一种提取鲍肝胰腺RNA的方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种提取鲍肝胰腺rna的方法。

背景技术：

鲍被誉为海产“八珍之冠”，具有很高的营养和药用价值。2017年全国鲍鱼产量为14.85万吨，较2016年增幅10.24%，为经济贝类养殖中产量增幅最快的品种，具有重要的研究价值。肝胰腺为鲍的重要免疫组织，在对其进行免疫学研究时，肝胰腺rna的提取是一个重要的环节。实时荧光定量、northern杂交及转录组测序等分子生物学研究的开展都需要纯度高、完整性好的总rna。

由于鲍肝胰腺中含有大量的多糖及色素，在rna的提取过程中容易与rna一起形成褐色沉淀，使得提取得到的rna纯度不高、检测的总rna含量不准，严重影响定量结果及cdna文库的构建，使得后续实验无法进行。目前，传统的trizol提取方法可高质量的提取鲍外套膜、鳃和足的总rna，但在肝胰腺总rna的提取过程中会产生褐色沉淀且无法去除，市售rna提取试剂盒对提取得到的肝胰腺总rna质量仅能起到改善作用，也无法从根本上去除褐色沉淀，且rna提取质量不稳定。因此，有必要建立一种适用于鲍肝胰腺总rna的提取方法，以满足响应分子生物学实验的需求。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种提取鲍肝胰腺rna的方法，采用该方法得到的鲍肝胰腺总rna质量好，浓度高，稳定性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种提取鲍肝胰腺rna的方法，包括以下步骤：

s1、取鲍肝胰腺，在液氮中磨碎后，转入含有trizol的rnase-freeep(eppendorf)管中（该ep管一般为1.5ml管），混匀后离心，取上清液转入新的rnase-freeep管中；

s2、往s1的上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，通过震荡等方式混匀充分乳化呈乳白色，室温静置2-5min，离心后取上清液转入新的rnase-freeep管中；

s3、往s2的上清液中分别加入与上清液等体积的异丙醇和5mol/lnacl（即5mnacl），混匀，分两次将得到的溶液和沉淀一起转入rna吸附柱中，离心后弃掉收集管中的液体；

s4、往s3的rna吸附柱中加入75%体积分数的乙醇和5mnacl，室温静置2-5min，离心后弃掉收集管中的液体；

s5、往s4的rna吸附柱中加入75%体积分数的乙醇，室温静置2-5min，离心后弃掉收集管中的液体；

s6、将s5的rna吸附柱放入2ml收集管中，离心2-4min；

s7、将s6的rna吸附柱充分晾干；

s8、将s7的rna吸附柱转入一个新的无rnase的1.5ml离心管中，加入rnase-free水室温放置2min，离心后得到鲍肝胰腺总rna；

s9、往s8的离心管中加入75%体积分数的乙醇和5mnacl进行二次沉淀，充分混合后静置2-5min，将混合物转入rna吸附柱中，离心（该离心时间一般为30s）后弃掉收集管中的液体；

s10、重复步骤s5-s8，最终得到高质量的鲍肝胰腺总rna。

优选的，所述鲍肝胰腺的用量为50-70mg。

优选的，步骤s1中所述trizol的用量为1ml。

优选的，步骤s4、s9中所述的75%乙醇和5mnacl的添加量均为300μl。

优选的，步骤s4和步骤s5均重复1次。

优选的，步骤s5中所述的75%乙醇的添加量为500-600μl。

优选的，在步骤s7中，将步骤s6的rna吸附柱在室温下放置5-10min，或者置于超净工作台通风3-5min，以充分晾干；

优选的，步骤s8中所述的rnase-free水的添加量为30-100μl。

优选的，步骤s1中所述的离心为4℃、12000rpm离心5min，步骤s2中所述的离心为4℃、12000rpm离心10min，步骤s3、s4、s5、s9中所述的离心均为4℃、12000rpm离心30s，步骤s6、s8中所述的离心为4℃、12000rpm离心2min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明以trizol试剂为基础，合理结合试剂盒提取方法，在提取过程中，合理利用5mnacl和rna吸附柱，使鲍肝胰腺总rna提取过程中产生的多糖和色素得以彻底去除，并且通过对rna进行二次沉淀和再纯化的方式，最终得到高质量的鲍肝胰腺总rna。总体而言，本发明具有以下几个方面的优点：（1）彻底消除了鲍肝胰腺总rna沉淀过程中产生的褐色沉淀；（2）得到的鲍肝胰腺总rna质量好、浓度高、稳定性好，克服了市售rna提取试剂盒提取得到总rna纯度不高且提取质量参差不齐的问题；（3）对其它多糖和色素含量高的水产动物组织总rna的提取有借鉴作用；（4）操作步骤简单、成本低廉。

附图说明

图1为采用不同提取方法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna图（a为使用传统trizol法加入异丙醇离心后产生的褐色沉淀图；b为使用传统trizol法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna图；c为使用总rna提取试剂盒提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna图；d为使用本发明方法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna图。）；

图2为经过本发明方法步骤s1-s8提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图3为经过本发明方法全部步骤后提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图4为经过传统trizol法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图5为经过总rna提取试剂盒提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图6为采用本发明方法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的琼脂糖凝胶电泳检测图；

图7为采用本发明方法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的agilent2100生物分析仪检测分析图；

图8为采用不同提取方法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna图（a为使用传统trizol法加入异丙醇离心后产生的褐色沉淀图；b为使用传统trizol法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna图；c为使用总rna提取试剂盒提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna图；d为使用本发明方法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna图。）；

图9为经过本发明方法步骤s1-s8提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图10为经过本发明方法全部步骤后提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图11为经过传统trizol法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图12为经过总rna提取试剂盒提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的nanodrop2000检测结果；

图13为采用本发明方法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的琼脂糖凝胶电泳检测图；

图14为采用本发明方法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的agilent2100生物分析仪检测分析图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的总rna提取试剂盒（cal.#：r1071）购自广州东盛生物科技有限公司。

实施例1采用本发明方法提取皱纹盘鲍肝胰腺总rna，具体方法包括以下步骤：

s1、取皱纹盘鲍肝胰腺60mg，在液氮中磨碎后，转入含有1mltrizol的1.5mlrnase-freeep管中，混匀后4℃、12000rpm离心5min，取上清液转入新的rnase-freeep管中；

s2、往s1的上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，用力震荡，充分乳化呈乳白色，室温静置5min，4℃、12000rpm离心10min，取上清液转入新的rnase-freeep管中；

s3、往s2的上清液中分别加入与上清液等体积的异丙醇和5mnacl，混匀，分两次将得到的溶液和沉淀一起转入rna吸附柱中，4℃、12000rpm离心30s，弃掉收集管中的液体；

s4、往s3的rna吸附柱中加入75%乙醇和5mnacl各300μl，室温静置2min，4℃、12000rpm离心30s，弃掉收集管中的液体，重复1次；

s5、往s4的rna吸附柱中加入600μl75%乙醇，室温静置2min，4℃、12000rpm离心30s，弃掉收集管中的液体，重复1次；

s6、将s5的rna吸附柱放入2ml收集管中，4℃、12000rpm离心2min；

s7、将s6的rna吸附柱在室温下放置10min，或者置于超净工作台通风5min，以充分晾干；

s8、将s7的rna吸附柱转入一个新的无rnase的1.5ml离心管中，加入rnase-free水室温放置2min，4℃、12000rpm离心2min，得到鲍肝胰腺总rna；

s9、往s8的离心管中加入75%体积分数的乙醇和5mnacl各300μl进行二次沉淀，充分混合后静置2min，将混合物转入rna吸附柱中，4℃、12000rpm离心30s；

s10、步骤s5-s8重复1次，最终得到高质量的鲍肝胰腺总rna（如图1-d所示）。

采用nanodrop2000超微量分光光度计分别对经过本方法步骤s1-s8提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna和经过本方法全部步骤后提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna进行吸光度检测，其检测结果分别如图2和图3所示；同时，对经过本方法全部步骤后提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna进行琼脂糖凝胶电泳检测，其琼脂糖凝胶电泳检测结果如图6所示；此外，采用agilent2100生物分析仪对经过本方法全部步骤后提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna进行检测分析，其检测分析结果如图7所示。

实施例2采用本发明方法提取杂色鲍肝胰腺总rna，具体提取步骤同实施例1，提取得到的鲍肝胰腺总rna如图8-d所示。

采用nanodrop2000超微量分光光度计分别对经过本方法步骤s1-s8提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna和经过本方法全部步骤后提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna进行吸光度检测，其检测结果分别如图9和图10所示；同时，对经过本方法全部步骤后提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna进行琼脂糖凝胶电泳检测，其琼脂糖凝胶电泳检测结果如图13所示；此外，采用agilent2100生物分析仪对经过本方法全部步骤后提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna进行检测分析，其检测分析结果如图14所示。

对比例1：采用传统trizol法提取皱纹盘鲍肝胰腺总rna，具体方法包括以下步骤：

1、取皱纹盘鲍鲍肝胰腺60mg，在液氮中磨碎后，转入含有1mltrizol的rnase-freeep管中，混匀，室温放置5min；

2、4℃、12000rpm离心5min，取上清液转入新的1.5mlrnase-freeep管中；

3、加入1/5上清液体积的氯仿，振荡混匀后室温放置5min；

4、4℃、12000rpm离心10min；

5、吸取上层水相，至另一干净离心管中；

6、加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min；

7、4℃、12000rpm离心10min，离心后产生的褐色沉淀（图1-a所示），弃上清，rna沉于管底；

8、加入1ml75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

9、4℃、8000rpm离心5min，弃上清，重复8、9步骤一次；

10、室温晾干或真空干燥10min；

11、用50μlrnase-free水溶解rna样品，得到鲍肝胰腺总rna（如图1-b所示）。

采用nanodrop2000超微量分光光度计对经过传统trizol法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna进行吸光度检测，其检测结果如图4所示。

对比例2：采用传统trizol法提取杂色鲍肝胰腺总rna，具体提取步骤同对比例1，其中，加入异丙醇离心后产生的褐色沉淀如图8-a所示，提取得到的鲍肝胰腺总rna如图8-b所示。

采用nanodrop2000超微量分光光度计对经过传统trizol法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna进行吸光度检测，其检测结果如图11所示。

对比例3：采用总rna提取试剂盒提取皱纹盘鲍肝胰腺总rna，具体方法包括以下步骤：

1、取皱纹盘鲍肝胰腺组织60mg，按广州东盛生物科技有限公司trazol（cal.#：r1021/r1022）的使用手册进行总rna提取，直到经氯仿处理得到上清液；

2、缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入纯化柱（纯化柱+收集管）中，4℃、12.000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；

3、向纯化柱中加入500ul溶液rpi（使用前按3：2加入无水乙醇，即含40%乙醇），4℃、12000rpm离心30s，弃废液；

4、向纯化柱中加入500ul溶液rw（使用前按1：4加入无水乙醇，即含80%乙醇），室温静置2min，4℃、12000rpm离心30s，弃废液；

5、重复上步操作，去除残余液体；

6、将纯化柱放回2ml收集管中，4℃、12000rpm空离2min，去除残余液体；

7、将纯化柱转入一个新的1.5ml离心管中，加50ulrnase-freeddh20，室温放置2min，4℃、12000rpm离心2min，得到皱纹盘鲍肝胰腺总rna（如图1-c所示）。

采用nanodrop2000超微量分光光度计对经过总rna提取试剂盒提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna进行吸收光度检测，其吸收光度图像分别如图5所示。

对比例4：采用总rna提取试剂盒提取杂色鲍肝胰腺总rna，具体提取步骤同对比例3，提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna如图8-c所示。

采用nanodrop2000超微量分光光度计对经过总rna提取试剂盒提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna进行吸收光度检测，其吸收光度图像分别如图12所示。

通过图1可以看出，与传统trizol法和市售总rna提取试剂盒相比，使用本发明方法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna不含色素；通过比对图2-5中的吸收光度检测结果可以看出，图2、图3的曲线平滑，在260nm处有明显的吸收峰，说明通过本发明方法提取的总rna中杂质最少、纯度最高，尤其是通过本发明方法的步骤s9和s10的rna二次沉淀和再纯化处理后，提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna的质量更好；同时，通过本发明方法多次提取皱纹盘鲍肝胰腺总rna，检测得到的a260/a280比值稳定在1.96-2.08之间，a260/a230比值稳定在2.1-2.2之间，说明本发明方法稳定性好；此外，通过图6的琼脂糖凝胶电泳检测结果以及图7的agilent2100生物分析仪检测分析结果可以看出，使用本发明方法提取得到的皱纹盘鲍肝胰腺总rna，条带清晰、完整性好，满足后续实验的需求。

通过图8可以看出，与传统trizol法和市售总rna提取试剂盒相比，使用本发明方法提取的杂色鲍肝胰腺总rna不含色素；通过比对图9-12中的吸收光度检测结果可以看出，图9、图10的曲线平滑，在260nm处有明显的吸收峰，说明通过本发明方法提取的总rna中杂质最少、纯度最高，尤其是通过本发明方法的步骤s9和s10的rna二次沉淀和再纯化处理后，提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna的质量更好；同时，通过本发明方法多次提取杂色鲍肝胰腺总rna，检测得到的a260/a280比值稳定在1.96-2.08之间，a260/a230比值稳定在2.1-2.2之间，说明本方法稳定性好；通过图13的琼脂糖凝胶电泳以及图14的agilent2100生物分析仪检测分析结果可以看出，使用本发明方法提取得到的杂色鲍肝胰腺总rna条带清晰、完整性好，满足后续实验的需求。

通过上述分析可以看出，与传统trizol法和市售总rna提取试剂盒相比，本发明方法用于提取鲍肝胰腺总rna，具有以下几个方面的优点：（1）nacl高盐溶液的应用可提高多糖类物质的溶解度，避免加入异丙醇后产生沉淀；（2）提取的总rna无色素干扰；（3）得到的总rna质量好，浓度高，稳定性好；（4）结合了传统trizol提取和试剂盒提取方法，不仅提取效果好，而且操作步骤简单、成本低廉。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。