，该配体是：

在一些实施例中，该rnai剂共轭至以下示意图中所示的配体

在另一个实施例中，该rnai剂共轭至以下示意图中所示的配体，其中x是o或s。

在一个实施例中，dsrna的互补区域由表3、4、8、11、12、14、15、20、以及21中任一个的反义序列中的一个组成。

在另一个实施例中，dsrna包括由选自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个的序列的有义链序列组成的有义链以及由选自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21的任一个的序列的反义序列组成的反义链。

在另一个方面，本发明提供了一种包含本发明的dsrna的细胞。

在又另一个方面，本发明提供了一种编码dsrna的至少一条链的载体，其中该dsrna包括与编码serpinc1的mrna的至少一部分互补的区域，其中该dsrna是30个或更少碱基对长度，并且其中该dsrna靶向该mrna以便切割。

该互补区域可以是至少15个核苷酸长度或19至21个核苷酸长度。

在另一个方面，本发明提供了一种细胞，该细胞包括编码dsrna的至少一条链的载体，其中该dsrna包括与编码serpinc1的mrna的至少一部分互补的区域，其中该dsrna是30个或更少碱基对长度，并且其中该dsrna靶向该mrna以便切割。

在一个方面，本发明提供了包括本发明的dsrna或载体的、用于抑制serpinc1基因的表达的药物组合物。

在一个实施例中，该药用组合物进一步包括一种脂质配制品，例如一种mc3、snalp、或xtc配制品。

在另一个方面，本发明提供了抑制细胞中serpinc1表达的方法。这些方法包括：将该细胞与本发明的dsrna或载体进行接触并且维持产生的细胞一段时间，该时间足以获得serpinc1基因的mrna转录本的降解，由此抑制该细胞中serpinc1基因的表达。

该细胞可以在受试者例如人类受试者，例如患有出血性障碍例如血友病的人类受试者的体内。

在本发明的方法的一个实施例中，serpinc1表达被抑制至少大约30％、至少大约35％、至少大约40％、至少大约45％、至少大约50％、至少大约55％、至少大约60％、至少大约65％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、或至少大约99％。

在另一个方面，本发明提供了治疗患有将从减少serpinc1表达受益的障碍例如出血性障碍(例如血友病)的受试者的方法。该方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的dsrna或载体，由此治疗该受试者。

在一个方面，本发明提供了预防患有将从减少serpinc1表达受益的障碍(例如血友病)的受试者的至少一种症状(例如出血)的方法。该方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的irna(例如dsrna)或载体，由此预防患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者的至少一种症状。

该障碍可以是出血性障碍，例如血友病。

在一个实施例中，向该受试者给予该dsrna造成血液凝结的增加和/或serpinc1蛋白质表达和/或积累的减少。

在一个实施例中，该dsrna在例如该dsrna的有义链的3’末端共轭至一个配体。在一个实施例中，该配体是一种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。

在一个实施例中，将该dsrna按以下的剂量给予：大约0.01mg/kg至大约10mg/kg，例如大约0.05mg/kg至大约5mg/kg、大约0.05mg/kg至大约10mg/kg、大约0.1mg/kg至大约5mg/kg、大约0.1mg/kg至大约10mg/kg、大约0.2mg/kg至大约5mg/kg、大约0.2mg/kg至大约10mg/kg、大约0.3mg/kg至大约5mg/kg、大约0.3mg/kg至大约10mg/kg、大约0.4mg/kg至大约5mg/kg、大约0.4mg/kg至大约10mg/kg、大约0.5mg/kg至大约5mg/kg、大约0.5mg/kg至大约10mg/kg、大约1mg/kg至大约5mg/kg、大约1mg/kg至大约10mg/kg、大约1.5mg/kg至大约5mg/kg、大约1.5mg/kg至大约10mg/kg、大约2mg/kg至大约2.5mg/kg、大约2mg/kg至大约10mg/kg、大约3mg/kg至大约5mg/kg、大约3mg/kg至大约10mg/kg、大约3.5mg/kg至大约5mg/kg、大约4mg/kg至大约5mg/kg、大约4.5mg/kg至大约5mg/kg、大约4mg/kg至大约10mg/kg、大约4.5mg/kg至大约10mg/kg、大约5mg/kg至大约10mg/kg、大约5.5mg/kg至大约10mg/kg、大约6mg/kg至大约10mg/kg、大约6.5mg/kg至大约10mg/kg、大约7mg/kg至大约10mg/kg、大约7.5mg/kg至大约10mg/kg、大约8mg/kg至大约10mg/kg、大约8.5mg/kg至大约10mg/kg、大约9mg/kg至大约10mg/kg、或大约9.5mg/kg至大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以按以下剂量给予dsrna：大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在另一个实施例中，将该dsrna按以下的剂量给予：大约0.5至大约50mg/kg、大约0.75至大约50mg/kg、大约1至大约50mg/mg、大约1.5至大约50mg/kb、大约2至大约50mg/kg、大约2.5至大约50mg/kg、大约3至大约50mg/kg、大约3.5至大约50mg/kg、大约4至大约50mg/kg、大约4.5至大约50mg/kg、大约5至大约50mg/kg、大约7.5至大约50mg/kg、大约10至大约50mg/kg、大约15至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约30至大约50mg/kg、大约35至大约50mg/kg、大约40至大约50mg/kg、大约45至大约50mg/kg、大约0.5至大约45mg/kg、大约0.75至大约45mg/kg、大约1至大约45mg/mg、大约1.5至大约45mg/kb、大约2至大约45mg/kg、大约2.5至大约45mg/kg、大约3至大约45mg/kg、大约3.5至大约45mg/kg、大约4至大约45mg/kg、大约4.5至大约45mg/kg、大约5至大约45mg/kg、大约7.5至大约45mg/kg、大约10至大约45mg/kg、大约15至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约30至大约45mg/kg、大约35至大约45mg/kg、大约40至大约45mg/kg、大约0.5至大约40mg/kg、大约0.75至大约40mg/kg、大约1至大约40mg/mg、大约1.5至大约40mg/kb、大约2至大约40mg/kg、大约2.5至大约40mg/kg、大约3至大约40mg/kg、大约3.5至大约40mg/kg、大约4至大约40mg/kg、大约4.5至大约40mg/kg、大约5至大约40mg/kg、大约7.5至大约40mg/kg、大约10至大约40mg/kg、大约15至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约30至大约40mg/kg、大约35至大约40mg/kg、大约0.5至大约30mg/kg、大约0.75至大约30mg/kg、大约1至大约30mg/mg、大约1.5至大约30mg/kb、大约2至大约30mg/kg、大约2.5至大约30mg/kg、大约3至大约30mg/kg、大约3.5至大约30mg/kg、大约4至大约30mg/kg、大约4.5至大约30mg/kg、大约5至大约30mg/kg、大约7.5至大约30mg/kg、大约10至大约30mg/kg、大约15至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约25至大约30mg/kg、大约0.5至大约20mg/kg、大约0.75至大约20mg/kg、大约1至大约20mg/mg、大约1.5至大约20mg/kb、大约2至大约20mg/kg、大约2.5至大约20mg/kg、大约3至大约20mg/kg、大约3.5至大约20mg/kg、大约4至大约20mg/kg、大约4.5至大约20mg/kg、大约5至大约20mg/kg、大约7.5至大约20mg/kg、大约10至大约20mg/kg、或大约15至大约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以给予受试者治疗量的irna，例如大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

该dsrna(例如共轭至一个配体)可以给予该受试者一周一次或一个月两次。

在另一个方面，本发明提供了抑制受试者中serpinc1表达的方法。该方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的dsrna或载体，由此抑制受试者中serpinc1表达。

在一个实施例中，该dsrna在例如该dsrna的有义链的3’末端共轭至一个配体。在一个实施例中，该配体是一种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。

在一个实施例中，将该dsrna按以下的剂量给予：大约0.01mg/kg至大约10mg/kg，例如大约0.05mg/kg至大约5mg/kg、大约0.05mg/kg至大约10mg/kg、大约0.1mg/kg至大约5mg/kg、大约0.1mg/kg至大约10mg/kg、大约0.2mg/kg至大约5mg/kg、大约0.2mg/kg至大约10mg/kg、大约0.3mg/kg至大约5mg/kg、大约0.3mg/kg至大约10mg/kg、大约0.4mg/kg至大约5mg/kg、大约0.4mg/kg至大约10mg/kg、大约0.5mg/kg至大约5mg/kg、大约0.5mg/kg至大约10mg/kg、大约1mg/kg至大约5mg/kg、大约1mg/kg至大约10mg/kg、大约1.5mg/kg至大约5mg/kg、大约1.5mg/kg至大约10mg/kg、大约2mg/kg至大约2.5mg/kg、大约2mg/kg至大约10mg/kg、大约3mg/kg至大约5mg/kg、大约3mg/kg至大约10mg/kg、大约3.5mg/kg至大约5mg/kg、大约4mg/kg至大约5mg/kg、大约4.5mg/kg至大约5mg/kg、大约4mg/kg至大约10mg/kg、大约4.5mg/kg至大约10mg/kg、大约5mg/kg至大约10mg/kg、大约5.5mg/kg至大约10mg/kg、大约6mg/kg至大约10mg/kg、大约6.5mg/kg至大约10mg/kg、大约7mg/kg至大约10mg/kg、大约7.5mg/kg至大约10mg/kg、大约8mg/kg至大约10mg/kg、大约8.5mg/kg至大约10mg/kg、大约9mg/kg至大约10mg/kg、或大约9.5mg/kg至大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以按以下剂量给予dsrna：大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在另一个实施例中，将该dsrna按以下的剂量给予：大约0.5至大约50mg/kg、大约0.75至大约50mg/kg、大约1至大约50mg/mg、大约1.5至大约50mg/kb、大约2至大约50mg/kg、大约2.5至大约50mg/kg、大约3至大约50mg/kg、大约3.5至大约50mg/kg、大约4至大约50mg/kg、大约4.5至大约50mg/kg、大约5至大约50mg/kg、大约7.5至大约50mg/kg、大约10至大约50mg/kg、大约15至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约30至大约50mg/kg、大约35至大约50mg/kg、大约40至大约50mg/kg、大约45至大约50mg/kg、大约0.5至大约45mg/kg、大约0.75至大约45mg/kg、大约1至大约45mg/mg、大约1.5至大约45mg/kb、大约2至大约45mg/kg、大约2.5至大约45mg/kg、大约3至大约45mg/kg、大约3.5至大约45mg/kg、大约4至大约45mg/kg、大约4.5至大约45mg/kg、大约5至大约45mg/kg、大约7.5至大约45mg/kg、大约10至大约45mg/kg、大约15至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约30至大约45mg/kg、大约35至大约45mg/kg、大约40至大约45mg/kg、大约0.5至大约40mg/kg、大约0.75至大约40mg/kg、大约1至大约40mg/mg、大约1.5至大约40mg/kb、大约2至大约40mg/kg、大约2.5至大约40mg/kg、大约3至大约40mg/kg、大约3.5至大约40mg/kg、大约4至大约40mg/kg、大约4.5至大约40mg/kg、大约5至大约40mg/kg、大约7.5至大约40mg/kg、大约10至大约40mg/kg、大约15至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约30至大约40mg/kg、大约35至大约40mg/kg、大约0.5至大约30mg/kg、大约0.75至大约30mg/kg、大约1至大约30mg/mg、大约1.5至大约30mg/kb、大约2至大约30mg/kg、大约2.5至大约30mg/kg、大约3至大约30mg/kg、大约3.5至大约30mg/kg、大约4至大约30mg/kg、大约4.5至大约30mg/kg、大约5至大约30mg/kg、大约7.5至大约30mg/kg、大约10至大约30mg/kg、大约15至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约25至大约30mg/kg、大约0.5至大约20mg/kg、大约0.75至大约20mg/kg、大约1至大约20mg/mg、大约1.5至大约20mg/kb、大约2至大约20mg/kg、大约2.5至大约20mg/kg、大约3至大约20mg/kg、大约3.5至大约20mg/kg、大约4至大约20mg/kg、大约4.5至大约20mg/kg、大约5至大约20mg/kg、大约7.5至大约20mg/kg、大约10至大约20mg/kg、或大约15至大约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以给予受试者治疗量的irna，例如大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

该dsrna(例如共轭至一个配体)可以给予该受试者一周一次或一个月两次。

在又另一个方面，本发明提供用于执行本发明的方法的试剂盒。在一个方面，本发明提供了通过将细胞与有效于抑制该细胞中serpinc1基因表达的量的双链rnai剂接触，用于执行抑制细胞中serpinc1表达的方法。该试剂盒包括一种rnai剂和用于使用的说明书和任选地用于将该rnai剂给予受试者的装置。

具体地，本申请涉及以下各项：

1.一种用于抑制serpinc1表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包括有义链和反义链，其中所述有义链包括与seqidno：1的核苷酸序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与seqidno：5的核苷酸序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。

2.一种用于抑制serpinc1表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包括有义链和反义链，该反义链包括一个互补区域，该互补区域包括与表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个列出的反义序列中的任意一个差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。

3.如第2项所述的dsrna，其中该有义和反义链包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：ad-50487.1、ad-50477.1、ad-50483.1、ad-50475.1、ad-50495.1、ad-50476.1、ad-50499.1、ad-50478.1、ad-50489.1、ad-50501.1、ad-50507.1、ad-50484.1、ad-50515.1、ad-50540.1、ad-50528.1、ad-50549.1、ad-50539.1、ad-50534.1、ad-50527.1、ad-50514.1、ad-50509.1、ad-50529.1、以及ad-54944，以及表3、4、8、11、12、14、15、20、以及21中任一个列出的序列中的任一个。

4.如第1或2项所述的dsrna，其中所述dsrna包括至少一个经修饰的核苷酸。

5.如第4项所述的dsrna，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-o-甲基修饰的核苷酸、包括5′-硫代磷酸基团的核苷酸、和与胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。

6.如第4项所述的dsrna，其中所述经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸、以及包括非天然碱基的核苷酸。

7.如第2项所述的dsrna，其中该互补区域是至少17个核苷酸长度。

8.如第2项所述的dsrna，其中该互补区域是在19个和21个核苷酸长度之间。

9.如第8项所述的dsrna，其中该互补区域是19个核苷酸长度。

10.如第1或2项所述的dsrna，其中每条链不多于30个核苷酸长度。

11.如第1或2项所述的dsrna，其中至少一条链包括至少1个核苷酸的3′突出端。

12.如第1或2项所述的dsrna，其中至少一条链包括至少2个核苷酸的3′突出端。

13.如第1或2项所述的dsrna，进一步包括配体。

14.如第13项所述的dsrna，其中该配体共轭至该dsrna的有义链的3′末端。

15.如第13项所述的dsrna，其中该配体是一种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。

16.如第15项所述的dsrna，其中该配体是

17.如第15项所述的dsrna，其中该dsrna共轭至以下示意图中所示的配体

并且其中x是o或s。

18.如第17项所述的dsrna，其中x是o。

19.如第2项所述的dsrna，其中该互补区域由表3、4、8、11、12、14、15、20、以及21中任一个的反义序列中的一个组成。

20.如第1或2项所述的dsrna，其中该dsrna包括由选自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个的序列的有义链序列组成的有义链以及由选自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21的任一个的序列的反义序列组成的反义链。

21.一种细胞，含有如第1或2项所述的dsrna。

22.一种编码dsrna的至少一条链的载体，其中所述dsrna包括与编码serpinc1的mrna的至少一部分互补的一个区域，其中所述dsrna是30个或更少碱基对长度，并且其中所述dsrna靶向所述mrna以便切割。

23.如第22项所述的载体，其中该互补区域是至少15个核苷酸长度。

24.如第22项所述的载体，其中该互补区域是19个至21个核苷酸长度。

25.一种细胞，包括如第22项所述的载体。

26.一种药物组合物，用于抑制serpinc1基因表达，该药物组合物包括第1或2项所述的dsrna或第22项所述的载体。

27.一种抑制细胞中serpinc1表达的方法，该方法包括：

(a)使该细胞与第1或2项所述的dsrna或第22项所述的载体进行接触；并且

(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得serpinc1基因的mrna转录本的降解，由此抑制该细胞中的serpinc1基因的表达。

28.如第27项所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。

29.如第28项所述的方法，其中该受试者为人类。

30.如第29项所述的方法，其中该人类受试者患有出血性障碍。

31.如第30项所述的方法，其中该出血性障碍是血友病。

32.如第27-31项中任一项所述的方法，其中该serpinc1表达被抑制至少约30％。

33.一种用于治疗患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如第1或2项所述的dsrna或如第22项所述的载体，由此治疗所述受试者。

34.一种用于预防患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者的至少一种症状的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如第1或2项所述的dsrna或如第22项所述的载体，由此预防患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者的至少一种症状。

35.如第33或34项所述的方法，其中该障碍是一种出血性障碍。

36.如第35项所述的方法，其中该出血性障碍是血友病。

37.如第33或34项所述的方法，其中向该受试者给予该dsrna造成血液凝结的增加和/或serpinc1蛋白质积累的减少。

38.如第33或34项所述的方法，其中该dsrna共轭至一个配体。

39.如第38项所述的方法，其中该配体共轭至该dsrna的有义链的3’末端。

40.如第39项所述的方法，其中该配体是一种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。

41.如第34项所述的方法，其中将该dsrna以大约0.01mg/kg至大约10mg/kg或大约0.5mg/kg至大约50mg/kg的剂量给予。

42.如第41项所述的方法，其中将该dsrna以大约10mg/kg至大约30mg/kg的剂量给予。

43.如第41项所述的方法，其中将该dsrna以选自下组的剂量给予，该组由以下各项组成：0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、以及30mg/kg。

44.如第42或43项所述的方法，其中将该dsrna每周给予该受试者一次。

45.如第42或43项所述的方法，其中将该dsrna每月给予该受试者两次。

46.如第33或34项所述的方法，进一步包括测量所述受试者体内的凝血酶水平。

47.如第34或35项所述的方法，其中将该dsrna以大约0.5mg/kg至大约5mg/kg的周累积剂量皮下给予该受试者，并且其中该dsrna是ad-57213。

48.一种抑制受试者体内serpinc1的表达的方法，该方法包括

向所述受试者给予治疗有效量的如第1或2项所述的dsrna或如第22项所述的载体，由此抑制所述受试者体内serpinc1的表达。

49.如第48项所述的方法，其中该dsrna共轭至一个配体。

50.如第49项所述的方法，其中该配体共轭至该dsrna的有义链的3’末端。

51.如第50项所述的方法，其中该配体是一种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。

52.如第48项所述的方法，其中将该dsrna以大约0.01mg/kg至大约10mg/kg或大约0.5mg/kg至大约50mg/kg的剂量给予。

53.如第52项所述的方法，其中将该dsrna以大约10mg/kg至大约30mg/kg的剂量给予。

54.如第52项所述的方法，其中将该dsrna以选自下组的剂量给予，该组由以下各项组成：1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、以及30mg/kg。

55.如第54项所述的方法，其中将该dsrna每周给予该受试者一次。

56.如第54项所述的方法，其中将该dsrna每月给予该受试者两次。

57.如第48项所述的方法，其中将该dsrna以大约0.5mg/kg至大约5mg/kg的周累积剂量皮下给予该受试者，并且其中该dsrna是ad-57213。

58.如第48项所述的方法，进一步包括测量所述受试者体内的凝血酶水平。

附图说明

图1是该凝血级联的示意图。

图2a和2b是显示在单剂量的指定irna之后hep3b细胞中serpinc1表达的抑制的图。

图3a和3b是显示在单剂量的如指定的ad-50509或ad-1955的lnp配制品之后cd-1小鼠中serpinc1mrna(a)和蛋白(b)表达的抑制的图。

图4a和4b是显示在单次1mg/kg剂量的ad-50509或ad-1955的lnp配制品之后cd-1小鼠中serpinc1mrna(a)和蛋白(b)表达的抑制持续时间的图。图4c是显示在单次1mg/kg剂量的ad-50509或ad-1955的lnp配制品之后cd1小鼠中serpinc1活性和serpinc1蛋白表达的抑制的图。

图5是显示在单次10mg/kg剂量的指定的共轭至galnac的irna之后serpinc1mrna和蛋白水平的敲低百分比的图。

图6是显示在单次5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、和75mg/kg和5x5mg/kg的重复剂量的共轭至galnac的ad-54944之后c57bl/6小鼠中serpinc1蛋白表达的抑制的图。

图7a和7b是显示重复给予galnac共轭的ad-54944对c57bl/6小鼠中serpinc1蛋白表达的抑制的持续时间的影响的图。

图8和9是显示分开给药方案对给予galnac共轭的ad-54944对c57bl/6小鼠中serpinc1蛋白表达的沉默的持续时间的影响的图。

图10a和10b是显示在单次10mg/kg(a)或3mg/kg(b)剂量的指定的共轭至galnac的irna之后serpinc1蛋白水平的敲低百分比的图。

图11是显示在单次10mg/kg或3mg/kg剂量的指定的共轭至galnac的irna之后serpinc1蛋白水平的敲低百分比的图。

图12是显示在单次10mg/kg或3mg/kg剂量的指定的共轭至galnac的irna之后serpinc1活性的敲低百分比的图。

图13是显示响应于单剂量的ad-57213的剂量效应的图。

图14是显示血友病a小鼠在单次的1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg剂量的ad-57213之后的serpinc1沉默的持续时间的图。

图15是显示c57bl/6小鼠在单次的30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、以及0.3mg/kg剂量的ad-57213之后的serpinc1mrna表达的抑制的图。

图16a-16c是显示在如指定的单剂量的ad-57213(a)、ad-57205(b)、以及ad-57214(c)之后的serpinc1沉默的持续时间的图。

图17-19是显示指定的分开给药方案对给予galnac共轭的ad-57213的c57bl/6小鼠中的serpinc1蛋白表达的沉默的持续时间的影响的图。

图20是显示指定的化合物的单剂量筛选对非人类灵长动物中serpinc1蛋白表达持续时间的影响的图。

图21是显示共轭至galnac的ad-57213的单剂量筛选对非人类灵长动物中serpinc1蛋白表达持续时间的影响的图。

图22是显示指定的化合物的单剂量筛选对非人类灵长动物中serpinc1蛋白表达持续时间的影响的图。

图23是显示单剂量的化合物ad-57213对非人类灵长动物中血清抗凝血酶(serpinc1)水平的影响的图。

图24a-24d是显示单剂量的按a)1mg/kg、b)3mg/kg、c)10mg/kg、以及d)30mg/kg的化合物ad-57213对非人类灵长动物中血清抗凝血酶(serpinc1)水平和血浆凝血酶峰值水平成倍改变之间的关系的影响的图。凝血酶峰值的成倍改变是在次y-轴(灰色)上描绘的并且相对抗凝血酶水平是在主y-轴(黑色)上描绘的。

图25是显示ad-57213的影响，为作为相对抗凝血酶(serpinc1)沉默的函数的凝血酶峰值的成倍改变的增加。

图26a和26b是显示多剂量给予serpinc1sirna(0.5mg/kgqw、1mg/kgq2w、1.5mg/kgqw、3mg/kgq2w)对非人类灵长动物中血清抗凝血酶水平的影响的图。数据点代表组平均值，误差条代表标准差(n＝3)。(qw＝每周；q2w＝每隔一周)。

图27a和27b是显示非人类灵长动物中serpinc1沉默的累积影响的图。

图28a是显示在微管激光伤之后serpinc1沉默对血小板积聚的影响的图。该图显示来自所有强加伤害的中值。

图28b是显示在微管激光伤之后serpinc1沉默对纤蛋白区域的影响的图。该图显示来自所有强加伤害的中值。

图29是显示在给予配制为脂质核酸颗粒的化合物ad-57213之后serpinc1沉默的持续时间的图。

图30a显示智人(homosapiens)serpin肽酶抑制剂，进化枝c(抗凝血酶)，成员1(serpinc1)的核苷酸序列(seqidno：1)；图30b显示恒河猴(macacamulatta)serpin肽酶抑制剂，进化枝c(抗凝血酶)，成员1(serpinc1)的核苷酸序列(seqidno：2)；图30c显示小家鼠(musmusculus)丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制剂，进化枝c(抗凝血酶)，成员1(serpinc1)的核苷酸序列(seqidno：3)；图30d显示褐家鼠(rattusnorvegicus)serpin肽酶抑制剂，进化枝c(抗凝血酶)，成员1(serpinc1)的核苷酸序列(seqidno：4)；图30e显示seqidno：1的反向互补序列(seqidno：5)；图30f显示seqidno：2的反向互补序列(seqidno：6)；图30g显示seqidno：3的反向互补序列(seqidno：7)；图30h显示seqidno：4的反向互补序列(seqidno：8)；并且图30i显示示例性疏水含mts肽，rfgf(seqidno：9)；示例性rfgf类似物的氨基酸序列(seqidno：10)；hivtat蛋白的氨基酸序列(seqidno：11)；果蝇触角足蛋白的氨基酸序列(seqidno：12)；以及示例性的基于肽的可切割的连接基团的氨基酸序列。

图31a和31b是描绘了以下的图：抗凝血酶减少增加了耗尽ix因子的人类血浆的体外的凝血酶产生。

具体实施方式

本发明提供了irna组合物，该irna组合物影响serpinc1基因的rna转录本的rna诱导沉默复合体(risc)介导的切割。该serpinc1基因可以在细胞例如受试者(例如人)体内的细胞的内部。本发明还提供了一种使用本发明的irna组合物来抑制serpinc1基因表达和/或治疗患有将从抑制或减少serpinc1表达受益的障碍例如出血性障碍(例如血友病)的受试者的方法。本发明进一步提供了预防至少一种症状的方法，例如患有将从抑制或减少serpinc1基因表达受益的障碍的受试者的出血，例如出血性障碍，如血友病。

本发明的irna包括具有下述区域的rna链(反义链)，该区域是30个或者更少核苷酸长度，例如15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸，与serpinc1基因的mrna转录本的至少部分基本上互补。这些irna的使用使得靶向降解哺乳动物中的serpinc1基因的mrna成为可能。具体地，非常低剂量的serpinc1irna可以特别且高效地介导rna干扰(rnai)，导致serpinc1基因表达的显著抑制。发明人已经展示靶向serpinc1的irna可以在体内和体外介导rnai，导致serpinc1基因表达的显著抑制。因此，含有这些irna的方法和组合物用于治疗将从serpinc1蛋白水平和/或活性减少获益的受试者，例如用于治疗患有出血性障碍，如血友病的受试者。

以下说明详述披露了怎样制备和使用含有irna的组合物以抑制serpinc1基因表达，以及用于治疗患有将从这种基因表达的抑制和/或减少获益的疾病和病症的受试者的组合物，用途，和方法。

i.定义

为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当一个值或一个参数的取值范围是列举的，其目的是表明这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在此处使用的冠词“一个”和“一种”(“a”和“an”)是指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素，例如多个元素。

术语“包括(including)”用在此处是指短语“包括但不限于”并且与之互换使用。

术语“或(or)”用在此处是指术语“和/或”并且与之互换使用，除非语境清楚的另外指明。

如在本文中所使用的“serpinc1”是指细胞中表达一种特定多肽。serpinc1也称为serpin肽酶抑制剂，进化枝c(抗凝血酶)，成员1；抗凝血酶iii；at3；抗凝血酶；和肝素辅因子1。人类的serpinc1mrna转录本序列可见于，例如genbank登录号gi：254588059(nm_000488；seqidno：1)。恒河猴的serpinc1mrna序列可见于，例如genbank登录号gi：157167169(nm_001104583；seqidno：2)。小鼠的serpinc1mrna序列可见于，例如genbank登录号gi：237874216(nm_080844；seqidno：3)。大鼠的serpinc1mrna序列可见于，例如genbank登录号gi：58865629(nm_001012027；seqidno：4)。

在此处使用的术语“serpinc1”也指一种由serpinc1基因的天然发生的dna序列变体在细胞中表达的具体多肽，例如serpinc1基因的单核苷酸多态性。serpinc1基因内的众多snp已经被鉴别并且可见于，例如ncbidbsnp(参见，例如www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。serpinc1基因内的snp的非限制实例可见于ncbidbsnp登录号rs677；rs5877；rs5878；rs5879；rs941988；rs941989；rs1799876；rs19637711；rs2008946；以及rs2227586。

如在此所使用的，“靶标序列”是指在serpinc1基因的转录期间形成的mrna分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的rna加工产物的mrna。在一个实施例中，序列的靶标部分将至少足够地长，以在serpinc1基因的转录期间形成的mrna分子的核苷酸序列部分处或其附近充当irna指导的切割的底物。

靶标序列可以是从大约9-36个核苷酸长度，例如大约15-30个核苷酸长度。例如靶标序列可以是从大约15-30个核苷酸，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。

如在此所使用的，术语“含有序列的链”是指含有由相当于使用标准核苷酸命名法描述的序列的核苷酸链的寡核苷酸。

“g”、“c”、“a”、“t”以及“u”每一者通常分别代表包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分(参见，如表2)。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如非限制性地，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包括腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明表征的dsrna的核苷酸序列中由含有例如肌苷的核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别地替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与靶mrna的g-u摇摆碱基配对。含有这类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物和方法。

术语“irna”，“rnai剂，”“irna剂，”，“rna干扰剂”在此可互换使用，是指在此所定义的术语包含rna剂，并且介导通过rna诱导沉默复合物(risc)途径的rna转录本靶向切割。irna通过已知为rna干扰(rnai)的过程指导mrna的序列特异性降解。irna调节，例如抑制，serpinc1在细胞中的表达，如受试者的细胞，如哺乳动物受试者内。

在一个实施例中，本发明的rnai剂包括与靶rna序列，例如serpinc1靶mrna序列相互作用以指导靶rna切割的单链rna。不希望受理论约束，认为引入细胞中长的双链rna由称作dicer的iii型核酸内切酶分解成sirna(夏普(sharp)等人，基因与发育(genesdev.)2001，15：485)。dicer(核糖核酸酶-iii样酶)将dsrna加工成至具有特征性双碱基3′突出端的19-23碱基对短干扰性rna(伯恩斯坦(bernstein)等人，(2001)自然(nature)409：363)。这些sirna随后掺入rna诱导沉默复合物(risc)中，在其中一种或多种解旋酶解开sirna双链体，这使得互补性反义链指导靶识别成为可能(尼坎宁(nykanen)等人，(2001)细胞(cell)107：309)。一旦与适宜的靶mrna结合，risc内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(巴希尔(elbashir)等人，(2001)基因与发育(genesdev.)15：188)。因此，在一个方面，本发明涉及促进实现靶基因(如serpinc1基因)沉默的risc复合物形成的、产生于一个细胞内的单链rna。所以，术语“sirna”还可以在此用作指代以上所述的rnai。

在另一个实施例中，rnai剂可以是引进细胞或生物体内以抑制靶mrna的单链sirna。单链sirna通常是指15-30核苷酸并且是化学修饰的。单链sirna的设计和测试描述于美国专利号8,101,348以及利马(lima)等人，(2012)细胞(cell)150：883-894，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。在此处描述的任何反义核苷酸序列可以用做在此描述的或在利马(lima)等人，(2012)细胞(cell)150；：883-894所描述的方法化学修饰的单链sirna。

在另一个方面中，该剂是指通过反义抑制机理抑制靶标的单链反义rna分子。单链反义rna分子是与靶标mrna之内的一个序列互补的。反义rna能以化学计量的方式通过与该mrna碱基配对并且物理性地阻碍翻译机器来抑制翻译，参见蒂尔斯(dias)，n.等人，(2002)分子癌症治疗学(mol.cancerther.)1：347-355。可替代地，单链反义rna分子通过与靶标杂交以及经由一种rnaseh切割事件切割该靶标来抑制靶mrma。单链的反义rna分子可以是大约15至大约30个核苷酸长度并且具有与靶标序列互补的一个序列。例如该单链的反义rna分子可以包括以下这样一个序列：该序列是来自任一表3、4、8、11、12、14、15、20或21的反义序列之一的至少大约15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。

在另一个实施例中，本发明组合物、用途、和方法中使用的“irna”是双链rna，并且在此是指“双链rnai剂”、“双链rna(dsrna)分子”、“dsrna剂”、或“dsrna”。术语“dsrna”，是指核糖核酸分子的复合体，其具有双链结构，包括两条反向平行的和基本上互补的核酸链，被称为相对于靶rna，即serpinc1基因，具有“有义的”和“反义的”定向。在本发明的一些实施例中，双链rna(dsrna)通过转录后基因沉默机制(在此是指rna干扰或rnai)引发靶rna，如mrna，的降解。

双链区域可以是允许在risc途径中期望靶rna特异降解的任何长度，并且长度可以是从大约9至36碱基对，例如约15-30个碱基对长度，例如约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、和21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36个碱基对长度，如约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。

形成双链结构的两条链可以是一个更大rna分子的不同部分，或者它们可以是单独的rna分子。在这两条链是一个更大分子的部分并且因此通过一条链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链而连接的情况下，该连接的rna链称作“发夹环”。发夹环可以包括至少一个非配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个非配对的核苷酸。

当dsrna的两个基本上互补的链包含分离的rna分子时，这些分子不是必须的，但是可以共价地连接。在这两条链是通过除了一条链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链以外的方式而共价连接的情况下，该连接结构称作“连接物(linker)”。这些rna链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsrna的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双链体中的任何突出。除了双链结构，一个rnai可以包括一个或多个核苷酸突出。

如在此所使用的，术语“核苷酸突出”是指至少一个非配对的核苷酸，其从irna的双链体结构(例如，dsrna)突出。例如当dsrna的一条链的3′-端延伸超过另一条链的5′-端时或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsrna可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，该突出端可以包括至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个或更多个核苷酸。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于有义链、反义链或其任意组合上。另外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsrna的反义或有义链的5′末端、3′末端或两个末端上。

在一个实施例中，dsrna的反义链在3′-末端和/或5′-末端具有一个1-10核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的突出端。在一个实施例中，dsrna的有义链在3′-末端和/或5′-末端具有一个1-10核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的突出端。在另一个实施例中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。

关于dsrna，在此使用的“平端”或“平末端”是指在dsrna的给定的末端没有非配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出。dsrna的一个或两个末端可以是齐平的。当dsrna的两个末端都是平末端，该dsrna被称为平末端的。要明确，一个“平端的”dsrna是指两个末端都是平端化的dsrna，即，在该分子的任何一端都没有核苷酸突出。大多数情况下，这种分子将在其整个长度范围内是双链的。

术语“反义链”或“引导链”是指irna(如dsrna)的链，该链包括基本上与一个靶标序列互补的区域，如serpinc1mrna。如在此所使用的，术语“互补性区域”是指该反义链上基本上与一个序列互补的区域，例如在此定义的一个靶标序列，如serpinc1核苷酸序列。在互补区域不与靶标序列完全互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内。通常，最耐受的错配存在于末端区域内，例如在irna的5′-和/或3′-末端的5、4、3或2个核苷酸内部。

如在此所使用的，术语“有义链”或“随从链”是指含有与在此所定义的术语的反义链区域基本上互补的区域的irna链。

如在此所使用的，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，是指含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如本领域技术人员所理解。这类条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mmnacl，40mmpipes，ph6.4，1mmedta，50℃或70℃持续12-16小时，随后洗涤(参见例如“分子克隆：实验室手册(molecularcloning：alaboratorymanual)，萨拉布鲁克(sambrook)等人(1989)冷泉港实验室出版社)。可以使用其他条件，如在如生物内部可能遭遇的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定两序列互补测试的最适条件集。

在irna内部(例如在如本文所述的dsrna内部)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度范围内的碱基配对。此类序列在此可以称作相对于彼此“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交成多达30个碱基对的双链时形成一个或多个，但是总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如通过risc途径抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出的情况下，此类突出不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如出于在此描述的目的，以下这样一种dsrna也可以称作“完全互补”：该dsrna包括长度为21个核苷酸的一个寡核苷酸以及长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列。

如在此使用的，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于g：u摇摆碱基配对或hoogstein碱基配对。

本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsrna的有义链与反义链之间，或irna剂的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。

如在此使用的，与信使rna(mrna)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸指与感兴趣的mrna(例如编码serpinc1的mrna)的一个连续部分基本互补的多核苷酸。例如如果一种多核苷酸与编码serpinc1的mrna的非间断部分基本上互补，则该序列与serpinc1mrna的至少一部分互补。

总体上，每一链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两条链的每一者或两者还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如一种脱氧核糖核苷酸和/或一种经修饰的核苷酸。此外，“irna”可以包括化学修饰的核糖核苷酸。这些修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。如在irna分子中所使用的任何此类修饰被“irna”所囊括用于本说明书以及权利要求书的目的。

在此使用的术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。

在此处使用的短语“抑制serpinc1的表达”包括抑制任何serpinc1基因的表达(例如小鼠的serpinc1基因，大鼠的serpinc1基因，猴子的serpinc1基因，或人的serpinc1基因)以及编码serpinc1蛋白的serpinc1基因的变型或突变型。

“抑制serpinc1基因表达”包括任何水平的serpinc1基因的抑制，例如至少部分抑制serpinc1基因的表达，如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。

serpinc1基因的表达可以基于与serpinc1基因表达有关的任何变量的水平进行评估，例如serpinc1mrna水平，serpinc1蛋白水平，或例如凝血酶：抗凝血酶复合物水平，作为凝血酶生成潜力、出血时间、凝血酶原时间(pt)、血小板计数、和/或活化部分凝血活酶时间(aptt)的测量。抑制可通过这些变量中的一个或多个与对照水平相比的绝对或相对水平的减少来评估。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。

在一个实施例中，对serpinc1基因的表达的至少部分的压制是通过以下评估：可从serpinc1基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过处理由此serpinc1基因的表达被抑制)中分离的或检测到的serpinc1mrna的量减少，这是与一个第二细胞或一组第二细胞(对照细胞)相比，该一个第二细胞或一组第二细胞与该一个第一细胞或一组第一细胞基本上相同，除了未经受如此的处理。抑制程度可如以下表示

(对照细胞中的mrna)-(所处理的细胞中的mrna)·100％

(对照细胞中的mrna)

如此处使用的短语“使细胞接触rnai剂”(如一种dsrna)包括通过任何可能的手段接触细胞。使细胞接触rnai剂包括在体外使细胞接触irna或在体内使细胞接触irna。该接触可以直接或间接地进行。因此，例如rnai剂可通过执行该方法的个体与细胞的物理接触，或者可替代地，rnai剂可进入许可或导致它后来接触到该细胞的一种情况。

在体外接触细胞可通过例如用该rnai剂孵育该细胞来进行。体内接触细胞可以通过以下进行，例如通过将rnai剂注入该细胞所在的组织或其附近，或通过将rnai剂注入另一个区域例如血流或皮下空间，这样该药剂将随后到达待要接触的细胞所在的组织。例如该rnai剂可包含和/或被偶联到一个配体，例如galnac3，其用来将rnai剂引导到感兴趣的位点例如肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如也可以在体外用rnai剂接触细胞，并随后移植入受试者。

在一个实施例中，使细胞与一种irna接触包括通过促进或实现摄取或吸收入细胞来将该irna“引入”或“递送到该细胞”。吸收或摄取irna可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。向细胞中引入irna可以在体外和/或体内进行。例如对于体内引入，可以将irna注射到组织位点中或全身施用。体内递送也可以由β-葡聚糖递送系统来进行，例如在美国专利号5,032,401和5,607,677和美国公开号2005/0281781(特此将其全部内容通过引用结合在此)中所述的那些。体外引入细胞内包括本领域内已知的方法，例如电穿孔以及脂质转染法。其他方案在下文描述和/或是本领域已知的。

术语“脂质纳米颗粒”或“lnp”是包括封装一种药物活性分子(如核酸分子，例如irna或irna从其中转录的质粒)的脂质层的一种囊泡。lnp描述在例如美国专利号6,858,225、6,815,432、8,158,601和8,058,069中，特此将其全部内容通过引用结合在此。

术语“snalp”指一种稳定的核酸-脂质颗粒。snalp是包覆缩减的水性内部的脂质的囊泡，该水性内部包括一种核酸，如irna或irna从其中转录的质粒。snalp描述在例如美国专利申请公开号20060240093、20070135372以及国际申请号wo2009082817，特此将其全部内容通过引用结合在此。下文描述了“snalp”配制品的实例。

如此处使用的，“受试者”是动物，例如哺乳动物，包括灵长类动物(如人、非人灵长类动物(例如猴子和黑猩猩))、非灵长类(如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马、以及鲸)、或鸟(如鸭或鹅)。在一个实施例中，该受试者是人，例如正针对一种疾病、障碍或病症进行治疗或评估的、将从减少serpinc1表达受益的人；处于对一种疾病、障碍或病症的风险中的、将从减少serpinc1表达受益的人；患有一种疾病、障碍或病症的、将从减少serpinc1表达受益的人；和/或如此处所述的正针对一种疾病、障碍或病症进行治疗的、将从减少serpinc1表达受益的人。如此处使用的，术语“治疗(treating或treatment)”是指一种有益的或希望的结果，包括但不限于减轻或改善一种或多种症状、缩小出血程度，稳定(即不恶化)出血状态，改善或缓和出血，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可是指与不存在治疗情况下的预期存活相比，延长存活。

在疾病标志物或症状的语境中的“更低”是指此类水平的统计学上显著的下降。下降可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降至作为不患这种病症的个体的正常范围内所接受的水平。

如此处使用的“预防(prevention或preventing)”在提及将从减少serpinc1基因表达受益的一种疾病、障碍或病症而使用时，是指受试者发展与此类疾病、障碍或病症相关的一个症状(例如像出血的一种症状)的可能性的减少。发展出血的可能性被减少，例如对出血具有一个或多个风险因子的个体要么没有发展出血要么发展的出血相对于具有相同风险因子且未接受如此处所述的治疗的群体具有更低的严重度。没有发展一种疾病、障碍或病症，或者减少发展与该疾病、障碍或病症相关的症状(例如在临床上接受的比例上，针对该疾病或病症减少至少约10％)，或表现出症状延迟(如延迟数天、周、月或年)被认为是有效的预防。

如在此使用的，术语“出血性障碍”是导致差的凝血和/或过量出血的一种疾病或病症。出血性障碍可以是一种遗传性障碍(如血友病或冯·威利布兰德疾病)，或与例如弥散性血管内凝血、妊娠子痫、维生素k缺乏症、自身免疫性疾病、炎症性肠疾病、溃疡性结肠炎相关的一种获得性疾病，一种皮肤紊乱(例如银屑病、天疱疮)，一种呼吸疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病)，一种过敏性药物反应，例如药物(如阿司匹林，肝素、以及华法林)治疗的结果，糖尿病，急性乙型肝炎感染，急性丙型肝炎感染，一种恶性肿瘤或实体瘤(例如前列腺的、肺的、结肠的、胰腺的、胃的、胆管的、头和颈的、宫颈的、乳腺的、黑色素瘤、肾的、和/或血液系统的恶性肿瘤)。在一个实施例中，遗传性出血性障碍是血友病，例如血友病a、b、或c。在一个实施例中，患有遗传性出血性障碍(例如血友病)的受试者已经发展了抑制剂，例如，同种抗体抑制剂来代替凝血疗法并且在此称作“抑制剂受试者”。在一个实施例中，该抑制剂受试者患有血友病a。在另一个实施例中，该抑制剂受试者患有血友病b。在又另一个实施例中，该抑制剂受试者患有血友病c。

如此处使用的，“治疗有效量”旨在包括当给予患有出血性障碍和出血的受试者时足以实现对该疾病的治疗(例如通过缩小、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)的rnai试剂的量。该“治疗有效量”可以根据rnai剂而变化，怎么给予该剂，疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、在前或同时治疗(如果有)的类型及其他个体特征。

如此处使用的，“预防有效量”旨在包括当给予患有出血性障碍但未出血的受试者(例如患有出血性障碍和预定手术的受试者)时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的rnai剂的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或减少后发疾病的严重度。该“预防有效量”可以根据该irna而变化，怎么给予该药剂，疾病的风险的程度以及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、在前或同时治疗(如果有)的类型及其他个体特征。

“治疗有效量”或“预防有效量”还包括在合理的适用于任何治疗的效益/风险比下产生一些希望的局部或全身效果的rnai剂的量。在本发明的方法中使用的irna能以足够于产生适用于这种治疗的合理的效益/风险比的量给予。

此处使用的短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在正确医学判断范围内，适合于接触人类受试者和动物受试者的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。

如此处使用的，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运送到身体的另一个器官或部分)。在与该配制品的其他成分相容并且对所治疗的受试者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，如血清白蛋白、hdl和ldl；以及(22)在药物配制品中使用的其他非毒性相容物质。

如此处使用的，术语“样品”包括从受试者体内分离的类似的流体、细胞、或组织，以及受试者体内存在的流体、细胞、或组织的一个集合。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊髓液、眼内液(ocularfluid)、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可源自于肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如肝上皮实质细胞)。在一些实施例中，“源自受试者的样品”是指取自于该受试者的血液或血浆。

ii.本发明的irna

此处描述了抑制serpinc1基因的表达的irna。在一个实施例中，该irna剂包括双链核糖核酸(dsrna)分子，这些分子用于抑制serpinc1基因在细胞、例如患有出血性障碍(例如遗传性出血性障碍)的受试者(例如哺乳动物，例如人)体内的细胞中的表达。dsrna包含反义链，该反义链具有与serpinc1基因表达中形成的mrna的至少一部分互补的互补区域。互补性区域是约30个核苷酸或更小的长度(例如约30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个或18个核苷酸或更小的长度)。当与表达serpinc1基因的细胞接触时，该irna将该serpinc1基因(例如人类、灵长类、非灵长类、或鸟sertpinc1基因)的表达抑制至少约10％，如通过一种基于pcr或支链dna(bdna)的方法或通过一种基于蛋白质的方法，如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹法或流式细胞技术所评估的。

dsrna包括互补并在其中将使用dsrna的条件下杂交以形成双链体结构的两条rna链。dsrna的一条链(反义链)包含一个互补性区域，该互补性区域基本上互补于并且通常完全互补于靶标序列。靶标序列可以源自serpinc1基因表达期间形成的mrna的序列。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，从而在适合的条件下组合时，这两条链杂交并形成双链体结构。如本文中他处描述并且如本领域已知，与处在分立的寡核苷酸上相反，dsrna的互补序列也可以作为单一核酸分子的自我互补区域包括。

通常，双链结构是15到30个碱基对之间的长度，例如在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对之间的长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。

类似地，靶标序列的互补区域是在15到30个核苷酸之间的长度，(例如在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸之间的长度。以上引用的范围和长度的范围与长度中间值也意在成为本发明的部分。

在一些实施例中，dsrna是在约15至约20个核苷酸之间的长度，或者在约25至约30个核苷酸之间长度。总之，dsrna作为dicer酶的底物是足够长的。例如在本领域所熟知的，长度大于约21-23个核苷酸的dsrna可以作为dicer酶的底物。如普通技术人员也将认识，被靶向以便切割的rna区域将最经常是较大rna分子(往往是mrna分子)的部分。在相关的情况下，mrna靶的“一部分”是mrna靶的连续序列，其长度足够以便允许其作为rnai指导的切割的底物(即，经risc途径的切割)。

本领域技术人员将也认识到，双链体区是dsrna的主要功能性部分，例如大约9至36个碱基对，例如大约10-36、11-36、12-36、13-36、14-36、15-36、9-35、10-35、11-35、12-35、13-35、14-35、15-35、9-34、10-34、11-34、12-34、13-34、14-34、15-34、9-33、10-33、11-33、12-33、13-33、14-33、15-33、9-32、10-32、11-32、12-32、13-32、14-32、15-32、9-31、10-31、11-31、12-31、13-32、14-31、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对的双链体区。因此，在一个实施例中，为了达到被加工成靶向所需rna进行切割的功能性双链体(例如15-30个碱基对)，具有大于30个碱基对的双链体区的rna分子或rna分子复合物是dsrna。因此，普通技术人员将认识到在一个实施例中mirna是dsrna。在另一个实施例中，dsrna不是天然存在的mirna。在另一个实施例中，用于靶向serpinc1表达的irna剂不是在靶细胞中通过切割较大dsrna产生的。

如本文所述的dsrna可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，如1、2、3、或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsrna相对于它们的平端化对应物，可具备出乎意料优越的抑制性特性。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。该一个或多个突出端可以处于有义链、反义链或其任意组合上。另外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsrna的反义或有义链的5′末端、3′末端或两个末端上。

dsrna可以通过如进一步在以下所讨论的、本领域内已知的标准方法来进行合成，例如通过使用自动化的dna合成仪，例如从例如生物研究(biosearch)、应用生物系统公司(appliedbiosystems，inc)可商购的合成仪。

本发明的irna化合物可以使用二步程序制备。首先，分别制备该双链rna分子的各链。然后，将这些组分链退火。该sirna化合物的各链可以通过使用溶液相或固相有机合成或二者来制备。有机合成提供了以下优点，可以容易地制备包含非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可以通过使用溶液相或固相有机合成或二者来制备。

在一个方面，本发明的dsrna包含至少两个核苷酸序列，一个有义序列和一个反义序列。该有义链选自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个提供的序列的组，并且相应的反义链选自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的任一个的序列的组。在这个方面，两个序列的一者与两个序列的另一者互补，其中所述序列中的一者与serpinc1基因表达中产生的mrna的序列基本上互补。照此，在这个方面，dsrna将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的任一个中的有义链，并且第二个寡核苷酸被描述为表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的任一个中的有义链的相应反义链。在一个实施例中，该dsrna的基本上互补的序列包含在独立的寡核苷酸上。在另一个实施例中，该dsrna的基本上互补的序列包含在一个单独的寡核苷酸上。

应当理解的是，虽然表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的一些序列被描述为修饰的和/或共轭的序列，本发明的irna的rna(如本发明的dsrna)可以包括表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中列出的任何一个序列，该序列是未修饰的、非共轭的，和/或不同于此处所述的修饰的和/或共轭的。

熟练的技术人员将很好的意识到，具有约20与23个碱基对之间(例如21个碱基对)的双链结构的dsrna被奉为是尤其有效地诱导rna干扰(厄尔巴瑟(elbashir)等人，embo2001，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现较短或较长的rna双链体结构物也可以是有效的(朱(chu)和拉纳(rana)(2007)rna14：1714-1719；金姆(kim)等人(2005)自然生物技术(natbiotech)23：222-226)。在上文描述的实施例中，由于表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的任一个中提供的寡核苷酸序列的性质，此处所述的dsrna可以包括长度最小21个核苷酸的至少一条链。可以合理地预期，具有表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的任一个的序列之一的、在一个末端或两个末端减去仅仅数个核苷酸的更短的双链体与以上描述的dsrna相比可以类似地有效。因此，在本发明的范围内构思这样的dsrna，它们具有源自于表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中的任一个的序列之一的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列并且在它们抑制serpinc1基因表达不多于约5％、10％、15％、20％、25％、或30％的能力方面与包括全序列的dsrna不同。

此外，表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个提供的rna鉴定在serpinc1转录本中对risc介导的切割敏感的一个或多个位点。照此，本发明进一步表征了靶向这些位点中的一个的内部的irna。如本文所用，如果一种irna促进在某个特定位点内部任何地方切割rna转录本，则称这种irna靶向该转录本内部的这个特定位点。这种irna通常将包括来自表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个提供的一个序列的至少约15个连续核苷酸，该连续核苷酸与从serpinc1基因中的选择序列保持连续的区域所取得的额外核苷酸序列连接。

尽管靶标序列总体上是约15-30个核苷酸长度，但是在这个范围内的特定序列指导任何给定靶rna切割的适用性方面存在广泛变异。此处所列出的各种软件包和准则提供了用于鉴别对于任何给定的基因靶的最佳靶标序列的准则，但还可以采取经验方法，其中一个给定尺寸(如一个非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“掩模”被照字面地或象征性(包括，例如计算机模拟)地放置在靶rna序列上，以鉴别可以充当靶标序列的在该尺寸范围内的序列。通过移动该序列“窗口”渐进初始靶标序列位置的一个核苷酸上游或下游，可以鉴别下一个潜在的靶标序列，直到针对所选择的任何给定的靶标尺寸鉴别可能的序列的全套。这个过程(加上为了鉴定最佳执行的那些序列的所鉴定的序列的系统合成和测试(使用此处所述的或如本领域中已知的测定))可以鉴定当用一种irna剂靶向时介导靶基因表达的最好抑制的那些rna序列。因此，当所鉴定的序列(例如表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个中的)代表有效的靶标序列时，设想了可以通过逐步“使窗户行走”所给定的序列上游或下游的一个核苷酸来鉴定具有相同或更好的抑制特征的序列来实现对抑制效率进一步优化。

另外，构思对于鉴定的任何序列，例如表3、4、8、11、12、14、15、20、和21中任一个中的序列，可以通过以下方式实现进一步优化：系统添加或移走核苷酸以产生较长或较短的序列，并且测试通过将较长或较短尺寸的窗从该点沿靶rna向前或向后推进所产生的那些序列。再次地，使这种方案与产生新候选物靶联系，同时在如本领域已知和/或如本文所述的抑制测定法中基于这些靶标序列测试irna的有效性，可以导致效率抑制的进一步改善。再者，可以例如通过引入如本文所述或如本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或如本领域已知和/或本文中讨论的其他修饰，调节这类优化的序列以便进一步优化该分子(例如增加血清稳定性或循环半寿期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加核内体释放)作为表达抑制剂。

如本文所述的irna可以含有一个或多个相对于靶标序列的错配。在一个实施例中，如本文所述的irna含有不多于3个错配。如果irna的反义链含有相对于靶标序列的错配，则优选错配区域不应当位于互补区域的中心内。如果irna的反义链含有相对于靶标序列的错配，则优选错配应当局限于距互补区域5′-或3′-末端的最末5个核苷酸内部。例如对于与serpinc1基因的一个区域互补的23个核苷酸irna剂的rna链而言，通常在中央13个核苷酸内部不合任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用来确定含有相对于靶标序列的错配的irna是否有效抑制serpinc1基因表达。考虑带错配的irna在抑制serpinc1基因表达的功效方面是重要的，尤其在已知serpinc1基因中的特定互补区域在群体内部具有多态性序列变异时。

iii.本发明的修饰的irna

在一个实施例中，本发明的irna的rna(例如dsrna)是未经修饰的，并且不包括本领域已知的和此处所述的例如化学修饰和/或共轭。在另一个实施例中，将本发明的irna的rna(例如dsrna)化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。本发明所表征的核酸可以通过本领域内良好建立的方法来进行合成和/或修饰，例如描述于“当前核酸化学方案(currentprotocolsinnucleicacidchemistry)”，比尤克居(beaucage)，s.l.(编)，约翰威利父子公司(johnwiley&sons，inc.)，纽约，纽约州，美国中的那些，特此通过引用将其结合于此。修饰包括例如末端修饰，例如5′末端修饰(磷酸化、共轭、倒置键等)或3′末端修饰(共轭、dna核苷酸、倒置键等)；碱基修饰，例如替换为稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩充的配偶物库发生碱基配对的碱基、移除碱基(非碱基核苷酸)、或共轭的碱基；糖修饰(例如在2′位置或4′位置)或糖的替换；和/或骨架修饰，包括修饰或替换磷酸二酯键。在本文所述的实施例中有用的irna化合物的具体实例包括但不限于含有修饰骨架或无天然核苷间键的rna。具有修饰骨架的rna包括在骨架中不具有磷原子的那些，连同其他。出于本说明书的目的和如有时本领域中谈及，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰rna视为寡核苷。在一些实施例中，修饰的irna将在其核苷间骨架中具有磷原子。

修饰的rna骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺酯，包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。还可以包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。

教授制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利re39464，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。

其中不包含磷原子的修饰的rna骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的那些(部分地从一个核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基(methyleneformacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的n、o、s和ch2组成部分的骨架。

传授以上的寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。

在其他实施例中，构思了用于irna的适合的rna模拟物，其中核苷酸单位的糖和核苷间键即骨架被替换为新基团。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这类寡聚化合物，已经显示具有优异杂交特性的rna模拟物，称作肽核酸(pna)。在pna化合物中，rna的糖骨架替换为含有酰胺的骨架，尤其氨基乙基甘氨酸骨架。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教授制备pna化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。适合于用在本发明的irna中的另外的pna化合物描述在例如尼尔森(nielsen)等人，科学(science)，1991，254，1497-1500中。

本发明中表征的一些实施例包括具有硫代磷酸酯骨架的rna和具有杂原子骨架的寡核苷，并且尤其上文所参考的美国专利号5,489,677的--ch2--nh--ch2-、--ch2--n(ch3)--o--ch2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或mmi骨架]、--ch2--o--n(ch3)--ch2--、--ch2--n(ch3)--n(ch3)--ch2--和--n(ch3)--ch2--ch2--[其中天然磷酸二酯骨架表述为--o--p--o--ch2--]，和上文所参考美国专利号5，602，240的酰胺骨架。在一些实施例中，在此表征的rna具有上文所参考美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。

修饰的rna也可以含有一个或多个取代的糖部分。在此表征的irna(例如dsrna)可以在2′位置包含以下之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。示例性的适合的修饰包括o[(ch2)no]mch3、o(ch2).noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2、和o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsrna在2′位置包含以下之一：c1至c10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善irna的药物代谢动力学特性的基团、或用于改善irna的药效特征的基团、和具有相似特性的其他取代基。在一些实施例中，该修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-o--ch2ch2och3，也称作2′-o-(2-甲氧基乙基)或2′-moe)(马丁(martin)等人，瑞士化学学报(helv.chim.acta)，1995，78：486-504)，即一个烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基团，如下文的实例中所述的，也称作2′-dmaoe，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-o-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-dmaeoe)，即2′-o-ch2-o-ch2-n(ch2)2。

其他修饰包括2′-甲氧基(2′-och3)、2′-氨基丙氧基(2′-och2ch2ch2nh2)和2′-氟(2′-f)。也可以在irna的rna上的其他位置处作出相似的修饰，尤其在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的dsrna中糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。irna也可以具有糖模拟物，如替代呋喃戊糖的环丁基部分。教授制备这类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，所述专利的某些由本申请共同所有。特此通过引用将前述的每个的全部内容结合在此。

irna还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如在此所使用的，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。经修饰核碱基包括但不局限于其他合成以及天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基，8-氨基，8-氢硫基，8-硫烷基，8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他的核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些、在生物化学、生物技术和医药中的修饰的核苷酸(modifiednucleosidesinbiochemistry，biotechnologyandmedicine)，赫德维珍妮(herdewijn)，p.编著，wiley-vch，2008中披露的那些；在聚合物科学与工程简明百科全书(theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering)，第858-859页，克洛舍维奇(kroschwitz)，j.l编著，约翰威利父子(johnwiley&sons)，1990中披露的那些、由恩利施(englisch)等人，应用化学(angewandtechemie)，国际版，1991，30，613披露的那些和由赛格维(sanghvi)，ys.，第15章，dsrna研究与应用(dsrnaresearchandapplications)，第289-302页，克鲁克(crooke)，s.t.和拉布列(lebleu)，b.编著，crc出版社，1993披露的那些。这些核碱基中的某些对提高本发明表征的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及n-2、n-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸双链体的稳定性0.6℃-1.2℃(桑格威(sanghvi)，y.s.，克鲁克(crooke)，s.t.以及拉布列(lebleu)，b.编辑，dsrna研究与应用(dsrnaresearchandapplications)，crc出版社，波卡拉顿(bocaraton)，1993，第276-278页)，并是示例性的碱基取代基，甚至更加特别地为当与2’-o-甲氧基乙基糖修饰物组合时。

教授制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述的美国专利号3,687,808、4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、5,750,692、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672、以及7,495,088，特此通过引用将这些中的每个的全部内容结合在此。

也可以修饰irna的rna以包含一个或多个锁核酸(lna)。锁核酸是具有修饰核糖部分的核苷酸，其中所述核糖部分包含连接2′碳和4′碳的额外桥。这个结构有效地将该核糖“锁”在3′-内切结构构象中。向sirna添加锁核酸已经显示增加血清中的sirna稳定性并且减少脱靶效应(埃尔曼(elmen)，j.等人，(2005)核酸研究(nucleicacidsresearch)33(1)：439-447；穆克(mook)，or.等人，(2007)分子癌症疗法(molcancther)6(3)：833-843；格伦韦勒(grunweller)，a.等人，(2003)核酸研究(nucleicacidsresearch)31(12)：3185-3193)。

教授制备锁核酸核苷酸的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利号6,268,490、6,670,461、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,084，125、以及7,399,845，特此将这些中的每个的全部内容通过引用结合在此。

对rna分子的末端的潜在的稳定化修饰可包括n-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(hyp-c6-nhac)、n-(己酰基-4-羟基脯氨醇(hyp-c6)、n-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(hyp-nhac)、胸苷-2′-0-脱氧胸苷(醚)、n-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(hyp-c6-氨基)、2-二十二醇基(docosanoyl)-尿苷-3″-磷酸酯、反向dt(idt)及其他。在pct公开号wo2011/005861中可以找到这种修饰的披露。

iv.共轭至配体的irna

本发明的irna的rna的另一种修饰涉及使rna化学连接至一种或多种增强irna的活性、细胞分布或细胞摄取的配体、部分或共轭物。此类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(乐欣格(letsinger)等人，美国科学院院刊(proc.natl.acid.sci.usa)，1989，86：6553-6556)，胆酸(马诺汗(manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(biorg.med.chem.let.)，1994，4：1053-1060)，硫醚如beryl-s-三苯甲基硫醇((马诺汗(manoharan)等人，纽约科学院年报(ann.n.y.acad.sci.)，1992，660：306-309；(马诺汗(manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(biorg.med.chem.let.)，1993，3：2765-2770)，硫代胆固醇(奥博汗瑟(oberhauser)等人，核酸研究(nucl.acidsres.)，1992，20：533-538)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(saison-behmoaras)等人，emboj，1991，10：1111-1118；卡波诺(kabanov)等人，febs通讯，1990，259：327-330；斯伍那区克(svinarchuk)等人，生物化学(biochimie)，1993，75：49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯((马诺汗(manoharan)等人，四面体通讯(tetrahedronlett.)，1995，36：3651-3654；舍阿(shea)等人，核酸研究(nucl.acidsres.)，1990，18：3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇链((马诺汗(manoharan)等人，核苷&核苷酸(nucleosides&nucleotides)，1995，14：969-973)或金刚烷乙酸((马诺汗(manoharan)等人，四面体通讯(tetrahedronlett.)，1995，36：3651-3654)，棕榈基部分(米莎(mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(biochim.biophys.acta)，1995，1264：229-237)，或十八胺或己胺-羰基羟胆固醇部分(克鲁克(crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(j.pharmacol.exp.ther.)，1996，277：923-937)。

在一个实施例中，配体改变向其中并入该配体的irna剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施例中，与例如不存在配体的物种相比，这种配体提供针对所选靶(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室、身体组织、器官或区域))的增强的亲和力。优选的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。

配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精、n-乙酰半乳糖胺、或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(pll)、聚l-天冬氨酸、聚l-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(l-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(hmpa)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、n-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树枝状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。

配体也可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质a、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素b12、维生素a、生物素、或rgd肽或rgd肽模拟物。

配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂((例如补骨脂素、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪))、人工核酸内切酶((例如edta)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-o(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、o3-(油酰)石胆酸、o3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽共轭物(例如触角足肽、tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、peg(例如peg-40k)、mpeg、[mpeg]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑共轭物、四氮杂大环类的eu3+络合物)、二硝基苯基、hrp或ap。

配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对辅助配体具有特异亲和力的分子，或抗体，例如与指定细胞类型如肝细胞结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽种类，如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。该配体可以是例如脂多糖，p38map激酶的活化剂或nf-κb的活化剂。

配体可以是可以例如通过破坏细胞细胞骨架(例如通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加irna剂摄入细胞中的物质，例如药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素a、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)a、茚满诺星(indanocine)或myoservin。

在一些实施例中，与如本文所述的irna连接的配体充当药物代谢动力学调节剂(pk调节剂)。pk调节剂包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、peg、维生素等。示例性pk调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素e、生物素等。包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此骨架中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也服从于本发明作为配体(例如作为pk调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也适合用作本文所述的实施例中的pk调节配体。

本发明的配体-轭合的寡核苷酸可以通过使用这样一种寡核苷酸合成，该寡核苷酸具有吊坠反应功能性，例如衍生自该寡核苷酸上的连接分子的附接物(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体，合成的、具有多种保护基中的任一种的配体，或具有连接部分附接于其上的配体发生反应。

在本发明的共轭物中使用的寡核苷酸可以通过固相合成的公知技术方便且常规地制备。用于这类合成的设备由多个供应商(包括例如应用生物系统公司(appliedbiosystems)(福斯特市，加利福尼亚州))销售。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他装置。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。

在本发明的配体-共轭的寡核苷酸以及具有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，该寡核苷酸以及寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经具有连接部分的核苷酸或核苷共轭前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷共轭前体，或带有构件的非核苷配体，从而被组装到适合的dna合成仪中。

当使用已经具有连接部分的核苷酸-共轭物前体时，典型地完成该序列特异性连接的核苷的合成，并且然后该配体分子与该连接部分反应以形成配体共轭的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过一种自动合成仪合成，除了可商购以及寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺以及非标准亚磷酰胺之外，该合成还使用衍生自配体-核苷共轭物的亚磷酰胺。

a.脂质共轭物

在一个实施例中，该配体或共轭物是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(hsa)。结合hsa的配体允许共轭物分布至靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合hsa的其他分子也可以用作配体。例如可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加共轭物对降解的抵抗力，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如hsa)的结合。

基于脂质的配体可以用来抑制(例如控制)共轭物与靶组织的结合。例如与hsa更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与hsa较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使共轭物靶向肾。

在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合hsa。优选地，它以足够的亲和力结合hsa，从而共轭物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，从而hsa-配体结合不能逆转。

在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合hsa，从而共轭物将优选地分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，也可以使用靶向肾细胞的其他部分。

在另一个方面，配体是由靶细胞(例如正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如恶性或非恶性型，例如癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素a、e和k。其他示例性维生素包括是b维生素，例如叶酸、b12、核黄素、生物素、吡哆醛或其他维生素或由靶细胞如肝细胞摄取的养分。还包括hsa和低密度脂蛋白(ldl)。

b.细胞渗透剂

在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋形细胞渗透剂。优选地，该渗透剂是两亲的。一种示例性剂渗透剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该渗透剂是肽，则它可以经修饰的，包括肽酰基模拟物、反演体、非肽键或假肽键和d-氨基酸的使用。该螺旋剂优选为α-螺旋剂，其优选具有一个亲脂性相和一个亲油性相。

该配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与irna剂的接合可以影响irna的药物代谢动力学分布，如通过增强细胞鉴别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。

肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由tyr、trp或phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，肽部分可以包含疏水性膜转运序列(mts)。一种含有疏水性mts的示例性肽是具有氨基酸序列aavallpavllallap(seqidno：9)的rfgf。含有疏水性mts的rfgf类似物(例如氨基酸序列aallpvllaap(seqidno：10))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，其可携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸、和跨细胞膜的蛋白。例如已经发现来自hivtat蛋白(grkkrrqrrrppq(seqidno：11))和果蝇触角足蛋白(rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno：12))的序列能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以由随机dna序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(oboc)组合文库中鉴定的肽(拉姆(lam)等人，自然(nature)，354：82-84，1991)。通过为了细胞靶向的目的并入的单体单元系至dsrna剂的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)肽或rgd模拟物。肽部分可以在长度上范围从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用下文描述的任何结构修饰。

用于在本发明的组合物和方法中使用的rgd肽可以是线性或环状的，并且可以是修饰的，例如糖基化或甲基化以促进靶向一个或多个特定组织。含rgd的肽和肽模拟物可以包括d-氨基酸以及合成的rgd模拟物。除了rgd之外，可使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选共轭物靶向pecam-1或vegf。

“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如ll-37或ceropinp1)、含二硫键的肽(例如α-防卫素、β-防卫素或牛抗菌肽)、或只包含一个或两个主导性氨基酸(例如pr-39或吲哚力西丁)的肽。细胞渗透肽也可以包含核定位信号(nls)。例如细胞渗透肽可以是二重两亲肽，如mpg，其源自hiv-1gp41的融合物肽结构域和sv40大t抗原的nls(西梅奥尼(simeoni)等人，核酸研究(nucl.acidsres.)31：2717-2724，2003)。

c.碳水化合物共轭物

在本发明的组合物与方法的一些实施例中，irna寡核苷酸进一步包括一种碳水化合物。碳水化合物共轭的irna对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物而言是有利的，如在此所描述。如在此所使用的，“碳水化合物”指以下这样一种化合物，它是一种本身由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单位构成的碳水化合物(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子；或者它是一种具有以下这样的一个碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物由具有至少六个碳原子的一个或多个单糖单位构成(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及包含从大约4、5、6、7、8或9个单糖单位的低聚糖)，以及多糖例如淀粉、糖原、纤维素以及多糖胶。具体的单糖包括c5以及以上的(例如c5、c6、c7或c8)糖；二糖以及三糖包括具有两个或三个单糖单位的糖(例如c5、c6、c7或c8)。

在一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物共轭物是一种单糖。在一个实施例中，该单糖是一种n-乙酰半乳糖胺，例如

在另一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物共轭物是选自下组，该组由以下各项组成：

用于在于此描述的实施例中使用的另一个代表性碳水化合物共轭物包括但不限于

(式xxiii)，当x或y中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。

在一些实施例中，该碳水化合物共轭物进一步包括以上描述的一个或多个另外的配体，例如但不限于一种pk调制子和/或一种细胞渗透肽。

d.连接物

在一些实施例中，此处所述的共轭物或配体可以借助各种连接物与irna寡核苷酸连接，所述连接物可以是可切割或不可切割的。

术语“连接物”或“连接基团”意为一种有机部分，它连接一个化合物的两个部分，例如共价地附接一个化合物的两个部分。连接物典型地包括一种直接的键或一种原子例如氧或硫，一种单位例如nr8、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh或者一种原子链，例如但不限于经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：o、s、s(o)、so2、n(r8)、c(o)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基；其中r8是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。在一个实施例中，该连接物是在大约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子，7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子之间。

一种可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶标细胞时被切割以释放该连接物结合在一起的两个部分。在一个优选的实施例中，该可切割的连接基团在靶标细胞中或在一个第一参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在一个第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少大约100倍。

可切割的连接基团易于受到切割因子(例如ph、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般地，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解因子的实例包括：氧化还原因子，它们被选择用于具体底物或者无底物特异性，包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原因子例如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原切割的连接基团)；酯酶；核内体或可以创造酸性环境的因子，例如可以导致ph为5或更低的那些；可以通过作为一种广义酸起作用而水解或降解一种酸可切割的连接基团的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。

一种可切割的连锁群，例如二硫键可以对ph敏感。人血清的ph是7.4，而平均的细胞内ph稍低，范围为大约7.1-7.3。核内体具有一个更酸的ph，范围在5.5-6.0，并且溶酶体具有一个甚至更酸的ph，在5.0左右。一些连接物将具有可切割的连接基团，这些基团在一个优选的ph处被切割，由此将阳离子脂质从配体释放在细胞内，或释放进入所希望的细胞区室。

连接物可以包括一种可被特定酶切割的可切割连接基团。并入连接物的可切割连接基团的类型可以取决于有待被靶向的细胞。例如肝靶向的配体可以通过一种包括酯基团的连接物而被连接至一种阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，并且因此与不富含酯酶的细胞相比，该连接物将在肝细胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。

当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝细胞与滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的连接物。

总体上，一种候选的可切割连接基团的适合性可以通过测试降解因子(或条件)切割该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可切割连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在一个第一条件与一个第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶标细胞中的切割并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确证。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择为模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。

i.氧化还原可切割连接基团

在一个实施例中，可切割的连接基团是一种氧化还原可切割的连接基团，其在还原或氧化时被切割。还原地可切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-s-s-)。为了确定一个候选的可切割连接基团是否是一种适合的“还原地可切割的连接基团”，或者例如是否适合于与一种特定的irna部分以及特定的靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如可以通过与二硫苏糖醇(dtt)或本领域内已知的使用还原剂的试剂进行孵育来对一个候选者进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶标细胞)内观察到的切割速率。还可以在被选择为模拟血液或血清条件的条件下对这些候选者进行评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被切割最多大约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。可以在被选择为模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的切割速率，并且将其与被选择为模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。

ii.基于磷酸酯的可切割连接基团

在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于磷酸酯的可切割的连接基团。基于磷酸酯的可切割的连接基团通过降解或水解该磷酸酯基团的因子而被切割。一种在细胞中切割磷酸酯基团的因子的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-o-p(o)(ork)-o-、-o-p(s)(ork)-o-、-o-p(s)(srk)-o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-s-p(s)(ork)-o-、-o-p(o)(rk)-o-、-o-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-o-、-s-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-s-、-o-p(s)(rk)-s-。优选的实施例是-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o、-s-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-s-、-o-p(s)(h)-s-。一个优选的实施例是-o-p(o)(oh)-o-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。

iii.酸可切割连接基团

在另一个实施例中，可切割连接物包括一种酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的一种连接基团。在优选的实施例中，酸可切割的连接基团在一个具有大约6.5或更低(例如大约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的ph的酸性环境中被切割，或者被多种因子(例如可以作为一种广义酸起作用的酶)被切割。在细胞中，具体的低ph细胞器(例如核内体或溶酶体)可以提供一个针对酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基团可以具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。一个优选的实施例是当附接至酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、经取代的烷基基团或叔烷基基团(例如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。

iv.基于酯的连接基团

在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的酯酶与酰胺酶)而被切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基的酯。酸可切割的连接基团具有通式-c(o)o-、或-oc(o)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。

v.基于肽的切割基团

在又另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团通过酶(例如细胞中的肽酶与蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如二肽、三肽，等等)以及多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-c(o)nh-)。该酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。该基于肽的切割基团总体上限于在在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-nhchrac(o)nhchrbc(o)-，其中ra与rb是这两个邻接氨基酸的r基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。

在一个实施例中，本发明的irna通过一种连接物被共轭至一种碳水化合物。本发明的组合物与方法的具有连接物的irna碳水化合物共轭物的非限制性实例包括但不限于，

(式xxx)，当x或y中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。

在本发明的组合物与方法的某些实施例中，配体是通过二价或三价分支连接物而附接的一个或多个“galnac”(n-乙酰半乳糖胺)衍生物。

在一个实施例中，本发明的dsrna被共轭至一种二价或三价分支连接物，其选自在化学式(xxxi)-(xxxiv)的任一个中显示的结构的组：

其中：

各次出现的q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b以及q5c独立地代表0-20，并且其中该重复单元可以是相同或不同的；

各次出现的p^2a、p^2b、p^3a、p^3b、p^4a、p^4b、p^5a、p^5b、p^5c、t^2a、t^2b、t^3a、t^3b、t^4a、t^4b、t^4a、t^5b、t^5c各自独立地是：不存在、co、nh、o、s、oc(o)、nhc(o)、ch2、ch2nh或ch2o；

各次出现的q^2a、q^2b、q^3a、q^3b、q^4a、q^4b、q^5a、q^5b、q^5c各自独立地是：不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个所中断或封端：o、s、s(o)、so2、n(rⁿ)、c(r’)＝c(r”)、c≡c或c(o)；

各次出现的r^2a、r^2b、r^3a、r^3b、r^4a、r^4b、r^5a、r^5b、r^5c各自独立地是：不存在、nh、o、s、ch2、c(o)o、c(o)nh、nhch(r^a)c(o)、-c(o)-ch(r^a)-nh-、co、ch＝n-o、或杂环基；

l^2a、l^2b、l^3a、l^3b、l^4a、l^4b、l^5a、l^5b和l^5c代表配体；即各次出现时各自独立地代表：单糖(如galnac)、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖；并且r^a是h或氨基酸侧链。三价共轭的galnac衍生物对于与rnai剂一起使用以抑制靶标基因的表达是特别有用的，例如具有化学式(xxxv)的那些：

式xxxv

其中l^5a、l^5b与l^5c代表单糖，例如galnac衍生物。

合适的二价与三价分支连接物基团共轭的galnac衍生物的实例包括但不限于在以上引用为化学式ii、vii、xi、x以及xiii的结构。

传授rna共轭物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5，118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，每一者的全部内容特此通过引用结合于此。

给定化合物中的全部位置不必要经统一修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在irna内部的单个核苷处掺入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的irna化合物。

在本发明的上下文中，“嵌合体的”irna化合物或“嵌合体”是以下这样的irna化合物，优选是dsrna，它们包含两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单元构成，即，在dsrna化合物的情况下的一种核苷酸。这些irna一般含有至少一个区域，其中rna经修饰，从而赋予irna增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。irna的额外区域可以充当能够切割rna:dna或rna:rna杂交分子的酶的底物。举例而言，rnaseh是一种切割rna:dna双链体的rna链的细胞内核酸酶。因此，rna酶h的激活导致rna靶的切割，因而大大增强irna抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsrna相比，可以在使用嵌合dsrna时，经常用较短的irna获得可比较的结果。可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域内已知的核酸杂交技术来检测该rna靶标的切割。

在某些实例中，irna的rna可以通过非配体基团来进行修饰。一些非配体分子已经被共轭至irna以增强该irna的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类共轭的程序在科学文献中是可得的。这种非配体部分已经包括脂部分如胆固醇(库博(kubo)，t.等人，生物化学和生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.comm.)，2007，365(1)：54-61；乐欣格(letsinger)等人，美国科学院院刊(proc.natl.acid.sci.usa)，1989，86：6553)，胆酸(马诺汗(manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(biorg.med.chem.let.)，1994，4：1053)，硫醚如己基-s-三苯甲基硫醇(马诺汗(manoharan)等人，纽约科学院年报(ann.n.y.acad.sci.)，1992，660：306；马诺汗(manoharan)等人，生物有机化学与医药化学快报(biorg.med.chem.let.)，1993，3：2765)，硫代胆固醇(奥博汗瑟(oberhauser)等人，核酸研究(nucl.acidsres.)，1992，20：533)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(赛森-博和马拉(saison-behmoaras)等人，embo杂志，1991，10：111；卡波诺(kabanov)等人，febs通讯，1990，259：327；斯伍那区克(svinarchuk)等人，生物化学(biochimie)，1993，75：49)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1，2-二-o-十六烧基-外消旋-甘油-3-h-磷酸酯(马诺汗(manoharan)等人，四面体通讯(tetrahedronlett.)，1995，36：3651；舍阿(shea)等人，核酸研究(nucl.acidsres.)，1990，18：3777)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(马诺汗(manoharan)等人，核苷&核苷酸(nucleosides&nucleotides)，1995，14：969)或金刚烷乙酸(马诺汗(manoharan)等人，四面体通讯(tetrahedronlett.)，1995，36：3651)，棕榈基部分(米莎(mishra)等人，生物化学与生物物理学学报(biochim.biophys.acta)，1995，1264：229)，或十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分(克鲁克(crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(j.pharmacol.exp.ther.)，1996，277：923)。教授制备这类rna共轭物的代表性美国专利已经在上文列出。典型的共轭方案涉及在序列的一个或多个位置具有氨基连接物的rna的合成。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被共轭的分子进行反应。共轭反应可以用仍与固相支持物结合或在切割rna后处于溶液相的rna进行。通过hplc纯化rna共轭物一般提供纯的共轭物。

iv.本发明的irna的递送

可以按许多不同方式实现向细胞、例如受试者像人类受试者(例如对其有需要的受试者，例如患有出血性障碍的受试者)体内的细胞递送irna。例如递送可通过将细胞在体外或体内与本发明的irna接触来进行。也可以通过向受试者施用包含irna(例如dsrna)的组合物，直接进行体内递送。可替代地，可以通过施用编码和指导irna表达的一种或多种载体间接地进行体内递送。这些替代方案在后文进一步论述。

通常，递送(体外或体内)核酸分子的任何方法可以适应于随本发明的irna使用(见例如阿赫塔尔(akhtar)s.和朱利安(julian)rl.(1992)细胞生物学趋势(trendscell.biol.)2(5)：139-144和wo94/02595，通过引用以其全文结合在此)。对于体内递送，为了递送irna分子考虑的因子包括：例如所递送的分子的生物学稳定性、非特异性作用的防止、和所递送分子在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入至组织中或局部施用该制剂，使irna的非特异性作用最小化。局部施用至治疗位点使该试剂的局部浓度最大化，限制该试剂向全身组织的暴露，所述全身组织否则可能受该试剂损害或可能降解该试剂，并且允许较低总剂量的irna分子施用。几项研究已经显示在局部施用irna时成功敲减基因产物。例如在食蟹猴中通过玻璃体内注射眼球内递送vegfdsrna(托伦蒂诺(tolentino)，mj.等人(2004)视网膜(retina)24：132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(reich)，sj.等人(2003)分子视觉(mol.vis.)9：210-216)眼球内递送vegfdsrna均显示在年龄相关性黄斑变性的实验模型中防止血管新生。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射dsrna缩减肿瘤体积(皮勒(pille)，j.等人(2005)分子疗法(mol.ther.)11：267-274)并且可以延长带瘤小鼠的存活(金姆(kim)，wj.等人(2006)分子疗法(mol.ther.)14：343-350；李(li)，s.等人(2007)分子疗法(mol.ther.)15：515-523)。也已经显示通过直接注射将rna干扰成功局部递至cns(多恩(dorn)，g.等人(2004)核酸(nucleicacids)32：e49；丹(tan)，ph.等人(2005)基因疗法(genether.)12：59-66；牧村(makimura)，h.等人(2002)bmc神经科学(bmcneurosci.)3：18；希什吉娜(shishkina)，gt.等人(2004)神经科学(neuroscience)129：521-528；塔克尔(thakker)，er.等人(2004)美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)101：17270-17275；阿卡涅亚(akaneya)，y.等人(2005)神经生理学杂志(j.neurophysiol.)93：594-602并且通过鼻内施用成功递送至肺(霍华德(howard)，ka.等人(2006)分子疗法(mol.ther.)14：476-484；张(zhang)，x.等人(2004)生物化学杂志(j.biol.chem.)279：10677-10684；比特科(bitko)，v.等人(2005)自然医学(nat.med.)11：50-55)。对于全身性施用irna以便治疗疾病，可以将rna修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法均起到防止dsrna被体内核酸内切酶和外切酶快速降解的作用。rna或药物载体的修饰也可以允许irna组合物靶向靶组织并避免不想要的脱靶效应。irna分子可以通过化学共轭至亲脂性基团如胆固醇进行修饰以增强细胞摄取和防止降解。例如将与亲脂性胆固醇部分共轭的针对apob的irna全身注射至小鼠并且导致肝脏和空肠中apobmrna的敲减(苏兹赫克(soutschek)，j.等人(2004)自然(nature)432：173-178)。irna与适配体的共轭已经在前列腺癌的小鼠模型中显示抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(麦克纳马拉(mcnamara)，jo.等人(2006)自然生物技术(nat.biotechnol.)24：1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送系统如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送irna。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)irna分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许irna由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与irna结合或被诱导以形成包装sirna的囊泡或胶束(见例如金姆(kim)sh.等人(2008)控制释放期刊(journalofcontrolledrelease)129(2)：107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身施用时irna的降解。用于制造和施用阳离子-irna复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如索伦森(sorensen)，dr.等人(2003)分子生物学杂志(j.mol.biol)327：761-766；维尔马(verma)，un.等人(2003)临床癌症研究(clin.cancerres.)9：1291-1300；阿诺德(arnold)，as等人(2007)高血压杂志(j.hypertens.)25：197-205，通过引用以其全文结合在此)。对全身递送irna有用的药物递送系统的一些非限制性实例包括dotap(索伦森(sorensen)，dr等人(2003)，同上；维尔马(verma)，un.等人，(2003)，同上)、oligofectamine、“固体核酸酸脂质颗粒”(齐默尔曼(zimmermann)，ts等人(2006)自然441：111-114。)，心磷脂(简(chien)，py，等人(2005)癌症基因疗法(cancergenether.)12：321-328；帕尔(pal)，a等人(2005)国际肿瘤学杂志(intj.oncol.)26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(邦尼特(bonnet)me等人(2008)药物研究(pharm.res.)8月16日印刷版之前的电子版(aug16epubaheadofprint)；爱格纳(aigner)，a.(2006)生物医学和生物技术杂志(j.biomed.biotechnol.)71659)、arg-gly-asp(rgd)肽(柳(liu)，s.(2006)分子医药(mol.pharm.)3：472-487)、和聚酰胺型胺类(托马利亚(tomalia)，da等人(2007)生化社会事务(biochem.soc.trans.)35：61-67；由(yoo)，h.，等人(1999)药物研究(pharm.res.)16：1799-1804)。在一些实施例中，irna与环糊精形成用于全身性施用的复合物。用于施用irna和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用方式完整地结合在此。

a.本发明的载体编码的irna

靶向serpinc1基因的irna可以从插入dna或rna载体中的转录单位表达(见，例如卡秋尔(couture)，a等人，tig.(1996)，12：5-10；思科勒尔(skillern)，a.等人，国际pct公开号wo00/22113，卡雷德(conrad)，国际pct公开号wo00/22114，以及卡雷德(conrad)，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以如此构建以允许它作为染色体外质粒遗传(加斯曼(gassmann)等人，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)(1995)92：1292)。

irna的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。在两条单独的链待表达以产生例如dsrna的情况下，可以将两个单独表达载体共引入(例如通过转染或感染)靶细胞中。可替代地，dsrna的每条单独链可以由均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施例中，dsrna表达为被一种连接物多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，由此该dsrna具有茎环结构。

irna表达载体通常是dna质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞相容的那些，可以用来产生表达如本文所述的irna的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域熟知的并且从许多商业来源可获得。一般，提供这类载体，它们含有用于插入所需核酸区段的便利限制性位点。表达irna的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向所需靶细胞引入的任何其他手段。

可以将irna表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如transit-tko^tm)的复合物转染至靶细胞中。本发明也构思了在一周或更长时间范围内用于irna介导的靶向靶rna不同区域的敲减的多次脂质转染。成功地将载体引入宿主细胞可以使用多种已知的方法来监测。例如瞬时转染可以使用一种报告物来进行信号化，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(gfp)。稳定的对离体细胞的转染可以使用以下这样的标记来进行确保：这些标记为被转染的细胞提供了对特定环境因子(例如抗生素或药物)的抗性，例如潮霉素b抗性。

可以随本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺联病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)sv40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小rna病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如痘苗病毒载体或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；和(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加体型复制的载体(例如epv和ebv载体)中。用于重组表达irna的构建体通常将需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保irna在靶细胞中的表达。下文进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。

可用于递送irna的载体将包括足以在所需靶细胞或组织中表达irna的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。

可以精确地调节irna的表达，例如通过使用对某些生理调节物(例如循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(多赫替(docherty)等人，1994，faseb杂志8：20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsrna表达的此类可诱导的表达系统包括例如由以下项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物、以及异丙基-β-d1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)。本领域技术人员将能够基于irna转基因的预期用途选择适宜的调节/启动子序列。

可以使用含有编码irna的核酸序列的病毒载体。例如可以使用逆转录病毒载体(见米列尔(miller)等人，酶学方法(meth.enzymol.)217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞dna必需的组件。将编码irna的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如博森(boesen)等人，生物疗法(biotherapy)6：291-302(1994)找到，所述文献描述使用逆转录病毒载体递送mdr1基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：克洛斯(clowes)等人，临床研究杂志(j.clin.invest.)93：644-651(1994)；基艾姆(kiem)等人，血液(blood)83：1467-1473(1994)；萨尔蒙斯(salmons)和京茨堡(gunzberg)，人类基因疗法(humangenetherapy)4：129-141(1993)；和格罗斯曼(grossman)和威尔逊(wilson)，遗传学与发育学新观点(curr.opin.ingeneticsanddevel.)3：110-114(1993)。构思使用的慢病毒载体例如包括基于hiv的载体，这些载体在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述，所述专利通过引用方式结合在此。

也构思腺病毒用于本发明的irna的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。科扎斯凯(kozarsky)和威尔逊(wilson)，遗传学与发育学新观点(currentopinioningeneticsanddevelopment)3：499-503(1993)提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。布特(bout)等人，人类基因疗法(humangenetherapy)5：3-10(1994)展示了腺病毒载体转移基因至恒河猴猴呼吸道上皮的用途。基因治疗中使用腺病毒的其他例子可以在罗森菲尔德(rosenfeld)等人，science252：431-434(1991)；罗森菲尔德(rosenfeld)等人，细胞(cell)68：143-155(1992)；马斯特伦杰利(mastrangeli)等人，临床研究杂志(j.clin.invest.)91：225-234(1993)；pct公开wo94/12649；和王(wang)等人，基因疗法(genetherapy)2：775-783(1995)中找到。用于表达本发明中表征的irna的合适av载体、用于构建重组av载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在夏(xia)h等人，(2002)，自然生物技术(nat.biotech.)20：1006-1010中描述。

也可以使用腺联病毒(aav)载体来递送本发明的irna(沃尔什(walsh)等人，实验生物学与医学会会报(proc.soc.exp.biol.med.)204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，irna可以从具有例如u6或h1rna启动子或细胞巨化病毒(cmv)启动子的重组aav载体作为两个单独的互补性单链rna分子表达。用于表达本发明中表征的dsrna的合适aav载体、用于构建重组av载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在萨穆尔斯基(samulski)r等人(1987)，病毒学杂志(j.virol.)61：3096-3101；菲舍尔(fisher)kj等人(1996)，病毒学杂志(j.virol.)，70：520-532；萨穆尔斯基(samulski)r等人(1989)，病毒学杂志(j.virol.)63：3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号wo94/13788；和国际专利申请号wo93/24641中描述，通过引用将其全部披露合并在此。

另一种适合于递送本发明的irna的病毒载体是痘病毒如痘苗病毒，例如减毒痘苗病毒如修饰的安卡拉病毒(mva)或nyvac、禽痘病毒如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。

病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(vsv)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同血清型的衣壳蛋白，使得aav载体靶向不同的细胞；参见例如拉比诺维茨(rabinowitz)je等人，(2002)，病毒学杂志(jvirol)76：791-801，通过引用将其全部披露合并在此。

载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送媒介物被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制剂可以包括产出该基因递送系统的一个或多个细胞。

v.本发明的药物组合物

本发明还包括药物组合物和配制品，它们包括本发明的irna。在一个实施例中，本文中提供含有如此处所述的irna和药学上可接受的载体的药物组合物。含有irna的药物组合物可用于治疗与serpinc1基因的表达或活性相关的疾病或病症，如出血性障碍。此类药物组合物基于递送模式而进行配制。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过静脉内(iv)递送来全身性施用的组合物。另一个实例是以下组合物，该组合物被配制用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，例如通过连续泵输注。本发明的药物组合物可以按足以抑制serpinc1基因的表达的剂量给予。通常，本发明的irna的适合剂量处于每日受体每千克体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。例如dsrna可以按每个单剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、或约50mg/kg施用。

例如可以按以下剂量给予dsrna：大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在另一个实施例中，将该dsrna按以下的剂量给予：约0.1至约50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kb、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kb、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kb、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kb、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kb、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以按以下剂量给予dsrna：大约0..01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在另一个实施例中，将该dsrna按以下的剂量给予：大约0.5至大约50mg/kg、大约0.75至大约50mg/kg、大约1至大约50mg/mg、大约1.5至大约50mg/kb、大约2至大约50mg/kg、大约2.5至大约50mg/kg、大约3至大约50mg/kg、大约3.5至大约50mg/kg、大约4至大约50mg/kg、大约4.5至大约50mg/kg、大约5至大约50mg/kg、大约7.5至大约50mg/kg、大约10至大约50mg/kg、大约15至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约30至大约50mg/kg、大约35至大约50mg/kg、大约40至大约50mg/kg、大约45至大约50mg/kg、大约0.5至大约45mg/kg、大约0.75至大约45mg/kg、大约1至大约45mg/mg、大约1.5至大约45mg/kb、大约2至大约45mg/kg、大约2.5至大约45mg/kg、大约3至大约45mg/kg、大约3.5至大约45mg/kg、大约4至大约45mg/kg、大约4.5至大约45mg/kg、大约5至大约45mg/kg、大约7.5至大约45mg/kg、大约10至大约45mg/kg、大约15至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约30至大约45mg/kg、大约35至大约45mg/kg、大约40至大约45mg/kg、大约0.5至大约40mg/kg、大约0.75至大约40mg/kg、大约1至大约40mg/mg、大约1.5至大约40mg/kb、大约2至大约40mg/kg、大约2.5至大约40mg/kg、大约3至大约40mg/kg、大约3.5至大约40mg/kg、大约4至大约40mg/kg、大约4.5至大约40mg/kg、大约5至大约40mg/kg、大约7.5至大约40mg/kg、大约10至大约40mg/kg、大约15至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约30至大约40mg/kg、大约35至大约40mg/kg、大约0.5至大约30mg/kg、大约0.75至大约30mg/kg、大约1至大约30mg/mg、大约1.5至大约30mg/kb、大约2至大约30mg/kg、大约2.5至大约30mg/kg、大约3至大约30mg/kg、大约3.5至大约30mg/kg、大约4至大约30mg/kg、大约4.5至大约30mg/kg、大约5至大约30mg/kg、大约7.5至大约30mg/kg、大约10至大约30mg/kg、大约15至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约25至大约30mg/kg、大约0.5至大约20mg/kg、大约0.75至大约20mg/kg、大约1至大约20mg/mg、大约1.5至大约20mg/kb、大约2至大约20mg/kg、大约2.5至大约20mg/kg、大约3至大约20mg/kg、大约3.5至大约20mg/kg、大约4至大约20mg/kg、大约4.5至大约20mg/kg、大约5至大约20mg/kg、大约7.5至大约20mg/kg、大约10至大约20mg/kg、或大约15至大约20mg/kg。在一个实施例中，该dsrna是以大约10mg/kg至大约30mg/kg的剂量给予的。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以给予受试者治疗量的irna：例如大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该irna在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个子剂量中所含的irna必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持久irna释放的常规持续释放配制品。缓释配制品在本领域内是熟知的并且对于在特定位点递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。

在其他实施例中，单一剂量的该药物组合物可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3、或4周的间距施用。在本发明的一些实施例中，每周给予一次单剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施例中，每两月给予一次单剂量的本发明的药物组合物。

本领域技术人员将理解，某些因子可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因子包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适宜动物模型的体内测试，可以估计本发明涵盖的各个irna的有效剂量和体内半寿期。

在小鼠遗传学方面的进展已经产生了许多用于研究人类不同疾病的小鼠模型，例如将从减少serpinc1表达受益的出血性障碍。这类模型可以用于irna的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。合适的小鼠模型是本领域已知的，并且包括，例如血友病a小鼠模型和血友病b小鼠模型，例如含有凝血因子基因敲除的小鼠，如在博利格尔(bolliger)等人(2010)血栓形成和止血杂志(thrombhaemost)103：1233-1238，毕(bi)l，等人(1995)自然遗传学(natgenet)10：119-21，林(lin)等人(1997)血液(blood)90：3962-6，昆都(kundu)等人(1998)血液(blood)92：168-74，王(wang)等人(1997)美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)94：11563-6，和金(jin)等人(2004)血液(blood)104：1733所述的那些。

取决于希望局部还是系统性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如通过皮肤药贴)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；真皮下的，如通过植入设备；或颅内的，例如通过实质内的、鞘内的或心室内的给予。irna可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如肝脏(例如肝脏的肝上皮实质细胞)。用于局部给予的药物组合物以及配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等等可以是必要的或希望的。包衣的安全套、手套等等也可以是有用的。适合的局部用配制品包括其中本发明中表征的irna与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性物质混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷脂酰dope乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱dmpc、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)和阳离子脂质和脂质体(例如二油酰四甲基氨基丙基dotap和二油酰磷脂酰乙醇胺dotma)。本发明中表征的irna可以封装于脂质体内部或可以与其、尤其是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，irna可以与脂质、尤其与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或c1-20烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯ipm)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部用配制品在美国专利号6,747,014中详细描述，所述专利通过引用方式结合在此。

a.包括膜性分子集合体的irna配制品

用于在本发明的组合物和方法中使用的irna可以被配制成用于在膜性分子集合体中递送例如脂质体或胶束。如此处使用的，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层(例如一个双层或多个双层)中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。水性部分包含该irna组合物。该亲脂性材料从典型地不包括irna组合物的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离该水性内部。脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为该脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至一个组织时，这些脂质体双层与这些细胞膜的双层合并。随着脂质体的合并和细胞进程，包括该irna的这些内部水性内容物被递送到该细胞中，其中该irna可特异地结合至一个靶rna并且可以介导rnai。在一些情况下，这些脂质体也是特异地靶向的，例如将该irna引导到特定的细胞类型。

包含rnai剂的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质共轭物。该洗涤剂可具有高的临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、chaps、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将该rnai剂制剂添加到包括该脂质组分的胶束中。该脂质上的阳离子基团与rnai剂相互作用并在rnai剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析将该洗涤剂除去以得到rnai剂的脂质体制剂。

如果必要，可以在缩合反应过程中添加协助缩合的载体化合物，例如通过控制添加。例如该载体化合物可以是一种聚合物而不是一种核酸(如精胺或亚精胺)。也可以调整ph，以有利于缩合。

用于产生稳定的多核苷酸递送媒介物的方法(其结合了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为该递送媒介物的结构组分)进一步描述在例如wo96/37194中，通过引用将其全文结合在此。脂质体形成还可以包括描述于以下中的示例性方法的一个或多个方面：费尔格纳(felgner)，p.l.等人，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.，usa)8：7413-7417，1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；班厄姆(bangham)等人分子生物学方法(m.mol.biol.)23：238，1965；奥尔森(olson)等人生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta)557：9，1979；斯左卡(szoka)等人美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)75：4194，1978；梅休(mayhew)等人生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta)775：169，1984；金姆(kim)等人生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta)728：339，1983；和福永(fukunaga)等人内分泌学(endocrinol.)115：757，1984。常用的用于制备用作递送媒介物的具有适当尺寸的脂质聚集体的技术包括超声处理和冻融加挤出(见例如梅耶(mayer)等人生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta)858：161，1986)。当所希望的是一致的小的(50至200nm)和相对均匀的聚集体时，可以使用微流化(梅休(mayhew)等人生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta)775：169，1984)。这些方法容易地适用于将rnai剂制剂封装到脂质体中。

脂质体有两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用而形成一种稳定的复合体。该带正电荷的核酸/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在核内体中。由于核内体内部的酸性ph，脂质体破裂，释放它们的内容物至细胞胞质中(王(wang)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)，1987，147，980-985)。

ph-敏感或带负电荷的脂质体包埋核酸而不与之复合。由于该核酸与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，一些核酸包埋于这些脂质体的含水内部。ph敏感的脂质体已经用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养中的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源基因的表达(周(zhou)等人，控释杂志(journalofcontrolledrelease)，1992，19，269-274)。

脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰胆碱。例如中性脂质体组合物可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。另一类型的脂质体组合物形成自磷脂酰胆碱(pc)，例如像大豆pc，蛋pc。另一个类型形成自磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物。

在体外和体内将脂质体引入细胞的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；wo94/00569；wo93/24640；wo91/16024；费尔格纳(felgner)，生物化学杂志(j.biol.chem.)269：2550，1994；诺贝尔(nabel)，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)90：11307，1993；诺贝尔(nabel)，人类基因疗法(humangenether.)3：649，1992；革顺(gershon)，生物化学(biochem.)32：7143，1993；和斯特劳斯(strauss)embo杂志11：417，1992。

非离子型脂质体系统也已经得以检验以确定它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括novasome^tmi(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及novasome^tmii(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将环孢霉素a递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明这类非离子型脂质体系统有效促进环孢菌素a沉积至皮肤的不同层中(胡(hu)等人，s.t.p.制药科学(s.t.p.pharma.sci.)，1994，4，6，466)。

脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此使用的指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(a)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯gm1，或者(b)是用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(peg)部分。虽然不希望受任何具体理论束缚，但是本领域认为，至少对于包含神经节苷酯、鞘磷脂或peg-衍生脂质的立体化学稳定的脂质体而言，这些立体化学稳定的脂质体的增加的循环半寿期是由于进入网状内皮系统(res)细胞的减少的摄取(艾伦(allen)等人，febs通讯，1987，223，42；吴(wu)等人，癌症研究(cancerresearch)，1993，53，3765)。

包括一种或多种糖脂的不同脂质体在本领域内是已知的。帕帕哈都久珀罗斯(papahadjopoulos)等人(纽约科学院年报(ann.n.y.acad.sci.)，1987，507，64)报道了单唾液酸神经节苷酯gm1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半寿期的能力。这些研究结果由噶碧佐(gabizon)等人(美国科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)，1988，85，6949)阐释。均为艾伦(allen)等人的美国专利号4,837,028和wo88/04924披露了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂gm1或硫酸半乳糖脑苷脂的脂质体。美国专利号5,543,152(韦伯(webb)等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1，2-sn-二肉豆蔻磷脂酰胆碱的脂质体在wo97/13499(利姆(lim)等人)中披露。

在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合至细胞膜的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与质膜融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取，并可用以递送rnai剂到巨噬细胞中。

脂质体的另外的优势包括：获得自天然磷脂类的脂质体是生物相容性的以及生物可降解的；脂质体可以合并广泛范围的水以及脂质可溶性药物；脂质体可以保护包囊化的rnai剂在其内部区室内免于受到代谢与降解(罗索夫(rosoff)，于“药物剂型”(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，卷1，245页)。在制备脂质体配制品方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。

可使用一种带正电荷的合成阳离子脂质，n-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)以形成小的脂质体，其自发地与核酸相互作用形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致递送rnai剂(参见，例如费尔格纳(felgner)，p.l.等人，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.，usa)8：7413-7417，1987和美国专利号4,897,355，关于dotma以及其与dna一起使用的说明)。

可以将一种dotma类似物、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(dotap)与磷脂组合使用形成dna络合囊泡。lipofectin^tm(毕士大研究实验室，盖瑟斯堡，马里兰州)，是一种有效试剂，用于递送高度阴离子性核酸到活组织培养细胞中，这些细胞包括带正电荷的dotma脂质体，其自发地与带负电荷的多核苷酸相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物的净电荷也为正。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地附接至带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地递送功能性核酸到例如组织培养的细胞中。另一种可商购的阳离子脂质体1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基氨)丙烷(“dotap”)(宝灵曼公司(boehringermannheim)，印第安纳波利斯，印第安纳州)不同于dotma在于该油酰基部分被酯连接而不是醚连接。

其他报道的阳离子脂质化合物包括已共轭至多个部分的那些，包括例如已共轭至两种类型的脂质中的一种的羧基精胺，并且包括化合物如5-羧基精胺基甘氨酸二辛油酰基酰胺(“dogs”)(transfectam^tm，普洛麦格(promega)，麦迪逊，威斯康星州)以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“dppes”)(见例如美国专利号5，171，678)。

另一种阳离子脂质共轭物包括用胆固醇(“dc-chol”)对该脂质进行的衍生，其已被配制成脂质体与dope的组合(参见高(gao)，x，和黄(huang)，l.，生物化学与生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)179：280，1991)。脂质聚赖氨酸，通过将聚赖氨酸共轭至dope制成，已被报道在血清存在下是有效于转染的(周(zhou)，x等人，生物化学和生物物理学报(biochim.biophys.acta)1065：8，1991)。对于某些细胞系，这些含有共轭阳离子脂质的脂质体据说显示出较低的毒性，并比含dotma组合物提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括dmrie和dmrie-hp(维考(vical)，拉霍亚(lajolla)，加利福尼亚州)和lipofectamine(dospa)(生命科技公司(lifetechnology，inc.)，盖瑟斯堡，马里兰州)。适合于寡核苷酸的递送的其他阳离子脂质在wo98/39359和wo96/37194中说明。

脂质体配制品特别适用于局部给药，脂质体比其他配制品呈现若干优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高系统性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将rnai剂给予进入皮肤的能力。在一些实施例中，脂质体用于将rnai剂递送到表皮细胞，并且也用以提高rnai剂向真皮组织(例如皮肤)的渗入。例如可局部施用这些脂质体。已记录了配制成脂质体的药物向皮肤的局部递送(见例如韦纳(weiner)等人，药物靶向杂志(journalofdrugtargeting)，1992，第2卷，405-410和杜普莱西(duplessis)等人，抗病毒研究(antiviralresearch)，18，1992，259-265；曼尼诺(mannino)，rj和富尔德-弗格里特(fould-fogerite)，s.，生物技术(biotechniques)6：682-690，1988；伊塔尼(itani)，t.等人，基因(gene)56：267-276，1987；尼古劳(nicolau)，c.等人酶学方法(meth.enz)149：157-176，1987；施特劳宾格(straubinger)，rm和帕帕哈吉欧普洛斯(papahadjopoulos)，d.酶学方法(meth.enz.)101：512-527，1983；王(wang)，c.y.和黄(huang)，l.，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)84：7851-7855，1987)。

非离子型脂质体系统也已经得以检验以确定它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括novasomei(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及novasomeii(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将一种药物递送入小鼠皮肤的真皮。具有rnai剂的这样的配制品可用于治疗皮肤病学失调。

包括irna的脂质体可被制成高度可变形的。这样的变形可以使脂质体能够通过比该脂质体的平均半径小的孔渗透。例如传递体是一种可变形的脂质体的类型。传递体可以通过将表面边缘活化剂(通常为表面活性剂)添加到一种标准的脂质体组合物中制成。包括rnai剂的传递体可以例如通过皮下地感染被递送以将rnai剂递送到皮肤中的角质形成细胞中。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在合适的经皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。此外，由于这些脂质特性，这些传递体可以是自优化的(适应例如皮肤中的孔的形状)、自我修复性的，并且可频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。

服从本发明的其他配制品描述在2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的61/018,611；2008年3月26日提交的61/039,748；2008年4月22日提交的61/047,087和2008年5月8日提交的61/051,528中。2007年10月3日提交的pct申请号pct/us2007/080331也描述了服从本发明的配制品。

传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集物，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选者。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于递送血清白蛋白至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。

表面活性剂在配制品(例如乳剂(包括微乳剂)以及脂质体)中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的与合成的)的特性进行分类与评级的最普通的方法是通过亲水/亲油平衡值(hlb)的使用。亲水基团(也称作“头”)的性质提供了用于对在配制品中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(列赫尔(rieger)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。

如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。发现非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有广泛应用并且能够在广泛的ph范围使用。总体上，取决于它们的结构，它们的hlb值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。

如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物(例如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(例如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯以及皂类。

如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。

如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基胺、n-烷基甜菜碱以及磷脂。

已经综述了表面活性物质在药品、配制品和在乳剂中的用途(列赫尔(rieger)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，1988，285页)。

用于在本发明的方法中使用的irna也可提供为胶束配制品。“胶束”在此处定义为一种特定类型的分子集合体，其中两亲性分子排列在一个球形结构中，使得这些分子的所有疏水部分向内定向，而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。

适于通过经皮的膜递送的混合胶束配制品可通过混合该sirna组合物的水溶液、碱金属c8-c22烷基硫酸盐、以及胶束形成化合物来制备。示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸单甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧胆烷基甘氨酸和其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、及其混合物。胶束形成化合物可以在添加碱金属烷基硫酸盐的同时或之后添加。混合胶束会随着基本上任何种类的这些成分的混合(但剧烈的混合)形成，以提供更小尺寸的胶束。

在一个方法中，制备一种第一胶束组合物，其包含该sirna组合物以及至少该碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合，以形成混合胶束组合物。在另一种方法中，该胶束组合物是通过将该sirna组合物、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成的化合物混合，然后添加剩余的胶束形成化合物(剧烈混合下)来制备。

可将苯酚和/或间甲酚添加到该混合胶束组合物中以稳定该配制品并防止细菌生长。可替代地，可随着胶束形成成分一起添加苯酚和/或间甲酚。也可以在该混合胶束组合物形成之后加入等渗剂，如甘油。

对于作为喷雾的胶束配制品的递送，该配制品可被装入气溶剂分配器中并将该分配器用推进剂填充。在该分配器中推进剂(其在压力下)处于液体形式。对各成分的比例进行调整，以便使该水相和推进剂相成为一体，即存在一个相。如果有两个相，有必要在分配这些内容物的部分(例如通过计量阀)之前摇动该分配器。药物试剂的分配量是从计量阀中以细雾推进。

推进剂可以包括含氢氯氟烃、含氢氟烃、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，也可以使用hfa134a(1，1，1，2四氟乙烷)。

这些必需成分的特定浓度可以通过相对简单的实验来确定。对于经口腔的吸收，通常希望的是增加例如至少两倍或三倍的对于通过经胃肠道注射或给予的剂量。

b.脂质颗粒

irna，例如本发明的dsrna可以被完全封装在脂质配制品(例如lnp)中，例如以形成splp、psplp、snalp或其他核酸-脂质颗粒。

如在此使用的，术语“snalp”指一种稳定的核酸-脂质颗粒，包括splp。如在此使用的，术语“splp”指一种核酸-脂质颗粒，其包括包囊在脂质囊泡中的质粒dna。snalp与splp典型地包含一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质(例如一种peg-脂质共轭物)。snalp与splp对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累(例如在与给予位点物理分开的位点)。splp包括“psplp”，psplp包括一种包囊化的缩合剂-核酸复合体，如在pct公开号wo00/03683中所提出的。本发明的颗粒典型地具有大约50nm至大约150nm，更典型地是大约60nm至大约130nm，更典型地是大约70nm至大约110nm，最典型地是大约70nm至大约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当出现在本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及它们的制备方法披露于例如美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432，美国公开号2010/0324120以及pct公开号wo96/40964中。

在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsrna的比率)将处于从大约1∶1至大约50∶1，从大约1∶1至大约25∶1，从大约3∶1至大约15∶1，从大约4∶1至大约10∶1，从大约5∶1至大约9∶1，或大约6∶1至大约9∶1的范围内。以上引用的范围的范围中间值也意在成为本发明的部分。

阳离子脂质可以是例如n，n-二油烯基-n，n-二甲基氯化铵(dodac)、n，n-二硬脂酰-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(i-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、n-(i-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二甲基-2，3-二油烯基氧基)丙胺(dodma)、1，2-二亚油基氧基(dilinoleyloxy)-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1，2-二亚麻基氧基(dilinolenyloxy)-n，n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1，2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1，2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(dlin-ma)、1，2-二亚油基酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亚油基酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(dlin-tma.cl)、1，2-二亚油基酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(dlin-tap.cl)、1，2-二亚油基氧基-3-(n-甲基哌嗪)丙烷(dlin-mpz)、或3-(n，n-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(dlinap)、3-(n，n-二油烯基氨基)-1，2-丙二醇(doap)、1，2-二亚油基氧代-3-(2-n，n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)、1，2-二亚麻基氧基-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(dlin-k-dma)或其类似物、(3ar，5s，6as)-n，n-二甲基-2，2-二((9z，12z)-十八-9，12-二烯)四氢-3ah-环戊[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺(aln100)、(6z，9z，28z，31z)-三十七碳-6，9，28，31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(mc3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(techg1)，或其混合物。该阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约20mol％至大约50mol％或大约40mol％。

在另一个实施例中，化合物2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环可以用来制备脂质-sirna纳米颗粒。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，将其通过引用结合于此。

在一个实施例中，该脂质-sirna颗粒包括40％2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环：10％dspc：40％胆固醇：10％peg-c-domg(摩尔百分数)，颗粒尺寸在63.0±20nm，并且具有0.027sirna/脂质比率。

该可电离的/非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、16-o-一甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(sope)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从大约5mol％至大约90mol％，大约10mol％，或大约58mol％。

抑制颗粒聚集的共轭脂质可以是例如一种聚乙二醇(peg)-脂质，其包括但不限于peg-二酰甘油(dag)、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)，或其混合物。peg-daa共轭物可以是，例如peg-二月桂基氧丙基(ci2)、peg-二肉豆蔻基氧丙基(ci4)、peg-二棕榈基氧丙基(ci6)或peg-二硬脂基氧丙基(c]8)。防止颗粒聚集的共轭脂质可以占从0mol％至约20mol％或约2mol％在颗粒中存在的总脂质。

在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占该颗粒中存在的总脂质的大约10mol％到大约60mol％或大约48mol％。

在一个实施例中，利匹哆异德(lipidoid)nd98.4hcl(mw1487)(见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，通过引用结合在此)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))和peg-神经酰胺c16(阿文蒂极性脂质公司(avantipolarlipids))可以用来制备脂质-dsrna纳米颗粒(即，lnp01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：nd98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，peg-神经酰胺c16，100mg/ml。nd98、胆固醇和peg-神经酰胺c16母液可以随后以例如42∶48∶10摩尔比合并。合并的脂质溶液可以与(例如ph5乙酸钠中的)含水dsrna混合，从而乙醇终浓度是约35％-45％并且乙酸钠终浓度是约100-300mm。一旦混合，脂质-dsrna纳米颗粒一般自发形成。取决于所需的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如lipex挤出机(北部脂质公司(northernlipids，inc))，经聚碳酸酯膜(例如100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇移除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如约ph7，例如约ph6.9、约ph7.0、约ph7.1、约ph7.2、约ph7.3或约ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)交换。

lnp01配制品例如在国际申请公开号wo2008/042973中描述，将其通过引用结合在此。

另外的示例性脂质-dsrna配制品描述于表1中。

表1

dspc：二硬脂酰磷脂酰胆碱

dppc：二棕榈酰磷脂酰胆碱

peg-dmg：peg-双二肉豆蔻酰甘油(c14-peg，或peg-c14)(平均分子量为2000的peg)

peg-dsg：peg-二苯乙烯基甘油(c18-peg，或peg-c18)(平均分子量为2000的peg)

peg-cdma：peg-氨甲酰基-1，2-二肉豆蔻基氧丙胺(平均分子量为2000的peg)

包含snalp(1，2-二亚麻基氧基-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma))的配制品描述于2009年4与15日提交的国际公开号wo2009/127060中，通过引用将其结合于此。

包括xtc的配制品描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686，以及2010年1月29日提交的国际申请号pct/us2010/022614，将其通过引用特此结合。

包括mc3的配制品描述于，例如2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120，其全部内容通过引用结合在此。

包括alny-100的配制品描述于例如以下中：例如，2009年11月10日提交的国际专利申请号pct/us09/63933，将其通过引用特此结合。

包括c12-200的配制品描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号pct/us10/33777，将其通过引用特此结合。

可电离的/阳离子脂质的合成

在本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物，例如阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。

“烷基”意味着一种直链或支链的、非环的或环的饱和脂肪族烃，包含从1至24个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、等；而不饱和环状烷基包括环丙烯基和环己烯基等。

“烯基”意味着如上定义的一种烷基，该烷基在相邻碳原子之间包含至少一个双键。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。

“炔基”意味着如上定义的任何烷烃或烯基，其另外包含在相邻碳之间的至少一个三键。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

“酰基”是指任何烷基，烯基或炔基，其中，在连接点的碳被氧代基团取代，如下所定义。例如-c(＝o)烷基、-c(＝o)烯基和-c(＝o)炔基是酰基。

“杂环”意味着一个5-至7-元单环、或7-至10-元二环的杂环，它是饱和的、不饱和的或芳香族的，并且它包含独立地选自氮、氧、和硫的从1或2个杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可以是任选地氧化的，并且该氮杂原子可以任选地是季铵化的，包括双环，其中上述杂环的任一个被稠合至一个苯环。杂环可以经任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。

术语“任选取代的烷基”，“任选取代的烯基”，“任选取代的炔基”，“任选取代的酰基”和“任选被取代的杂环””是指，当取代时，至少一个氢原子被一个取代基置换。在氧代取代基(＝o)的情况下，两个氢原子被置换。在这方面，取代基包括氧、卤素、杂环、-cn、-orx、-nrxry、-nrxc(＝o)ry、-nrxso2ry、-c(＝o)rx、-c(＝o)orx、-c(＝o)nrxry、-sonrx和-sonnrxry，其中n是0、1或2，rx和ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一个可以进一步由以下取代基的一种或多种取代：氧代、卤素、-oh、-cn、烷基、-orx、杂环、-nrxry、-nrxc(＝o)ry、-nrxso2ry、-c(＝o)rx、-c(＝o)orx、-c(＝o)nrxry、-sonrx和-sonnrxry。

“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。

在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法学是本领域技术人员熟知的(见例如有机合成中的保护基团(protectivegroupsinorganicsynthesis)，格林(greene)，t.w.等人，威利国际科学出版社(wiley-interscience)，纽约市，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除不希望的醇官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。

式a的合成

在一些实施例中，使用式a的阳离子脂质配制本发明的核酸-脂质颗粒：

其中r1和r2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且r3和r4独立地是低级烷基或r3和r4可以一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是xtc(2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2产生以上式a的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。

方案1

根据方案1制备脂质a，其中r1和r2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且r3和r4独立地是低级烷基或r3和r4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式a的脂质。式a的脂质可以用式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中x是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根等的阴离子反离子。

方案2

可替代地，可以根据方案2制备酮1原料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备格氏(grignard)试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。如方案1中所述，酮1转化成式a的相应脂质。

mc3的合成

如下制备dlin-m-c3-dma(即，(6z，9z，28z，31z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6z，9z，28z，31z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-醇(0.53g)，4-n,n-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-n,n-二甲氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5ml)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物通过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。alny-100的合成

使用以下方案3进行缩酮519[alny-100]的合成：

515的合成

在0℃在氮气氛下向双颈rbf(1l)中lialh4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水thf中的搅拌悬浮液缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mlthf中的溶液。在完成添加后，将反应混合物加温至室温并且随后加热至回流持续4小时。通过tlc监测反应的进程。在完成反应(借助tlc检测)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和na2so4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用thf充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400ml二噁烷和26ml浓hcl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的盐酸盐515。产量：7.12g1h-nmr(dmso，400mhz)：δ＝9.34(宽，2h)，5.68(s，2h)，3.74(m，1h)，2.66-2.60(m，2h)，2.50-2.45(m，5h)。

516的合成

向250ml双颈rbf中化合物515在100ml无水dcm中的搅拌悬液添加net3(37.2ml，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50ml无水dcm中的n-(苄氧羰氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应结束(通过tlc检测2-3小时)后，将混合物用1nhcl溶液(1x100ml)和饱和nahco3溶液(1x50ml)依次洗涤。随后在无水na2so4上干燥有机层并且蒸发溶剂以产生粗制材料，所述粗制材料通过硅胶柱层析纯化以获得粘性物质516。产量：11g(89％)。1h-nmr(cdcl3，400mhz)：δ＝7.36-7.27(m，5h)，5.69(s，2h)，5.12(s，2h)，4.96(br.，1h)2.74(s，3h)，2.60(m，2h)，2.30-2.25(m，2h)。lc-ms[m+h]-232.3(96.94％)。

517a和517b的合成

将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mlrbf中的220ml丙酮和水(10∶1)的溶液内，并且在室温向其中添加n-甲基吗啉-n-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2ml7.6％oso4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时)后，将混合物通过添加固体na2so3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用dcm(300ml)稀释并且用水(2x100ml)洗涤，随后用饱和nahco3(1x50ml)溶液、水(1x30ml)并最终用盐水(1x50ml)洗涤。在无水na2so4上干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱层析纯化提供了非对映异构体的混合物，所述非对映异构体由制备级hplc分离。产量：-6g粗制物

517a-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1h-nmr(dmso，400mhz)：δ＝7.39-7.31(m，5h)，5.04(s，2h)，4.78-4.73(m，1h)，4.48-4.47(d，2h)，3.94-3.93(m，2h)，2.71(s，3h)，1.72-1.67(m，4h)。lc-ms-[m+h]-266.3，[m+nh4+]-283.5存在，hplc-97.86％。通过x射线证实立体化学。

518的合成

使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得作为无色油的化合物518(1.2g，41％)。1h-nmr(cdcl3，400mhz)：δ＝7.35-7.33(m，4h)，7.30-7.27(m，1h)，5.37-5.27(m，8h)，5.12(s，2h)，4.75(m，1h)，4.58-4.57(m,2h)，2.78-2.74(m，7h)，2.06-2.00(m，8h)，1.96-1.91(m，2h)，1.62(m，4h)，1.48(m，2h)，1.37-1.25(brm，36h)，0.87(m，6h)hplc-98.65％。

用于合成化合物519的一般方法

将化合物518(1eq)在己烷(15ml)中的溶液以逐滴方式添加至lah在thf(1m，2当量)中的冰冷溶液中。在完成添加后，将混合物在40℃加热0.5小时，随后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和na2so4水溶液小心地水解，随后经塞里滤料(celite)过滤并缩减成油。柱层析提供作为无色油获得的纯519(1.3g，68％)。13cnmrδ＝130.2，130.1(x2)，127.9(x3)，112.3，79.3，64.4，44.7，38.3，35.4，31.5，29.9(x2)，29.7，29.6(x2)，29.5(x3)，29.3(x2)，27.2(x3)，25.6，24.5，23.3，226，14.1；电喷雾ms(+ve)：c44h80no2(m+h)+的分子量计算值为654.6，发现值为654.6。

通过标准或非挤出方法制备的配制品可以按类似的方式来表征。例如配制品典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的颗粒尺寸与颗粒尺寸分布可以使用例如马尔文(malvern)zetasizernanozs(马尔文公司(malvern)，usa)通过光散射来进行测量。颗粒应该是大约20-300nm，例如40-100nm尺寸。颗粒尺寸分布应该是单峰。配制品中的总dsrna浓度以及捕获的片段是使用染料排除测定来评估。配制的dsrna的样品可以与rna结合染料如ribogreen(分子探针公司(molecularprobes))在配制品破坏性表面活性物质(例如0.5％triton-x100)存在或不存在下孵育。配制品中的总dsrna可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性物质的样品的信号来确定。该捕获的片段是通过将“游离”dsrna内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总dsrna内含物中减去来确定。封装的dsrna的百分比一般大于85％。对于snalp配制品而言，颗粒尺寸是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。合适的范围典型地是大约至少50nm至大约至少110nm、大约至少60nm至大约至少100nm、或大约至少80nm至大约至少90nm。

用于口服给予的组合物与配制品包括粉末或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服配制品是以下那些：在其中本发明所表征的dsrna与一种或多种渗透增强剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。合适的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(cdca)以及乌索脱氧胆酸(udca)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆汁酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及udca的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明表征的dsrna可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合成微颗粒或纳米颗粒。dsrna复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(peg)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；deae衍生化聚亚胺、短梗霉多糖纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、n-三甲基壳聚糖、聚-l-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯p(tdae)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、deae-异丁烯酸酯、deae-己基丙烯酸酯、deae-丙烯酰胺、deae-白蛋白与deae-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(d，l-乳酸)、聚(dl-乳酸-共-乙醇酸(plga)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(peg)。dsrna的口服配制品及其制备在美国专利6,887,906、美国公开号20030027780和美国专利号6,747,014中详述，各自通过引用结合在此。

用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和配制品可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：渗透增强剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的配制品。

本发明的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。

本发明的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。

c.另外的配制品

i.乳剂

可以将本发明的组合物制备和配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以液滴形式(通常直径超过0.1μm)分散在另一种中的非均匀系统(参见安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；爱德森(idson)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页；洛索夫(rosoff)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(block)于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；希古契(higuchi)等人，于雷明顿氏药物科学(remington′spharmaceuticalsciences)，麦克出版公司(mackpublishingco.)，伊斯顿(easton)，pa.，1985，301页)。乳剂通常是双相的系统，其包含互不混溶的两个彼此紧密混合并分散的液相。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水(w/o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，例如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。此类复合配制品通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w/o/w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的系统，构成o/w/o乳剂。

乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或配制品的粘性保持这种形式。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任意相中。乳化剂可以大致分成4类：合成性表面活性物质、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；爱德森(idson)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。

合成性表面活性物质，也称作表面活性剂，已经广泛应用于乳剂的制备并且已经在文献中综述(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；列赫尔(rieger)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页；爱德森(idson)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，1988，卷1，199页)。表面活性剂典型地是两亲性分子，并且包括亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比值定义为亲水/亲油平衡值(hlb)，它是配制品制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性物质可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两亲分成不同类别(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；列赫尔(rieger)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，285页)。

乳剂配制品中使用的自然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基料具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶态硅酸铝和胶态镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。

在乳剂配制品中还包括多种非乳化材料，它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克(block)于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷2，335页；爱德森(idson)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。

亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或膨胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相小滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。

由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些配制品通常含有防腐剂。乳剂配制品中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂配制品中，以预防配制品的变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。

通过皮肤途径、口途径和肠胃途径途径使用乳状液配制品和制造它们的方法已经在文献中综述(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；爱德森(idson)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。口服递送的乳状液配制品已经非常广泛地使用，原因在于易于配制以及从吸收和生物利用率的观点看有效(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；洛索夫(rosoff)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；爱德森(idson)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性的维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w乳剂口服给予的物质。

ii微乳剂

在本发明的一个实施例中，将irna和核酸的组合物配制为微乳液。可以将微乳液定义为水、油和两亲分子的体系，所述体系是光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；洛索夫(rosoff)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分而形成透明系统。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(朗(leung)与纱(shah)，在：药物的受控释放：聚合物和聚集体系统(controlledreleaseofdrugs：polymersandaggregatesystems)，洛索夫(rosoff)，m.编著，1989，vch出版公司，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解液的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(斯科特(schott)，于雷明顿氏药物科学(remington′spharmaceuticalsciences)，麦克出版公司(mackpublishingco.)，伊斯顿(easton)，pa.，1985，第271页)。

已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且对本领域技术人员，该方法已经产生怎样配制微乳液的广泛知识(见例如安赛尔(ansel)的药物剂型与药物传递系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，艾伦(allen)，lv.，波波维奇(popovich)ng.，以及安赛尔(ansel)hc.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(lippincottwilliams&wilkins)(第8版)，纽约，ny；洛索夫(rosoff)，于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，245页；布洛克(block)于药物剂型(pharmaceuticaldosageforms)，利伯曼(lieberman)，列赫尔(rieger)与斑克(banker)(编著)，1988，马塞尔·德克公司(marceldekker，inc.)，纽约，纽约州，卷1，335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的配制品中。

在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ml310)、单油酸四甘油酯(mo310)、单油酸六甘油酯(po310)、五油酸六甘油酯(po500)、单癸酸十甘油酯(mca750)、单油酸十甘油酯(mo750)、一又二分之一油酸十甘油酯(so750)(decaglycerolsequioleate)、十油酸十甘油酯(dao750)。该助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、peg300、peg400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，例如captex300、captex355、capmulmcm、脂肪酸酯，中等链(c8-c12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolizedglyceride)，饱和的聚乙二醇化的c8-c10甘油酯、植物油和硅油。

从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已经提出基于脂质的微乳液(o/w和w/o)以增强药物(包括肽)的口服生物利用率(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(constantinides)等人，药学研究(pharmaccuticalresearch)，1994，11，1385-1390；里切尔(ritschel)，实验与临床药理学的方法与发现(meth.find.exp.clin.pharmacol.)，1993，13，205)。微乳液提供以下优点：改善药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性物质引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、临床效力改善和毒性减少(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(constantinides)等人，药学研究(pharmaceuticalresearch)，1994，11，1385；霍(ho)等人，药学科学杂志(j.pharm.sci.)，1996，85，138-143)。通常，微乳剂的成份在环境温度下混合在一起时，它们可以自然形成微乳剂。在配制热不稳定药物、肽或irna时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的经皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳液组合物和配制品将促进irna和核酸从胃肠道的全身性吸收增加以及改善irna和核酸的局部细胞摄取。

本发明的微乳液也可以含有额外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(grill3)、labrasol、和改善配制品特性并增强本发明irna和核酸吸收的渗透增强剂。本发明的微乳剂中使用的渗透增强剂可以分成归于五大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(李(lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页)。每个类型都已经在以上进行了讨论。

iii.微颗粒

本发明的rnai剂可并入到一个颗粒，例如一个微颗粒。微颗粒可通过喷雾干燥来制备，但也可以通过其他方法，包括冷冻干燥，蒸发，流化床干燥，真空干燥，或这些技术的组合来制备。

iv.渗透增强剂

在一个实施例中，本发明采用各种渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，尤其是irna。大多数药物以离子化和非离子化的形式两者存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理要穿过的膜，甚至连非亲脂药物都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。

可以将渗透增强剂划分为属于5大类之一，即，表面活性物质、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(见例如马尔姆斯滕(malmsten)，m.药物递送中的表面活性剂和聚合物(surfactantsandpolymersindrugdelivery)，英富曼卫生保健(informahealthcare)，纽约，ny，2002；李(lee)等人，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页)。在下面对每类以上提及的渗透增强剂都详细进行了阐述。

表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能减少该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是irna通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂还包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见如马尔姆斯滕(malmsten)，m.药物递送中的表面活性剂和聚合物(surfactantsandpolymersindrugdelivery)，英富曼卫生保健(informahealthcare)，纽约，ny，2002；李(lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页)；以及全氟化学乳剂如fc-43(高桥(takahashi)等人，j.pharm.pharmacol.(药物药理学杂志)，1988，40，252)。

充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物例如包括油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其c1-20烷基酯(例如、甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)及其单和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(见例如托乌托(touitou)，e.等人，药物递送的增强(enhancementindrugdelivery)，crc出版社，丹弗斯(danvers)，ma，2006；李(lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页；马尔姆斯滕(malmsten)，m.治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)。1990，7，1-33；e1哈里里(hariri)等人。药房和药理学杂志(j.pharm.pharmacol.)。1992，44，651-654)。

胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂肪维生素的分散和吸收(见例如马尔姆斯滕(malmsten)，m.药物递送中的表面活性剂和聚合物(surfactantsandpolymersindrugdelivery)，英富曼卫生保健(informahealthcare)，纽约，ny，2002；布鲁顿(brunton)，第38章，引自：古德曼&吉尔曼(goodman&gilman)的治疗学的药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)，第9版，哈德曼(hardman)等人编著，麦格劳希尔(mcgraw-hill)，纽约，1991，第934-935页)。各种天然胆汁盐和它们的合成衍生物作为渗透增强剂起作用。因此术语“胆汁盐”包括胆汁中天然存在的任意成分和它们的任意合成衍生物。适合的胆盐包括，例如胆酸(或其药学上可接受的的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(udca)、牛磺-24,25-二氢夫西地酸钠(stdhf)、二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(poe)(见例如马尔姆斯滕(malmsten)，m.药物递送中的表面活性剂和聚合物(surfactantsandpolymersindrugdelivery)，英富曼卫生保健(informahealthcare)，纽约，ny，2002；李(lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页；斯温亚德(swinyard)，第39章，引自：雷明顿氏药物科学(remington′spharmaceuticalsciences)，第18版，真纳罗(gennaro)编著，麦克出版公司(mackpublishingco.)，伊斯顿(easton)，pa.，1990，第782-783页；马尔姆斯滕(malmsten)，m.治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1990，7，1-33；山本(yamamoto)等人，药理学与实验治疗学杂志(j.pharmacol.exp.ther.)，1992，263，25；山下(yamashita)等人，药学科学杂志(j.pharm.sci.)，1990，79，579-583)。

与本发明有关使用的的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的irna的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的应用，因为大多数特征化的dna核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当dnase抑制剂的附加优势(加热特(jarrett)，j.chromatogr.(层析学杂志)，1993，618，315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(edta)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯(homovanilate))、胶原质的n-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和b-二酮的n-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如凯特戴尔，a.等人，用于制药、生物技术和药物递送的赋形剂的发展(excipientdevelopmentforpharmaceutical，biotechnology，anddrugdelivery)，crc出版社，丹弗斯(danvers)，ma，2006；李(lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页；村西(muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1990，7，1-33；布尔(buur)等人，控制释放杂志(j.controlrel.)，1990，14，43-51)。

如本文所用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强irna经消化道粘膜吸收的化合物(见例如村西(muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1990，7，1-33)。这种类别的渗透增强剂包括例如不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(李(lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems)，1991，第92页)；和非甾体抗炎药如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(山本(yamashita)等人，药物药理学杂志(j.pharm.pharmacol.)，1987，39，621-626)。

也可以添加在细胞水平增强摄取irna的试剂至本发明的药物组合物和其他组合物。例如阳离子脂质，如脂质体(淳一(junichi)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(洛洛(lollo)等人，pct申请wo97/16529)也已知增强dsrna的细胞摄取。市售转染试剂的例子包括例如lipofectamine^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(invitrogen；carlsbad，ca))、lipofectamine2000^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、293fectin^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、cellfectin^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、dmrie-c^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、freestvle^tmmax(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、lipofectamine^tm2000cd(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、lipofectamine^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、rnaimax(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、oligofectamine^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、optifect^tm(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、x-tremegeneq2转染试剂(罗氏公司(roche)；格兰扎克尔街，瑞士(grenzacherstrasse，switzerland))、dotap脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)、dosper脂质体转染试剂(格兰扎克尔街，瑞士)或fugene(格兰扎克尔街，瑞士)、试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州(promega；madison，wi))、transfast^tm转染试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、tfx^tm-20试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、tfx^tm-50试剂(普洛麦格公司，麦迪逊市，威斯康辛州)、dreamfect^tm(oz生命科学公司；马赛市，法国(ozbiosciences；marseille，france))、ecotransfect(oz生命科学公司；马赛市，法国)、transpass^ad1转染试剂(新英格兰生物实验室；伊普斯威奇市，马萨诸塞州，美国(newenglandbiolabs；ipswich，ma，usa))、lyovec^tm/lipogen^tm(英杰公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(invivogen；sandiego，ca，usa))、perfectin转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国(genlantis；sandiego，ca，usa))、neuroporter转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、geneporter转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、geneporter2转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、cytofectin转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、baculoporter转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、troganporter^tm转染试剂(genlantis公司；圣地亚哥市，加利福尼亚州，美国)、ribofect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国(bioline；taunton，ma，usa))、plasfect(星谱生计公司；陶顿市，马萨诸塞州，美国)、unifector(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国(b-bridgeinternational，mountainview，ca，usa))、surefector(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)或hifect^tm(晨桥国际公司；山景城，加利福尼亚州，美国)，连同其他。

可以用其他试剂来增强所施用核酸的渗透，包括二醇如乙二醇和丙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮和萜类如苧烯和薄荷酮。

v.载体

本发明的某些组合物还向配制品中并入了载体化合物。如在此所使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用(一般后一种物质过量)可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′异硫氰酸茋-2，2′-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsrna的回收可以减少(宫尾(miyao)等人，dsrna研究与研发(dsrnares.dev.)，1995，5，115-121；高仓(takakura)等人，dsrna&核酸药物研发(dsrna&nucl.aciddrugdev.)，1996，6，177-183)。

vi.赋形剂

与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，并且当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于、粘合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。

适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。

适当的药学可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

vii.其他组分

本发明的组合物另外可以包括其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包括另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包括对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。

水性悬浮液可以包括增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。

在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包含(a)一种或多种irna化合物和(b)通过非rnai机制发挥作用，并且对于治疗出血性疾病很有用的一种或多种试剂。这些试剂的实例包括，但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒和/或抗纤维化剂。此外，其他常用于保护肝脏的药物，如水飞蓟素，也可以与在此描述的irna结合使用。其他有用于治疗肝脏疾病的试剂包括替比夫定，恩替卡韦和蛋白酶抑制剂，如特拉匹韦和例如在董(tung)等人，美国专利申请公开号2005/0148548、2004/0167116、和2003/0144217；以及在黑尔(hale)等人，美国专利申请公开号2004/0127488中披露的其他试剂。

此类化合物的毒性与治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定ld50(50％群体的致死剂量)以及ed50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率ld50/ed50。优选那些表现出高的治疗指数的化合物。

获得自细胞培养测定与动物研究的数据可以在配制一系列的用于在人类中使用的剂量方面使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ed50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。可以在动物模型中配制一种剂量以实现包括化合物或(当适宜时)靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如实现所述多肽浓度减少)，其中所述血浆浓度包括如在细胞培养物中所测定的ic50(即，试验化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相层析。

除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的irna与在治疗由serpinc1表达介导的病理学过程方面有效的其他已知试剂联合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或本文所述的标准功效量值所观察到的结果，施用医师可以调整施用irna的量和时间。

vi.本发明的方法

本发明还提供了使用本发明的irna和/或包含本发明的irna的组合物来减少和/或抑制细胞中的serpinc1表达的方法。在其他方面，本发明提供了用来减少和/或抑制细胞中的serpinc1表达的本发明的irna和/或包括本发明的irna的组合物。在又其他方面，提供了本发明的irna和/或包括本发明的irna的组合物用来制造用于减少和/或抑制细胞中的serpinc1表达的药物中的用途。

这些方法和用途包括：将该细胞与本发明的irna，例如dsrna进行接触并且维持该细胞一段时间，该时间足以获得serpinc1基因的mrna转录本的降解，由此抑制该细胞中的serpinc1基因的表达。

基因表达的减少可以通过本领域内已知的任何方法来进行评估。例如serpinc1的表达的减少可以通过如下进行确定：使用对本领域内的普通技术人员而言常规的方法(例如，rna印迹法、qrt-pcr)来确定serpinc1的mrna表达水平，使用对本领域内的普通技术人员而言常规的方法(例如，蛋白质印迹法、免疫技术)来确定serpinc1的蛋白水平，和/或确定serpinc1的生物活性，例如对与细胞血液凝固机制相关联的一种或多种分子(或者在体内的背景下血液凝固其自身)的影响。

在本发明的方法和用途中，该细胞可以在体外或体内被接触，即，该细胞可以在一个受试者体内。

适合于使用本发明的方法进行治疗的细胞可以是表达serpinc1基因的任何细胞。适合于在本发明的方法和用途中使用的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类细胞(例如人类细胞或非人类灵长类细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类细胞(例如母牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞、或水牛细胞)、鸟细胞(例如鸭细胞或鹅细胞)、或鲸细胞。在一个实施例中，该细胞是人类细胞，例如人类肝细胞。

serpinc1表达在该细胞中可被抑制至少大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、以及21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或大约100％。

本发明的体内方法和用途可以包括将包含irna的组合物给予受试者，其中该irna包括与有待治疗的哺乳动物的serpinc1基因的rna转录本的至少一部分互补的一个核苷酸序列。当有待治疗的有机体是哺乳动物(例如人类)时，该组合物可以通过本领域内已知的任何手段进行给予，这些手段包括但不限于经口、腹膜内、或肠胃外途径(包括颅内(例如心室内、实质内、和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶剂)、经鼻、直肠以及局部(包括口腔与舌下)给予)。在某些实施例中，通过静脉内输注或注射给予这些组合物。

在一些实施例中，该给予是经由积存注射。积存注射可以在一个延长的时期以连贯的方式释放该irna。因此，积存注射可以减少为了获得所希望的效果而需要给药的频率，例如所希望的serpinc1的抑制、或治疗或预防效果。积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射包括皮下注射或肌内注射。在优选的实施例中，该积存注射是皮下注射。

在一些实施例中，该给予是经由一个泵。该泵可以是外部泵或手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是一个皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是一个输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选的实施例中，该输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，该泵是一个手术植入泵，其递送该irna至肝。

给予的模式取决于是希望局部治疗还是系统性治疗并且基于有待治疗的区域来进行选择。给予的途径与位点可以被选择为增强靶向。

在一个方面，本发明还提供了用于抑制哺乳动物(例如人类)中serpinc1基因表达的方法。本发明也提供了包括一种靶向哺乳动物的细胞中serpinc1基因的irna(例如dsrna)的组合物，用来抑制该哺乳动物中serpinc1基因的表达。在另一方面，本发明提供了靶向哺乳动物的细胞中的serpinc1基因的一种irna(例如dsrna)在制造用于抑制该哺乳动物中serpinc1基因表达的药物中的用途。

这些方法和用途包括向该哺乳动物(例如人类)给予包括靶向该哺乳动物细胞中的serpinc1基因的irna(例如dsrna)的组合物并且维持该哺乳动物一段时间，该时间足以获得该serpinc1基因的mrna转录本的降解，由此抑制该serpinc1基因在该哺乳动物中的表达。

基因表达的减少可以通过本领域内任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如qrt-pcr)来进行评估。蛋白产物的减少可以通过本领域内任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如elisa)来进行评估。在一个实施例中，穿刺肝脏活组织检查样品作为组织材料以用于监测serpinc1基因和/或蛋白表达的减少。在另一个实施例中，血样作为组织材料用于监测serpinc1基因和/或蛋白表达的减少。在其他实施例中，serpinc1基因的表达的抑制间接地通过例如确定serpinc1途径中的基因的表达和/或活性来进行监测(参见例如图1)。例如因子xa的活性可以被监测以确定serpinc1基因的表达的抑制。还可以测量样品(例如血液或肝样品)中的抗凝血酶水平、凝块形成和/或内源性凝血酶潜力。合适的测定在以下实例部分进行进一步描述。

本发明进一步提供了治疗患有将从减少serpinc1表达受益的障碍例如血友病的受试者的方法。本发明的治疗方法(和用途)包括向该受试者(例如人类)给予治疗有效量的靶向serpinc1基因的一种irna或包括靶向serpinc1基因的irna的药物组合物，由此治疗患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者。

在一个方面，本发明提供了预防患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者的至少一种症状的方法。该方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的irna(例如dsrna)或载体，由此预防患有将从减少serpinc1表达受益的障碍的受试者的至少一种症状。例如本发明提供了用于预防遭受将从减少serpinc1表达受益的障碍例如血友病的受试者的出血的方法。

在另一个方面，本发明提供了治疗有效量的本发明的irna用于治疗受试者，例如患有将从减少和/或抑制serpinc1表达受益的受试者的用途。该irna包括靶向一种serpinc1基因的irna或包括靶向一种serpinc1基因的irna的一种药物组合物。

在又另一个方面，本发明提供了本发明的靶向serpinc1基因的一种irna或包括靶向serpinc1基因的一种irna的一种药物组合物在制造用于治疗受试者，例如将从减少和/或抑制serpinc1表达受益的受试者的用途。

在另一个方面，本发明提供了本发明的irna(例如dsrna)用于预防遭受将从减少和/或抑制serpinc1表达受益的障碍(如出血性障碍，例如血友病)的受试者的至少一种症状的用途。

在一个另外的方面，本发明提供了本发明的irna在制造用于预防遭受将从减少和/或抑制serpinc1表达受益的障碍(如出血性障碍，例如血友病)的受试者的至少一种症状的药物中的用途。可以将本发明的irna以“裸”形式或作为“游离irna”进行给予。裸irna是在药物组合物不存在下进行给予。该裸irna可以处在合适的缓冲液中。该缓冲液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任意组合。在一个实施例中，该缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。可以将包含该irna的缓冲液的ph与体积摩尔渗透压浓度进行调节，使得它适合于给予受试者。

可替代地，可以将本发明的irna作为药物组合物进行给予，例如dsrna脂质体配制品。

将从减少和/或抑制serpinc1基因表达受益的受试者是患有出血性障碍，例如如此处所述的遗传性出血性障碍或获得性出血性障碍的那些。在一个实施例中，患有遗传性出血性障碍的受试者患有血友病，例如血友病a、b、或c。在一个实施例中，患有遗传性出血性障碍例如血友病的受试者是一个抑制剂受试者。在一个实施例中，该抑制剂受试者患有血友病a。在另一个实施例中，该抑制剂受试者患有血友病b。在又另一个实施例中，该抑制剂受试者患有血友病c。对将从减少和/或抑制serpinc1基因表达受益的受试者的治疗包括治疗性(例如应需，例如受试者正在出血(自发出血或因为外伤而出血)并且没有凝块)和预防性(例如该受试者没有正在出血和/或待经历手术)处理。

本发明进一步提供了用于使用irna或其药物组合物的方法和用途，例如用于治疗将会受益于serpinc1表达的减少和/或抑制的受试者，该受试者例如是患有出血性障碍的受试者，这些方法与其他药品和/或其他治疗方法组合使用，例如与已知的药品和/或已知的治疗方法(例如像目前采用以治疗这些障碍的那些)组合使用。例如在某些实施例中，将靶向serpinc1的irna与例如在如此处其他地方所述的出血性障碍的治疗中有用的试剂组合地给予。例如适用于治疗将从减少serpinc1表达中受益的受试者(例如患有出血性障碍的受试者)的另外的疗法和治疗性方法包括新鲜冷冻血浆(ffp)；重组fviia；重组fix；fxi浓缩物；病毒灭活的含vwf的fviii浓缩物；脱敏疗法，其可包括大剂量的fviii或fix，以及类固醇或静脉内注射用免疫球蛋白(ivig)和环磷酰胺；血浆置换连同免疫抑制和输注fviii或ffx，使用或不使用抗纤溶疗法；免疫耐受诱导(iti)，使用或不使用免疫抑制疗法(如环磷酰胺，泼尼松，和/或抗cd20)；醋酸去氨加压素[ddavp]；抗纤溶剂，如氨基己酸和氨甲环酸；活化的凝血酶原复合物浓缩物(pcc)；抗血友病剂；皮质类固醇；免疫抑制剂；和雌激素。可以将该irna以及另外的治疗试剂和/或治疗在相同时间和/或在相同组合中进行给予，例如非肠胃地，或者可以将该另外的治疗试剂作为一种单独组合物的部分或在单独的时间和/或通过本领域内已知的或在此描述的另一种方法进行给予。

在一个实施例中，这些方法和用途包括将在此表征的组合物进行给予，这样使得靶标serpinc1基因的表达被减少持续例如大约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、或大约80小时。在一个实施例中，靶标serpinc1基因的表达被减少持续一个延长的持续期，例如至少大约两天、三天、四天、五天、六天、七天或更长，例如大约一周、两周、三周或大约四周或更长。

优选地，用于此处表征的方法、用途和组合物的irna特异性靶向靶标serpinc1基因的(初级或经加工的)rna。使用irna抑制这些基因表达的组合物、用途和方法可以如此处所述那样制备和实施。

根据本发明的方法和用途给予dsrna可以导致患有出血性障碍的患者的此类疾病或病症的严重性、体征、症状、和/或标志物减少。在上下文中“减少”意为此水平的统计学上的显著减少。该减少可以是例如至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或大约100％。

可以评估治疗或预防疾病的功效，例如通过测量病情进展、疾病缓解、症状严重性、出血频率、疼痛减少、生活质量、维持治疗效果所要求的药物剂量、适于为了预防而正在治疗或靶向的给定疾病的疾病标志物或任何其他可度量参数的水平。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防效果，这在本领域内的普通技术人员的能力范围之内。例如出血性障碍的治疗的效果可以通过例如凝血酶：抗凝血酶水平的周期性监测来进行评估。稍后数据与初始数据的比较为医师提供了该治疗是否有效的指示。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防效果，这在本领域内的普通技术人员的能力范围之内。关于给予靶向serpinc1的irna或其药物组合物，“有效抵抗”出血性障碍表明以临床上适当的方式进行给予会对至少统计学上显著分数的病人产生有益效果，例如改善的症状、治愈、疾病减少、生命延长、生活质量改善、或被熟悉出血性障碍及相关原因的医生大体上认可为是积极的其他影响。

当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学上显著的改善的时候，或者通过使得不能恶化或发展否则可以被预期的症状，治疗或预防效果是明显的。作为一个实例，在疾病的可测量参数方面的至少10％，并且优选是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。也可以使用如本领域已知的给定疾病的实验动物模型，判定给定irna药物或这种药物的配制品的功效。当使用实验动物模型时，当观察到统计学上显著的标志物或症状减少时治疗效果是明显的。

可替代地，该效果可以基于临床上接受的疾病严重性分级量表(例如一个实例，肝功能评分(child-pughscore)，有时称作肝功能分级评分(child-turcotte-pughscore))，通过如诊断领域内的普通技术人员所确定的疾病严重性的减少来进行测量。产生例如使用合适的量表而测量的疾病严重性的减轻的任何积极的改变代表使用如在此描述的irna或irna配制品的足够的治疗。

可以给予受试者治疗量的irna，例如大约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kgdsrna、2.6mg/kgdsrna、2.7mg/kgdsrna、2.8mg/kgdsrna、2.9mg/kgdsrna、3.0mg/kgdsrna、3.1mg/kgdsrna、3.2mg/kgdsrna、3.3mg/kgdsrna、3.4mg/kgdsrna、3.5mg/kgdsrna、3.6mg/kgdsrna、3.7mg/kgdsrna、3.8mg/kgdsrna、3.9mg/kgdsrna、4.0mg/kgdsrna、4.1mg/kgdsrna、4.2mg/kgdsrna、4.3mg/kgdsrna、4.4mg/kgdsrna、4.5mg/kgdsrna、4.6mg/kgdsrna、4.7mg/kgdsrna、4.8mg/kgdsrna、4.9mg/kgdsrna、5.0mg/kgdsrna、5.1mg/kgdsrna、5.2mg/kgdsrna、5.3mg/kgdsrna、5.4mg/kgdsrna、5.5mg/kgdsrna、5.6mg/kgdsrna、5.7mg/kgdsrna、5.8mg/kgdsrna、5.9mg/kgdsrna、6.0mg/kgdsrna、6.1mg/kgdsrna、6.2mg/kgdsrna、6.3mg/kgdsrna、6.4mg/kgdsrna、6.5mg/kgdsrna、6.6mg/kgdsrna、6.7mg/kgdsrna、6.8mg/kgdsrna、6.9mg/kgdsrna、7.0mg/kgdsrna、7.1mg/kgdsrna、7.2mg/kgdsrna、7.3mg/kgdsrna、7.4mg/kgdsrna、7.5mg/kgdsrna、7.6mg/kgdsrna、7.7mg/kgdsrna、7.8mg/kgdsrna、7.9mg/kgdsrna、8.0mg/kgdsrna、8.1mg/kgdsrna、8.2mg/kgdsrna、8.3mg/kgdsrna、8.4mg/kgdsrna、8.5mg/kgdsrna、8.6mg/kgdsrna、8.7mg/kgdsrna、8.8mg/kgdsrna、8.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、9.1mg/kgdsrna、9.2mg/kgdsrna、9.3mg/kgdsrna、9.4mg/kgdsrna、9.5mg/kgdsrna、9.6mg/kgdsrna、9.7mg/kgdsrna、9.8mg/kgdsrna、9.9mg/kgdsrna、9.0mg/kgdsrna、10mg/kgdsrna、15mg/kgdsrna、20mg/kgdsrna、25mg/kgdsrna、30mg/kgdsrna、35mg/kgdsrna、40mg/kgdsrna、45mg/kgdsrna、或大约50mg/kgdsrna。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在某些实施例中，例如当本发明的组合物包括如在此描述的dsrna以及脂质时，可以给予受试者治疗量的irna，例如大约0.01mg/kg至大约5mg/kg、大约0.01mg/kg至大约10mg/kg、大约0.05mg/kg至大约5mg/kg、大约0.05mg/kg至大约10mg/kg、大约0.1mg/kg至大约5mg/kg、大约0.1mg/kg至大约10mg/kg、大约0.2mg/kg至大约5mg/kg、大约0.2mg/kg至大约10mg/kg、大约0.3mg/kg至大约5mg/kg、大约0.3mg/kg至大约10mg/kg、大约0.4mg/kg至大约5mg/kg、大约0.4mg/kg至大约10mg/kg、大约0.5mg/kg至大约5mg/kg、大约0.5mg/kg至大约10mg/kg、大约1mg/kg至大约5mg/kg、大约1mg/kg至大约10mg/kg、大约1.5mg/kg至大约5mg/kg、大约1.5mg/kg至大约10mg/kg、大约2mg/kg至大约2.5mg/kg、大约2mg/kg至大约10mg/kg、大约3mg/kg至大约5mg/kg、大约3mg/kg至大约10mg/kg、大约3.5mg/kg至大约5mg/kg、大约4mg/kg至大约5mg/kg、大约4.5mg/kg至大约5mg/kg、大约4mg/kg至大约10mg/kg、大约4.5mg/kg至大约10mg/kg、大约5mg/kg至大约10mg/kg、大约5.5mg/kg至大约10mg/kg、大约6mg/kg至大约10mg/kg、大约6.5mg/kg至大约10mg/kg、大约7mg/kg至大约10mg/kg、大约7.5mg/kg至大约10mg/kg、大约8mg/kg至大约10mg/kg、大约8.5mg/kg至大约10mg/kg、大约9mg/kg至大约10mg/kg、或大约9.5mg/kg至大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以按以下剂量给予dsrna：大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在其他实施例中，例如当本发明的组合物包括如在此描述的dsrna以及n-乙酰半乳糖胺时，可以给予受试者治疗量的irna，例如一个以下的剂量：大约0.1至大约50mg/kg、大约0.25至大约50mg/kg、大约0.5至大约50mg/kg、大约0.75至大约50mg/kg、大约1至大约50mg/mg、大约1.5至大约50mg/kb、大约2至大约50mg/kg、大约2.5至大约50mg/kg、大约3至大约50mg/kg、大约3.5至大约50mg/kg、大约4至大约50mg/kg、大约4.5至大约50mg/kg、大约5至大约50mg/kg、大约7.5至大约50mg/kg、大约10至大约50mg/kg、大约15至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约20至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约25至大约50mg/kg、大约30至大约50mg/kg、大约35至大约50mg/kg、大约40至大约50mg/kg、大约45至大约50mg/kg、大约0.1至大约45mg/kg、大约0.25至大约45mg/kg、大约0.5至大约45mg/kg、大约0.75至大约45mg/kg、大约1至大约45mg/mg、大约1.5至大约45mg/kb、大约2至大约45mg/kg、大约2.5至大约45mg/kg、大约3至大约45mg/kg、大约3.5至大约45mg/kg、大约4至大约45mg/kg、大约4.5至大约45mg/kg、大约5至大约45mg/kg、大约7.5至大约45mg/kg、大约10至大约45mg/kg、大约15至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约20至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约25至大约45mg/kg、大约30至大约45mg/kg、大约35至大约45mg/kg、大约40至大约45mg/kg、大约0.1至大约40mg/kg、大约0.25至大约40mg/kg、大约0.5至大约40mg/kg、大约0.75至大约40mg/kg、大约1至大约40mg/mg、大约1.5至大约40mg/kb、大约2至大约40mg/kg、大约2.5至大约40mg/kg、大约3至大约40mg/kg、大约3.5至大约40mg/kg、大约4至大约40mg/kg、大约4.5至大约40mg/kg、大约5至大约40mg/kg、大约7.5至大约40mg/kg、大约10至大约40mg/kg、大约15至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约20至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约25至大约40mg/kg、大约30至大约40mg/kg、大约35至大约40mg/kg、大约0.1至大约30mg/kg、大约0.25至大约30mg/kg、大约0.5至大约30mg/kg、大约0.75至大约30mg/kg、大约1至大约30mg/mg、大约1.5至大约30mg/kb、大约2至大约30mg/kg、大约2.5至大约30mg/kg、大约3至大约30mg/kg、大约3.5至大约30mg/kg、大约4至大约30mg/kg、大约4.5至大约30mg/kg、大约5至大约30mg/kg、大约7.5至大约30mg/kg、大约10至大约30mg/kg、大约15至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约20至大约30mg/kg、大约25至大约30mg/kg、大约0.1至大约20mg/kg、大约0.25至大约20mg/kg、大约0.5至大约20mg/kg、大约0.75至大约20mg/kg、大约1至大约20mg/mg、大约1.5至大约20mg/kb、大约2至大约20mg/kg、大约2.5至大约20mg/kg、大约3至大约20mg/kg、大约3.5至大约20mg/kg、大约4至大约20mg/kg、大约4.5至大约20mg/kg、大约5至大约20mg/kg、大约7.5至大约20mg/kg、大约10至大约20mg/kg、或大约15至大约20mg/kg。在一个实施例中，当本发明的组合物包括如此处所述的dsrna和n-乙酰半乳糖胺时，受试者可被给予大约10至大约30mg/kg的治疗量的dsrna。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如可以给予受试者治疗量的irna：例如大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

可以通过静脉输注经一个时期来给予该irna，例如经5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、以及21、22、23、24、或大约25分钟的时期。该给予可以例如在一个常规基础上(例如每周地、双周地(即，每两周))重复持续一个月、两个月、三个月、四个月或更久。在初始治疗方案之后，可以将这些治疗以一个频繁度更低的基础来进行给予。例如在每周或双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。

在一个实施例中，本发明提供了用于治疗遭受一种出血性障碍(例如血友病)的受试者的方法，通过皮下向所述受试者给予大约0.5mg/kg至大约5mg/kg或大约1mg/kg至大约3mg/kg的每周累积剂量的化合物ad-57213。

在一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约0.5mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约0.5mg/kg的每周累积剂量，如每周0.5.mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约0.5mg/kg的每周累积剂量，如每两周1mg/kg。

在另一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约1.5mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约1.5mg/kg的每周累积剂量，如每周1.5.mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约1.5mg/kg的每周累积剂量，如每两周3mg/kg。

在另一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约2mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约2mg/kg的每周累积剂量，如每周2mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约2mg/kg的每周累积剂量，如每两周4mg/kg。

在又另一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约3mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约3mg/kg的每周累积剂量，如每周3mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约3mg/kg的每周累积剂量，如每两周6mg/kg。

在另一个实施例中，本发明提供了用于预防受试者的出血性障碍(例如血友病)的至少一种症状的方法，通过皮下向该受试者给予大约0.5mg/kg至大约5mg/kg或大约1mg/kg至大约3mg/kg的每周累积剂量的化合物ad-57213。

在一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约0.5mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约0.5mg/kg的每周累积剂量，如每周0.5.mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约0.5mg/kg的每周累积剂量，如每两周1mg/kg。

在另一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约1.5mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约1.5mg/kg的每周累积剂量，如每周1.5.mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约1.5mg/kg的每周累积剂量，如每两周3mg/kg。

在另一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约2mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约2mg/kg的每周累积剂量，如每周2mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约2mg/kg的每周累积剂量，如每两周4mg/kg。

在又另一个实施例中，该方法可包括皮下地向该受试者给予大约3mg/kg的每周累积剂量。例如在一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约3mg/kg的每周累积剂量，如每周3mg/kg。在另一个实施例中，该方法可包括向该受试者给予大约3mg/kg的每周累积剂量，如每两周6mg/kg。

该irna的给予可以减少患者的细胞、组织、血液、尿或其他区室的serpinc1水平至少大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、以及21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、39％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少大约99％或更多。

在一个实施例中，该治疗和/或预防方法包括以足以抑制例如患者的细胞、组织、血液、尿液或其他区室中的serpinc1水平以减少至少约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、69％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、或约80％的剂量皮下给予受试者化合物ad-57213。

在给予全剂量的irna之前，可以给予患者较小的剂量，例如5％输注反应，并且监测不良影响，例如过敏反应。在另一个实例中，针对不想要的免疫刺激作用(例如增加的细胞因子(例如tnf-α或inf-α)水平)对该患者进行监测。

由于对serpinc1表达的抑制性作用，根据本发明的组合物或从其中制备的药物组合物可以提高生活质量。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明中表征的irna和方法，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式以其全文结合。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。

实例

实例1.irna合成

试剂来源

当本文没有专门给出试剂来源时，这种试剂可以从分子生物学试剂的任何供应商获得，其质量/纯度标准符合分子生物学应用。

转录本

进行sirna设计以鉴别靶向ncbi基因库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中注释的人类、恒河猴(rhesus或macacamulatta)、狗、小鼠和大鼠serpinc1转录本的sirna。设计使用了以下来自ncbirefseq集的转录本：人类-nm_000488.2；nm_000488.3；恒河猴-nm_001104583.1；狗-xm_856414.1；小鼠-nm_080844.4；大鼠-nm_001012027.1。由于灵长类/犬/啮齿动物的高序列差异，sirna双链体被设计为几个单独的批次，包括但不限于包含匹配以下各项的双链体的批次：只匹配人和恒河猴转录本；只匹配人类、恒河猴和狗的转录本；只匹配人类、恒河猴、小鼠和大鼠的转录本；以及只匹配小鼠和大鼠的转录本。所有的sirna双链体被设计为与所列的人类转录本和考虑的每一设计批次(上述)的其他种类转录本具有100％一致性。

sirna设计、特异性以及效果预测

从每一序列预测所有可能的19mcr的预测特异性。然后对缺少长于7个核苷酸的重复的候选19mer进行选择。在使用测试脚本“bruteforce.py”中的一个详尽的“brute-force”算法实现的适当的转录组(定义为人类、恒河猴、狗、小鼠或大鼠ncbi的refseq组中的nm_和xm_记录的组)的全面搜索中使用这874个人/恒河猴、67个人/恒河猴/狗、103个人/恒河猴/小鼠/大鼠和569个小鼠/大鼠的候选sirna。该脚本接下来解析该转录本-寡核苷酸比对，以产生基于该sirna和任何潜在的“脱靶”转录本之间的错配的位置和数目的分数。对该脱靶分数进行加权，以强调sirna的“种子”区域的差异，在从该分子的5′末端开始的位置2-9处。

通过求和单个错配得分，每个寡转录本对从蛮力搜索(brute-forcesearch)被赋予了错配分数；在位置2-9的错配被计数为2.8，在切割位点位置10-11的错配被计数为1.2，并且在区域12-19中的错配被计数为1.0。通过对衍生自每个寡核苷酸的种子衍生的六聚物的七聚物和八聚物的频率做比较进行另外的脱靶预测。来自相对于5′起始的位置2-7的六聚物被用来产生2个七聚物和一个八聚物。‘七聚物1’是通过将一个3′-a添加到六聚物产生的；七聚物2是通过将一个5′-a添加到六聚物产生的；该八聚物是将通过一个a添加到六聚物的5′和3′端产生的。在人类、恒河猴、小鼠或大鼠3′-utrome中的八聚物和七聚物的频率(定义为来自ncbi的refseq数据库中的转录组的子序列，其中编码区的端部，该‘cds’，被清楚地定义)是预先计算的。以使用来自八聚物频率的范围的中间值将八聚物频率归一化为七聚物频率。然后通过计算((3x归一化的八聚物计数)+(2x七聚物2计数)+(1x七聚物1计数))的总和来计算“mirseedscore′。

两种sirna链被指定为根据计算分数的特异性分类：得分高于3为高特异性的、等于3为特异性的，并且在2.2与2.8之间为中等特异性的。通过反义链的特异性对这些双链体进行分类，并选择其反义寡聚物在第一位置缺乏gc、在位置13和14两处缺乏g、并且在种子区有3个或更多us或as的那些双链体。

sirna序列选择

合成来自人/恒河猴的总共66个有义和66个反义，来自人/恒河猴/小鼠的6个有义和6个反义，12个人/恒河猴/小鼠/大鼠和来自小鼠/大鼠sirna寡聚物的21个有义和21个反义并形成双链体。sepinc1有义和反义链序列的详细列表显示在表3和4。

sirna合成

i.通用中小规模的rna合成程序

根据标准的固相寡核苷酸合成方案，使用可商购的5′-o-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-0-叔丁基二甲基甲硅烷基-3′-o-(2-氰基乙基-n，n-二异丙基)尿苷亚磷酰胺单体、4-n-乙酰胞苷、6-n-苯甲酰基腺苷和2-n-异丁酰基鸟苷以及相应的2′-o-甲基和2′-氟代亚磷酰胺，在0.2-500μmol之间的规模合成rna寡核苷酸。以0.1-0.15m浓度制备该亚酰胺(amidite)溶液并将5-乙硫基-1h-四唑(乙腈中0.25-0.6m)用作活化剂。在合成过程中用在二甲基吡啶∶乙腈(1∶1)(v∶v)中的0.2m苯乙酰二硫化物(pads)或在吡啶中的0.1m3-(二甲氨基亚甲基)氨基-3h-1，2,4-二噻唑-5-硫酮(ddtt)引入硫代磷酸酯骨架修饰以用于氧化步骤。在合成完成后，从固体支持物切割下这些序列，并用甲胺接着用三乙胺.3hf去保护以除去存在的任何2′-o-叔丁基二甲基甲硅烷基保护基。

对于5-500μmol之间合成规模和完全2′修饰的序列(2′-氟和/或2′-o-甲基或其组合)，使用3∶1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水在35℃持续16h或在55℃持续5.5h对这些寡核苷酸进行去保护。在氨去保护之前，将这些寡核苷酸在固体支持物上用乙腈中的0.5m哌啶处理20min。通过lc-ms和阴离子交换hplc(iex-hplc)分析粗制的寡核苷酸。使用：20mm磷酸盐，10％-15％acn，ph＝8.5(缓冲液a)以及20mm磷酸盐，10％-15％acn，1mnabr，ph＝8.5(缓冲液b)通过iexhplc，进行对这些寡核苷酸进行纯化。通过分析型hplc分析级分纯度。将具有合适纯度的含产物的级分汇集，并于脱盐之前在旋转式蒸发器上浓缩。将样品通过尺寸排阻层析脱盐并冻干至干燥。将等摩尔量的有义和反义链在1xpbs缓冲液中退火，以制备相应的sirna双链体。

对于小规模(0.2-1μmol)，合成在mermade192合成器上以96孔版式进行。在充分地2′-修饰的序列(2′-氟和/或2′-o-甲基或其组合)的情况下，将这些寡核苷酸使用甲胺在室温下30-60min，然后在60℃孵化30min，或用3∶1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水在室温下30-60分钟，然后在40℃下孵化1.5小时进行去保护。然后在乙腈∶丙酮(9∶1)的溶液中沉淀粗制的寡核苷酸，并通过离心分离并且倾析上清液。将粗制的寡核苷酸小粒重新悬浮于20mmnaoac缓冲液并通过lc-ms和阴离子交换hplc进行分析。在5mlhitrapsephadexg25柱(ge卫生保健公司(gehealthcare))上在96深孔板中将粗制的寡核苷酸序列进行脱盐。在每个孔中收集对应于一个单独的序列的约1.5ml的样品。通过lc-ms和阴离子交换层析法分析这些纯化脱盐的寡核苷酸。通过在tecan机器人上退火等摩尔量的有义和反义序列来制备双链体。双链体的浓度被调节至在1xpbs缓冲液中10μm。

ii.合成galna共轭的寡核苷酸用于体内分析

使用预先装载用于寡核苷酸合成的具有4，4′-二甲氧基三苯甲基(dmt)保护的伯羟基的y-形连接物的固体支持物在0.2-500μmol之间的规模合成在其3′-末端与galnac配体共轭的寡核苷酸，并且galnac配体通过系链(tether)附接。

对于在5-500μmol之间的规模合成galnac共轭物，对上述针对rna的合成方案进行了以下改编：对于基于聚苯乙烯的合成支持物，使用了甲苯中的5％二氯乙酸用于合成过程中的dmt-切割。如上所述进行自该支持物的切割和去保护。不去除最后的5′-dmt基团(“带有dmt”)合成富含硫代磷酸酯的序列(通常＞5硫代磷酸酯)，并且在如上所述的切割和去保护之后，使用于水中的50mm乙酸铵(缓冲液a)和于80％乙腈中的50mm乙酸铵(缓冲液b)通过反相hplc进行纯化。通过分析型hplc和/或lc-ms分析级分纯度。将具有合适纯度的含产物的级分汇集，并在旋转式蒸发器上浓缩。使用在水中的20％-25％乙酸去除dmt基团直到完成。将样品通过尺寸排阻层析脱盐并冻干至干燥。将等摩尔量的有义和反义链在1xpbs缓冲液中退火，以制备相应的sirna双链体。

对于小规模合成galnac共轭物(0.2-1μmol)，包括具有多个硫代磷酸酯键的序列，在mermade平台上应用了如上所述用于合成rna或完全含2′-f/2′ome的序列的方案。在含galnac功能化的可控孔度玻璃支持物的预填充柱上进行合成。

实例2.体外筛选

细胞培养和转染

将hep3b细胞(atcc公司，马纳萨斯(manassas)，弗吉尼亚州)在37℃在5％co2的气氛中在伊格尔氏极限必需培养基(atcc公司)(补充有10％fbs，链霉素以及谷氨酰胺(atcc公司))中培养接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。对于小鼠交叉反应双链体，原代小鼠肝上皮实质细胞(pmh)在转染前小于1小时内新分离，并在原代肝上皮实质细胞培养基中生长。对于hep3b和pmh两者，转染通过以下进行：将14.8μl的opti-mem加每孔0.2μl的lipofectaminernaimax(英杰公司，卡尔斯巴德ca.cat#13778-150)与5μl的各个sirna双链体添加至96孔板中的每一个孔中。随后将该混合物在室温下孵育15分钟。然后将包括约2x10⁴hep3b细胞的、不合抗生素的80μl的完全培养基添加至该sirna混合物中。在rna纯化之前将细胞孵育24小时。在10nm与0.1nm最终双链体浓度下进行单一剂量实验，并且在10nm到128pm范围内使用8x5-倍系列稀释进行剂量响应实验。

自由摄取转染

在96孔板的每个孔中，将五μl的在pbs中的每种galnac共轭的sirna与重悬浮于95μl的体外grocp培养基(赛西斯离体技术公司(invitrotechnologies-celsis)，巴尔的摩，md)中的4x10⁴刚解冻的冷冻保存的食蟹猴肝上皮实质细胞合并。将该混合物在37℃，5％co2的空气下孵化约24小时。sirna在终浓度100nm，10nm和0.1nm下进行功效自由摄取分析测试。

使用dynabeadsmrna分离试剂盒(英杰公司，部件#：610-12)的总rna分离

收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用eppendorfthermomixer在850rpm混合5分钟，混合速度在整个过程中相同。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁力支座捕获磁珠并且在不扰动磁珠的情况下移出上清液。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在除去上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液a(washbuffera)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再一次被捕获，并且除去上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液b(washbufferb)进行洗涤并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(elutionbuffer)进行洗涤、捕获并且除上清液。最终，允许珠子干燥2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。

使用abi高容量cdna逆转录试剂盒(应用生物系统公司(appliedbiosystems))，福斯特城(fostercity)，加利福尼亚州，cat#4368813)的cdna合成

将母混合物(每一反应：2μl10×缓冲液、0.8μl25xdntp、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μlrnase抑制剂以及3.2μlh2o)添加至10μl总rna中。使用bio-radc-1000或s-1000热循环仪(大力神公司(hercules)，ca)通过以下步骤产生cdna：25℃10min、37℃120min、85℃5秒、4℃保持。

实时pcr

将2μl的cdna添加至母混合物中，该母混合物在一个384孔板中每一孔包含0.5μl人类gapdhtaqman探针(应用生物系统公司(appliedbiosystems)cat#4326317e)、0.5μl人类serpinc1taqman探针(应用生物系统公司(appliedbiosystems)cat#hs00892758ml)(用于人类细胞)或0.5μl小鼠gapdhtaqman探针(应用生物系统公司(appliedbiosystems)cat#4308313)、0.5μl小鼠serpinc1taqman探针(应用生物系统公司(appliedbiosystems)cat#hs00446573ml)(用于小鼠细胞)以及5μllightcycler480探针母混合物(罗氏公司(roche)cat#04887301001)。实时pcr在abi7900ht实时pcr系统(应用生物系统公司(appliedbiosystems))上使用δδct(rq)测定而完成。将每一双链体在两个独立的转染中进行测试并且每一转染以一式两份进行测定，除非在总结表中另外指出。

为了计算serpinc1mrna水平相对倍数变化，使用δδct方法分析实时数据，并且将这些数据归一化为利用以下这样的细胞而进行的测定：这些细胞是转染了10nmad-1955的细胞，或是模拟转染的细胞。以利用xlfit的4参数拟合模型计算ic50并且针对用ad-1955转染的细胞在相同的剂量范围归一化或针对自身最低剂量归一化。表5显示转染了指定的irna的hep3b细胞和pmh细胞的单剂量筛选结果。表6显示了转染到hep3b细胞和pmh细胞中的指定的irna的剂量响应结果。

ad-1955的有义链和反义链序列是：

有义：cuuacgcugaguacuucgadtsdt-(seqidno：13)

反义：ucgaaguacucagcguaagdtsdt-(seqidno：14)。

表2：核酸序列描述中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解在寡核苷酸中存在时这些单体是由5′-3′-磷酸二酯键相互连接。

表3.serpinc1dsrna的未修饰的有义和反义链序列(“有义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno15-71，并且“反义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno72-128)

表4.serpinc1dsrna的经修饰的有义和反义链序列(“有义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno129-185，并且“反义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno186-242)

表5¹-serpinc1单剂量筛选

¹经修饰的。

表6-serpinc1ic50数据

也以2′-ome修饰合成sirna的一个子集，并且在lipofectamine配制品中的这些sirna的双链体被用于转染hep3b细胞。经修饰的双链体的单剂量筛选的结果示于表7中。

表7.先导物优化(2’-ome变体)

实例3-4.先导物优化以及体内测试

表8是被配制为脂质纳米颗粒(lnp)(即与mc3)或共轭至galnac以用于先导物优化和体内递送的、靶向serpinc1的双链体sirna的序列的详细列表。

实例3：sirna的lnp介导的递送

基于上述的体外单剂量和ic50结果，选择经修饰的ad-50509用于配制在脂质纳米颗粒(lnp)中。为了确定用于ad-50509的lnp介导的递送的有效剂量，将cd1小鼠按0.003、0.01、0.03、0.1、0.3或1.0mg/kg静脉内注射单剂量的ad-50509sirna的lnp配制品(af-011)。在48小时后将动物处死并如此处所述的确定相对于gapdh的serpinc1mrna的水平和serpinc1蛋白的水平。如图3a和3b所示，用af-011-ad-50509以大约0.1mg/kg的ed50达到85％的最大serpinc1mrna沉默(图3a)并且以大约0.05mg/kg的ed50达到90％的最大serpinc1蛋白沉默(图3b)。

在单一的1mg/kg静脉内注射sirna之后的cd1小鼠中确定ad-50509sirna(af-011-50509)的lnp配制品的沉默持续时间。在给药后第1、2、3、7、14、21或28天处死动物并确定serpinc1mrna的相对水平和serpinc1蛋白的水平。图4a表明，af-011配制的ad-50509在给药24小时之内达到大约90％的serpinc1mrna沉默，并在给药大约两周之后serpinc1mrna的相对量有大约50％恢复。图4b表明，af-011配制的ad-50509在给药大约72小时之内达到大约90％的serpinc1蛋白质沉默，并在给药大约两周之后serpinc1蛋白质的相对量有大约50％恢复。还通过使用可商购试剂盒(安尼亚拉公司(aniara))在单一的1mg/kg静脉内注射lnp配制的ad-50509sirna之后的cd1小鼠中测量因子xa活性来确定serpinc1活性。在给药后第1、2、3、7、14、21或28天处死动物并确定serpinc1蛋白的相对活性水平和相对serpinc1蛋白水平。图4c显示，在serpinc1蛋白水平和serpinc1活性的水平之间存在着良好的相关性。

实例4：galnac共轭的sirna

将四十四个经修饰的serpinc1sirna双链体在有义链的3′末端与三价的galnac共轭。在食蟹猴肝上皮实质细胞中以这些共轭双链体的单剂量自由摄取测定这些双链体的功效。表9示出了这些测定的结果。

表9：galnac自由摄取单剂量

也在自由摄取和转染测定中测定这些双链体的剂量响应。

表10示出这些测定的结果和这些双链体针对自由摄取和转染两者的级系。将具有最佳ic50的5个双链体用浅灰色阴影着色并将底部的5个双链体用暗灰色阴影着色。这些双链的ic50的级系在galnac共轭物的自由摄取和转染介导的摄取之间非常保守。

表10.galnac共轭的双链体的剂量响应：自由摄取和转染

实例5：ad-54944优化

如在以上实例4中描述的，ad-54944处于如通过自由摄取和转染测定两者确定的最活跃的galnac共轭的sirna双链体中并且因此被选择用于进一步优化和体内测试。

基于相同的ad-54944亲本序列制备二十九个化合物并使用单一的10mg/kg剂量筛选体内功效。在第0天对动物(c57bl/6)进行皮下注射并且在第3天处死。通过elisa测定确定血清serpinc1蛋白水平并使用来自这些动物的肝样品通过qrt-pcr确定serpinc1mrna的水平。表11和12显示了这些双链体的序列以及这些双链体的单剂量筛选的结果，为serpinc1蛋白水平从pbs的敲低百分比。图5示出了单剂量筛选的结果，为serpincemrna和蛋白水平从pbs的敲低百分比。

共轭至galnac的ad-54944的体内剂量响应是通过向c57bl/6j小鼠(n＝5)给予单次皮下剂量确定的。还向c57bl/6j小鼠(n＝5)经5天的时间将共轭至galnac的ad-54944皮下给予为5mg/kg的重复每日剂量。在给药72小时后处死动物并如上所述确定肝脏和血清样品中的serpinc1蛋白和活性水平。

如图6中所示，单次皮下剂量的共轭至galnac的ad-54944导致了大约10mg/kg的蛋白ec50并且5×5mg/kg每日重复剂量导致大约75％蛋白沉默。

还经8周的时间对c57bl/6j小鼠进行额外的共轭至galnac的ad-54944的重复给药，以确定功效和沉默持续时间。图7a和7b显示了这些研究的结果。

实例6：分次剂量的ad-54944的给药持续时间

为了进一步评价serpinc1表达和活性的化合物ad-54944敲低，进行了分次给药试验。将c57bl/6小鼠皮下给予galnac共轭的ad-54944，并将每周3次、1/3剂量的ad-54944的效果与每周1次、完全集中的剂量的ad-54944的效果进行比较。研究设计的总结示于表13中。血清serpinc1蛋白水平在第0、3、7、10、14、17、21、24、29、31、以及35天确定。

表13：分次给药实验的研究设计

每周一次分次剂量筛选作为serpinc1蛋白水平比给药前水平的百分比敲低的结果示于图8中，并且每周三次筛选作为serpinc1蛋白水平比给药前水平的百分比敲低的结果示于图9中。结果表明，两组中都存在对共轭至galnac的ad-54944的剂量响应效应并且每周一次30mg/kg和每周三次10mg/kg两种的剂量都导致serpinc1的长期沉默。

实例7：ad-54944的进一步优化

为了进一步提高ad-54944的功效，基于该ad-54944亲本序列制备另外的化合物。一般地，这些修饰包括硫代磷酸酯键，c16(十六烷基)修饰、5′-末端帽、以及2′-甲基的加成。使用单一的3mg/mg剂量和单一的10mg/kg剂量两者对该新化合物的体内功效进行筛选。在第0天对动物(c57bl/6)进行皮下注射并且在第3天处死。通过elisa测定确定血清serpinc1蛋白水平。使用购买自艾碧康公司(abcam)的抗凝血酶iii小鼠elisa试剂盒进行该elisa测定。简言之，将血清稀释(例如约1∶10,000)，并根据制造商的说明进行使用。在测定结束时在450nm对各板进行读数。

表14示出了这些双链体的序列以及这些双链体的单剂量筛选的结果(为serpinc1蛋白水平从pbs的敲低百分比)。图10a和图10b示出了单剂量筛选的结果，为serpinc1蛋白水平从pbs的敲低百分比。如可从表14和图10中可以看到的，化合物ad-56813显现为一种新的基于serpinc1蛋白水平的敲低的水平的先导物。

基于该ad-56813亲本序列(其中2′-甲氧基乙基和硫代磷酸酯键的数目减少)制备另外的化合物，以确定该化合物的稳定性所需的最低的化学修饰，其维持了该化合物的活性。使用单一的3mg/mg剂量和单一的10mg/kg剂量两者对该新化合物的体内功效进行筛选。在第0天对动物(c57bl/6)进行皮下注射并且在第3天处死。通过elisa测定确定serpinc1(at3)活性和血清serpinc1蛋白水平。如上所述进行该elisa测定。使用biophen(抗因子xa)活性测定试剂盒确定serpinc1活性。简言之，将血清样品从约1∶20稀释至约1∶60，并根据制造商的说明进行处理。在测定结束时在450nm对各板进行读数。

表15中示出了新制备的双链体的序列以及这些双链体的单剂量筛选的结果，为serpinc1蛋白水平从pbs的敲低百分比。图11示出了单剂量筛选的结果，为serpinc1蛋白水平从pbs的敲低百分比，并且图12示出了单剂量筛选的结果，为serpinc1活性从pbs的敲低百分比。

如可以在表15和图11和12看到的，虽然对该化合物的修饰的数量显著减少，化合物ad-57213维持了serpinc1表达和活性的敲低，并且由此显现为一种新的先导物。单一的10mg/kg剂量的ad-57213导致了ed90并且单一的3mg/kg剂量导致了ed50。

实例8：血友病小鼠中的serpinc1敲低

在第0天，将具有因子viii的靶向缺失的以及重演血友病a的表型的雄性和雌性小鼠(c57bl/6/129杂种)以及对照或野生型(c57bl/6雌性)小鼠以30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、或1mg/kg皮下注射单剂量的共轭至galnac的化合物ad-57213，在第3天处死动物，并如上所述确定serpinc1活性。图13显示，不仅单剂量的ad-57213有效地敲低serpinc1活性，而且对ad-57213也存在剂量响应。

为了研究在血友病背景中抗凝血酶减少对凝血酶生成的影响，对因子ix(ffx)以及抗凝血酶-(at-)耗尽的人血浆进行凝血酶生成研究。(fix耗尽重演了血友病b表型)。随后以不同水平(1iu/ml＝100％)将at加回到血浆样品中，以产生具有不同水平的抗凝血酶(0-100％)的fix耗尽的血浆样品。对照血浆是通过向双耗尽的血浆中加回1iu/ml抗凝血酶和5μg/mlfix(100％)产生的。图31a描绘了fix-和at-耗尽的人血浆(组织因子＝5pm)中的凝血酶生成。图31b描绘了fix-和at-耗尽的人血浆(组织因子＝5pm)中的峰值凝血酶。如在这些图中所示的，抗凝血酶减小在体外增加了ix因子耗尽的人血浆中的凝血酶生成。

实例9：ad-57213的给药持续时间

为了评价在单剂量的共轭至galnac的ad-57213之后的血友病a小鼠(b6；129s4-f8^tml/kaz/j；杰克逊实验室)中抗凝血酶沉默的持续时间，将小鼠皮下注射化合物ad-57214、ad-57205、或ad-57213或pbs。眶后收集全血并测定serpinc1mrna水平和serpinc1活性。图14描绘了以10mg/kg、3mg/kg、或1mg/kg给予的化合物ad-57213的单剂量筛选的结果，为在第3、7、10、14、17、21、28、和36天的serpinc1活性从pbs的敲低百分比。图16示出了以图中示出的剂量给予的化合物ad-57213、ad-57205和ad-57214的单剂量筛选的结果，为第3、7、10、14、17、21、和25天serpinc1活性从pbs的敲低百分比。

在第0天以30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg的剂量皮下注射ad-57213或pbs的血友病a小鼠(b6；129s4-f8^tm1/kaz/j；杰克逊实验室(jacksonlabs))中测量肝脏mrna、血清中at抗原和at活性。如上所述于注射后第3天处死动物。图15示出了在第3天针对ad-57213的单剂量筛选的结果，为serpinc1mrna水平从pbs的敲低百分比，为serpinc1抗原水平从pbs的敲低百分比并且为serpinc1活性从pbs的敲低百分比。

如由图14-16证明的，在第7天，给予化合物ad-57213以小于1mg/kg的单剂量ed50在ha小鼠中导致对serpinc1的有效的、剂量依赖性的抑制。serpinc1抑制是持久并与达到的最大水平的抗凝血酶抑制相关。单剂量的1mg/kg导致50％抑制维持约15天，而10mg/kg的剂量导致大于80％的抑制维持28天。

实例10：分次剂量的ad-54944的给药持续时间

为了进一步评价serpinc1表达和活性的化合物ad-57213敲低，进行了分次给药试验。将c57bl/6小鼠皮下给予galnac共轭的ad-57213，并将每周3次、1/3剂量的ad-57213的效果与每周1次、完全集中的剂量的ad-57213的效果进行比较。研究设计的总结示于表16中。确定血清serpinc1蛋白水平。

表16：分次给药实验的研究设计

(q1w：每周一次)

(tiw：3次/周)

每周一次(q1w)给药作为serpinc1蛋白水平从pbs的百分比敲低的结果示于图17中，并且每周三次(t.i.w.)给药作为从pbs的百分比敲低的结果示于图18中。

如图17和18中所示的，重复给予化合物ad-57213导致剂量依赖性的持久的响应，带有加性效应。给药3mg/kg的动物在2周剂量后达到＞95％敲低的最低点水平；而较低的两个剂量组在3个每周剂量后取得最低点(1.5mg/kg为约90％敲低并且0.75mg/kg为约80％敲低)。

为了进一步研究不同给药方案，在不同组中，将相同的每周剂量分开并每周三次给药，例如将1.5mg/kgqlw与0.5mg/kgtiw进行比较。如图19所示，累积每周剂量给出了相同水平的敲低。例如用1.5mg/kg(qlw)实现的serpinc1水平等同于用0.5mg/kg每周给药三次实现的serpinc1水平。

实例11：serpinc1sirna的非人类灵长类给药

测试了化合物ad-57213对非人类灵长类的功效，如表17中概括的。血清serpinc1蛋白水平在第-14、-8、-4天，在第一天给药后4小时，第2、4、8、11、15、22、29、37、44、51、以及58天确定。

表17：非人类灵长类给药试验。

图20示出了所有测试化合物的单剂量筛选的结果，为与给药前serpinc1水平相比的相对血清serpinc1水平的组平均值，并证明了所有测试的sirna有效地敲低了serpinc1蛋白水平。

图21示出了化合物ad-57213的单剂量筛选的结果，为与给药前serpinc1水平相比的相对血清serpinc1水平的组平均值。

图22示出了所有测试化合物的单剂量筛选的结果，为与给药前serpinc1水平相比在第8天的相对血清serpinc1水平的组平均值。

总的来说，结果表明，在非人类灵长类中存在剂量依赖性的ad-57213对serpinc1蛋白水平的敲低，并且ad-57213和ad-57205都显示出超过母体化合物ad-52444的改善的效力。

实例12：治疗性serpinclsirna的非人类灵长类给药

测试了化合物ad-57213对非人类灵长类的功效。对食蟹猴给予化合物ad-57213，如以下表18中所概述的。在给予ad-57213后不同时间点收集血浆，并通过elisa分析抗凝血酶蛋白(serpinc1)水平。

表18：研究设计：非人类灵长类中ad-57213的药理学

图23示出了化合物ad-57213的单剂量筛选的结果，为与三个给药前测量的平均值相比的相对血清serpinc1水平的组平均值。结果表明以1、3、10和30mg/kg的分别为约50％、70％、80％和＞90％沉默的剂量依赖性serpinc1沉默。数据点代表组平均值，并且误差条代表标准差。

图24a-d示出按a)1mg/kg、b)3mg/kg、c)10mg/kg、和d)30mg/kg剂量的化合物ad57213的相对的血清serpinc1水平和峰值血浆凝血酶水平的倍数变化之间的关系。相对于三个给药前测量的平均值表示serpinc1水平。凝血酶生成曲线是使用自动校准凝血酶曲线(calibratedautomatedthrombinoscope)(组织因子＝1pm)从不同时间点采集的血浆样品产生的。相对于每只动物的两个给药前值的平均峰值凝血酶值计算峰值凝血酶的倍数变化。数据点代表组平均值，并且误差条代表标准差。图25示出峰值凝血酶的倍数变化增加作为相对serpinc1沉默的函数的综合散点图。

还对动物给予30mg/kg的三次每周ad-57213剂量，并在从动物中收集的血液样品中确定serpinc1蛋白和mrna水平。这些研究的结果示于图26a(serpinc1蛋白水平相对于出血前水平)和26b(serpinc1mrna水平相对于gapdh)。

总的来说，结果表明，在非人灵长类中化合物ad-57213对serpinc1蛋白水平存在持久的、剂量依赖性的抑制，其导致凝血酶生成高达4倍的增加。

实例13：在非人类灵长类给药中重复给予serpinclsirna

对化合物ad-57213进行了功效测试，并评估该化合物按重复给药方案在非人类灵长类中的累积效果。将食蟹猴以0.5mg/kgq1w、1mg/kgq2w(每隔一周)持续2个月以及按1.5mg/kgq1w、3mg/kgq2w持续6周给予化合物ad-57213。在如图27中所示不同时间点收集血清，并通过elisa分析抗凝血酶蛋白水平(serpinc1)。相对于三个给药前测量的平均值表示抗凝血酶水平。

按0.5mg/kg的每周累积剂量的前2个剂量组导致在5周后at水平的80％减少。按1.5mg/kg的累积每周剂量的后两个组导致＞95％最大敲低。图27a示出了来自后两组的数据。在第54日将接受3mg/kg剂量的动物安乐死并在第36天将接受1.5mg/kgq1w的动物给予额外的第6次每周剂量，并对恢复到基线水平进行监测。图27b显示在0.5mg/kg累积每周剂量后的at水平。

这些数据表明，剂量依赖性的抗凝血酶沉默在所有的给药方案中观察到并在第25天达到抑制的稳态水平。

实例14：在血友病小鼠中给予化合物ad-57213之后的止血修正

血友病动物具有较小的凝血酶生成潜力，并且不能形成稳定的凝块。在这些动物中减少抗凝血酶蛋白将有助于重新平衡止血，增加内源性凝血酶生成的潜力，并使凝块能够形成。在血友病a和血友病b小鼠中在微血管激光损伤模型中伴随着活体成像对这一假说进行测试。给小鼠注射化合物ad-57213并在处理10天后诱导损伤。可视化血小板和纤维蛋白在损伤位点的积累，记录并定量。图28a示出了在激光手术后血小板随时间累积的中值，并且图28b显示在激光手术后来自所有强加的损伤的随时间的纤维蛋白中值。如由图28a和28b表明的，按1mg/kg或30mg/kg注射化合物ad-57213导致血小板及纤维蛋白沉积，导致在100％的这些损伤中形成凝块。表19总结了来自用ha和hb动物进行的两个独立实验的结果。

表19

实例15：ad-57213lnp配制品的体内功效

将化合物ad-55029(非共轭的)和ad-57213(共轭到galnac)配制在脂质核酸颗粒(af-11)中，并对野生型动物给予0.03mg/kg、0.1mg/kg和0.3mg/kg剂量的这些lnp配制的化合物。将萤光素酶(af11-1955)用作对照。

两种化合物在0.3mg/kg都导致＞95％敲低，但是这些水平由af11-57213维持15天而由af11-55029维持8天(参见图29)。在较低的剂量中观察到这两种化合物之间的作用的持续时间上的类似差别。

实例16：另外的sirna的设过、合成、和体外筛选

sirna设计

使用人类serpinc1mrna序列(genbank登录号nm_000488.3中列出的)设计sirna双链体(有义链和反义链均是19个核苷酸长度的)。初步识别了1581个双链体，这些双链体不包含超过7个核苷酸重复，横跨整个1599个核苷酸转录本。然后根据对在每个双链体位置处的核苷酸对以及用于筛选的剂量和细胞系进行评价的线性模型计分，以预测所有1581个双链体的效力。还使用自定义的蛮力(bruteforce)算法将这些双链体与人类refseq集中所有的转录本进行匹配，并相对于除serpinc1之外的转录本对最低错配数目(每条链)进行打分。然后根据以下方案从该1581个双链体中选择有待于合成和筛选的双链体：在转录本的5′末端开始，一个双链体在每10±2个核苷酸“窗口(window)”之内选择，该双链体

1)具有最高的预测功效，

2)针对除了serpinc1之外的所有转录本，在两条链上具有至少一个错配，

3)还没有被合成和筛选为其他双链体集的组成部分。

如果在给定窗口内不能识别出满足所有标准的任何双链体，该窗口被跳过。识别出满足这些条件的164个双链体。

sepinc1有义和反义链序列的详细列表显示在表20和21中。

表20：at3(serpinc1)未修饰的序列(“有义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno979-1141，并且“反义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno1142-1304)

表21：at3(serpinc1)经修饰的序列(“有义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno1305-1467，并且“反义序列”栏序列按出现顺序分别被披露为seqidno1468-1630)

细胞培养和转染

将hepg2细胞(atcc公司，马纳萨斯(manassas)，弗吉尼亚州)在37℃在5％co2的气氛中在伊格尔氏极限必需培养基(atcc公司)(补充有10％fbs，链霉素以及谷氨酰胺(atcc公司))中培养接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。转染通过以下进行：将14.8μl的opti-mem加每孔0.2μl的lipofectaminernaimax(英杰公司，卡尔斯巴德ca.cat#13778-150)与5μl的164sirna双链体中的每一个添加至96孔板中的每一个孔中。随后将该混合物在室温下孵育15分钟。然后将包括约2.5x10⁴hepg2细胞的、不含无抗生素的80μl的完全培养基添加至该sirna混合物中。在rna纯化之前将细胞孵育24小时。实验在20nm实施，并且包括空白原初细胞(cell)和用ad-1955转染的细胞，一个萤光素酶靶标sirna作为阴性对照。

使用dynabeadsmrna分离试剂盒(英杰公司，部件#：610-12)的总rna分离

收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用平台振动器在700rpm混合5分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液除去而不扰动这些珠子。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在除去上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液a(washbuffera)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且去除上清液。然后将珠子用150μl洗涤缓冲液b(washbufferb)进行洗涤，捕获，并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(elutionbuffer)进行洗涤、捕获并且除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl上清液(包含分离的rna)并且添加至另一96孔板中。

使用abi高容量cdna逆转录试剂盒(应用生物系统公司(appliedbiosystems))，福斯特城(fostercity)，加利福尼亚州，cat#4368813)进行cdna合成

将母混合物(每一反应：2μl10×缓冲液、0.8μl25xdntp、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μlrnasc抑制剂以及3.2μlh2o)添加至10μl总rna中。使用bio-radc-1000或s-1000热循环仪(大力神公司，ca)通过以下步骤产生cdna：25℃10min、37℃120min、85℃5秒、4℃保持。

实时pcr

将2μl的cdna添加至母混合物中，该母混合物在一个384孔板(roche(罗氏公司)cat#04887301001)的每一孔中包括0.5μl人类gapdhtaqman探针(appliedbiosystems(应用生物系统公司)cat#4326317e)、0.5μl人类serpinc1taqman探针(appliedbiosystems(应用生物系统公司)cat#hs00892758_ml)以及5μllightcycler480探针母混合物(roche(罗氏公司)cat#04887301001)。实时pcr在lc480实时pcr机(罗氏公司)上完成。

为了计算相对倍数变化，使用δδct方法分析实时数据，并且将这些数据归一化为利用以下这样的细胞而进行的测定：这些细胞是转染了20nmad-1955的细胞。

表22显示了指定的irna的hepg2的单剂量筛选结果。

表22²：指定的irna的20nm单剂量筛选