一种复合菌剂在黄连木种苗培育中的应用及培育方法与流程

本发明涉及一种复合菌剂在黄连木种苗培育中的应用，具体是一种利用复合菌制剂有效提高黄连木种苗繁育质量的技术，属于种苗培育技术领域。

背景技术：

黄连木，又名楷木、楷树、黄楝树、黄连树、黄连茶、药树、药木、洋杨和白剌等，属漆树科黄连木属植物。黄连木原产中国，在我国分布广泛，其中以河北、河南、山西、陕西等省最多，是一种集绿化、观赏、药用、用材和油料等多种功能于一身的优良树种。黄连木的树皮及叶可入药，树皮性味苦，功能微寒，有清热、利湿、解毒之功效，可用来治痢疾、淋症、肿毒、牛皮癣、痔疮、风湿疮及漆疮初起等病症；鲜叶含芳香油0.12％，可作保健食品添加剂和香熏剂等；种子含油率42.26％(种仁含油率56.5％)，种子出油率20％～30％，果壳含油量3.28％，是一种不干性油，油色淡黄绿色，带苦涩味，精制后可供使用。

cn102144457a公开了一种大面积成规模的黄连木培育方法，包括：(1)种子的采收处理；(2)播种育苗：圃地选择和整地作床；(3)播种；(4)苗期管理；(5)一年生苗的木经培育后即可以做阿月浑子嫁接用的砧木。该技术属于目前常规育苗方法，缺乏有效提高苗木质量的技术方案，存在较大不足，实际实施过程，种苗往往发芽率低，长势弱。cn108781818a公开了一种黄连木苗木的高效育苗方法，包括种子预处理、营养土配制及消毒处理、播种、播种后的管理、嫁接、以及移栽等环节，然而嫁接环节工序繁琐，且没有嫁接经验者难以操作和实施。cn105340417a公开了一种新品种红叶黄连木的繁殖方法，包括：采集的种子干燥后冷藏，生长素溶液浸泡萌发种子；采用杀菌剂对萌发的种子和苗床进行杀菌消毒，同时对幼苗进行杀菌消毒，该发明优选种源、采集后的种子干燥后低温保藏、生长素溶液浸泡萌发种子，种子的萌发率从1～3％提高至10～15％，然而该技术方案中所使用杀菌剂的主要成分有一定的毒副作用，其中多菌灵虽然可以有效防治由真菌引起的多种作物病害，但其残留能引起肝病和染色体畸变，对哺乳动物有毒害，并且杀菌剂使用的不合理容易造成环境污染。

我国从20世纪70年代开始大规模进行黄连木的相关研究，内容涉及较广，但由于繁育技术不够完善，黄连木在生产生活上还未得到广泛运用。目前，黄连木通常采用播种方式进行繁殖育苗，但其种子具有深休眠性质，发芽率不高，难以大规模生产。为解决此问题，我们进行了黄连木种苗培育技术的研究，以期提高种子萌发率，培育壮苗，为后期移栽及扩繁提供基础。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有黄连木种苗培育技术中存在种子萌发率不高，苗黄、苗弱的问题，而提供的一种提高黄连木种子萌发质量，实现壮苗的复合菌制剂及培育方法和应用。

本发明人在筛选抑制黄连木种苗萌发过程种子霉变的拮抗菌时意外发现，含有植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17的复合菌液不仅对抑制黄连木种子霉变具有明显效果，而且可以显著促进种子萌发质量。

基于上述发现，本发明人在进一步的试验中，通过接种于mrs培养液中培养发酵，将这四种活性菌制备成了复合菌剂，并通过大量试验研究并不懈努力，探索出一项基于复合菌剂有效提高黄连木种苗培育质量的培育技术。因此，本发明采用的技术方案主要包括复合菌制剂配制和应用该复合菌制剂培育黄连木种苗的技术，具体地，本发明的技术方概况如下：

一种促进黄连木种子萌发的复合菌剂，其特征在于，该复合菌剂中活性菌由植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17组成。

进一步优选地，如上所述促进黄连木种子萌发的复合菌剂，其中的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17的活菌数量比为(2-3)：(2-3)：(1-1.5)：(1-2)。

需要说明的是，本发明所采用的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8，分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够存活于动物肠道内；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2012年06月28日，保藏号为cgmccno.6312。

本发明所采用的干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang，是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株于2006年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号cgmccno.1697。

本发明所采用的双歧乳杆菌v9(bifidobacteriumanimalissubsp.lactisv9)是从健康蒙古族儿童肠道中分离得到的耐酸和耐胆盐的益生菌，可抑制有害菌群、保护肠粘膜屏障、代谢产生有机酸，在ph2.0-8.0的环境中具有很高的存活率。该菌分类名称为动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)，菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为cgmccno.5470。

本发明所采用的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17，广泛用于植物种植中植物病害的防治，保藏编号为cgmccno.12360，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供了上述促进黄连木种子萌发的复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)将所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按4％-10％的接种量分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养12-24小时，经离心洗涤后，在各菌体沉淀上分别加入含8％-12％灭菌脱脂牛乳液、0.5％-0.6％葡萄糖和0.5％-0.8％酵母浸膏的混合液，并调整其菌数大于2.0×10⁹cfu/ml，混匀后分别倾注培养；

(2)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18-24小时，再分别接种于含8％-12％灭菌脱脂牛乳液、0.5％-0.6％葡萄糖和0.5-0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养18-24小时；

(3)将步骤(2)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17的活菌数(2-3)：(2-3)：(1-1.5)：(1-2)的比例混匀，并将保护剂添加到混合菌液中，调整活菌数大于2×10⁹cfu/ml，ph值为5-6。

进一步优选地，如上所述促进黄连木种子萌发的复合菌剂的制备方法，其中所述的保护剂的组成为：90-120g/l脱脂奶粉、25-35ml/l甘油、90-120g/l麦芽糊精、120-180g/l海漆糖和8-13g/ll-谷氨酸钠。

另外，本发明还提供了一种黄连木种苗培育方法，该方法包括如下步骤：

(1)种子采集：选择树龄在20～40年之间、生长健壮的母树进行采集，采集时间在10底至11月初；

(2)种子精选：对采集的种子进行精选，保留铜绿色种子，剔除红色、淡红色种子；

(3)种子预处理：精选后的种子泡入低浓度复合菌液中，于40-45℃恒温箱中浸泡2-3天，搓烂果肉，除去种皮蜡质层，捞出种子用清水洗净，晾干；将棉布高温消毒，然后用中浓度复合菌液润湿后包裹晾干的种子，放于28-30℃恒温箱中催芽，每天用所述的中浓度复合菌液润湿的棉布更换，1次/天，直至70％以上的种子开裂露白，停止处理；所述的低浓度复合菌液为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按(2-3)：(2-3)：(1-1.5)：(1-2)活菌数比组成，有效活菌数为0.1-1.0×10⁷cfu/ml；所述的中浓度复合菌液为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按(2-3)：(2-3)：(1-1.5)：(1-2)活菌数比组成，有效活菌数大于1.0×10⁸cfu/ml；

(4)基质配制：将高温消毒后的椰糠、蛭石和沙壤土，按照20-25％椰糠+15-20％蛭石+50-60％沙壤土的比例充分混匀作为基质，在此过程中按照每千克基质掺入1-2克氮肥、1-1.5克磷肥、1-1.5克钾肥，混合均匀；

(5)播种：选择底部有空隙的花盆或培养装置装填基质，基质装好后采用喷淋的方式添加高浓度复合菌液，每千克基质添加40-60ml，喷淋结束后调整基质含水量达到60％-70％，均匀点播预处理好的种子，保持行、株距10-12cm，播种深度1-1.5cm，播种结束后转移到28-30℃的恒温培养箱中；所述的高浓度复合菌液为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按(2-3)：(2-3)：(1-1.5)：(1-2)活菌数比组成，有效活菌数大于1.0×10⁹cfu/ml；

(6)播后管理：培养过程要及时补充水分，保持土壤含水量60-65％左右，直至出苗。

与现有技术相比，本发明涉及的复合菌剂中的活性菌由植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按(2-3)：(2-3)：(1-1.5)：(1-2)的比例组成，基于该复合菌剂开发的黄连木种苗培育技术有积极效果，尤其可以降低黄连木种苗萌发过程中的霉变率，提高了出苗率和萌发种苗的培育质量，比如种苗的地下部和地上部长度、苗粗、苗的鲜重和干重都有显著提升，为后期移栽及扩繁提供了良好的基础。

附图说明

图1为处理组1播种2个月后的种苗照片；

图2为处理组2播种2个月后的种苗照片；

图3为处理组3播种2个月后的种苗照片；

图4为处理组4播种2个月后的种苗照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

处理组1：常规育苗

选择树龄在35年之间、生长健壮的母树于10月25日采集种子，挑选并保留铜绿色种子，剔除红色、淡红色种子。采集后的种子泡入新配制的0.5-0.6％石灰水溶液中，于40℃恒温箱中浸泡3天，搓烂果肉，除去种皮蜡质层，捞出种子用清水洗净，晾干。将棉布高温消毒，蒸馏水润湿，用于包裹种子，放于30℃恒温箱中催芽，期间每天用30℃温水清洗1次并更换棉布，直至70％以上的种子开裂露白，停止培养。将高温消毒后的椰糠、蛭石和沙壤土，按照25％椰糠+20％蛭石+55％沙壤土的比例充分混匀，在此过程中基质掺入2克氮肥(n)、1.5克磷肥(p2o5)、1.5克钾肥(k2o)(折纯量，以液体肥最佳)，混合均匀后，采用晾晒或淋水的方式调整基质含水量达到65％，以供播种。选择底部有空隙的花盆装填基质，厚度约15cm，小心均匀点播预处理好的种子，保持行、株距10cm，种子点播好后，表层覆盖1cm厚的基质，转移到30℃的恒温培养箱中。培养过程要及时补充水分，保持土壤含水量60-65％，培养30天统计种子萌发情况。

处理组2：解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17处理组

(1)将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按6％的接种量接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏，并调整其菌数大于2.0×10⁹cfu/ml，混匀后倾注培养。

(2)使用无菌水制备保护剂，组成为：l00g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、l00g/l麦芽糊精、150g/l海漆糖和l0g/ll-谷氨酸钠。

(3)将步骤(1)得到的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，再接种10％的灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养20小时。

(4)将步骤(2)制备的保护剂添加到步骤(3)的培养液中，调整其活菌数大于1×10⁹cfu/ml，ph值为5.5。

(5)选择树龄在35年之间、生长健壮的母树于10月25日采集种子，挑选并保留铜绿色种子，剔除红色、淡红色种子。将(4)配制的菌液中活菌总数含量调整为1×10⁶cfu/ml，将采集后的种子泡入其中，于40℃恒温箱中浸泡3天，搓烂果肉，除去种皮蜡质层，捞出种子用清水洗净，晾干。将棉布高温消毒，用活菌总数含量调整为1×10⁸cfu/ml的菌液润湿包裹种子，放于30℃恒温箱中催芽，期间每天更换棉布，直至70％以上的种子开裂露白，停止培养。将高温消毒后的椰糠、蛭石和沙壤土，按照25％椰糠+20％蛭石+55％沙壤土的比例充分混匀，在此过程中按照每千克基质掺入2克氮肥(n)、1.5克磷肥(p2o5)、1.5克钾肥(k2o)(折纯量，以液体肥最佳)，混合均匀，选择底部有空隙的花盆(或培养装置)装填基质，基质装好后，采用淋水的方式将步骤(4)配制的菌液加入基质中，每千克基质的添加量为50ml菌液，调整基质含水量达到65％。小心均匀点播预处理好的种子，保持行、株距10cm，播种深度1cm，播种结束后转移到30℃的恒温培养箱中。培养过程及时补充水分，保持土壤含水量60-65％，培养30天统计种子萌发情况。

处理组3：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9处理组

(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9按6％的接种量分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏，并调整其菌数大于2.0×10⁹cfu/ml，混匀后分别倾注培养。

(2)使用无菌水制备保护剂，组成为：l00g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、l00g/l麦芽糊精、150g/l海漆糖和l0g/ll-谷氨酸钠。

(3)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，再接种10％的灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养20小时。

(4)将步骤(3)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9为2:2:1的比例混匀，并将步骤(2)制备的保护剂添加到混合菌液中，调整其活菌数大于1×10⁹cfu/ml，ph值为5.5。

(5)选择树龄在35年之间、生长健壮的母树于10月25日采集种子，挑选并保留铜绿色种子，剔除红色、淡红色种子。将(4)配制复合菌液活菌总数含量调整为1×10⁶cfu/ml，将采集后的种子泡入其中，于40℃恒温箱中浸泡3天，搓烂果肉，除去种皮蜡质层，捞出种子用清水洗净，晾干。将棉布高温消毒，用活菌总数含量调整为1×10⁸cfu/ml的复合菌液润湿包裹种子，放于30℃恒温箱中催芽，期间每天更换棉布，直至70％以上的种子开裂露白，停止培养。将高温消毒后的椰糠、蛭石和沙壤土，按照25％椰糠+20％蛭石+55％沙壤土的比例充分混匀，在此过程中按照每千克基质掺入2克氮肥(n)、1.5克磷肥(p2o5)、1.5克钾肥(k2o)(折纯量，以液体肥最佳)，混合均匀，选择底部有空隙的花盆(或培养装置)装填基质，基质装好后，采用淋水的方式将步骤(4)配制的复合菌液加入基质中，每千克基质的添加量为50ml复合菌液，调整基质含水量达到65％。小心均匀点播预处理好的种子，保持行、株距10cm，播种深度1cm，播种结束后转移到28-30℃的恒温培养箱中。培养过程及时补充水分，保持土壤含水量60-65％，培养30天统计种子萌发情况。

处理组4：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17复合菌剂处理组

(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17按6％的接种量分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏，并调整其菌数大于2.0×10⁹cfu/ml，混匀后分别倾注培养。

(2)使用无菌水制备保护剂，组成为：l00g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、l00g/l麦芽糊精、150g/l海漆糖和l0g/ll-谷氨酸钠。

(3)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，再接种10％的灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养20小时。

(4)将步骤(3)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang、双歧乳杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)v9和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)lx17为2：2：1：1.5的比例混匀，并将步骤(2)制备的保护剂添加到混合菌液中，调整其活菌数大于1×10⁹cfu/ml，ph值为5.5。

(5)选择树龄在35年之间、生长健壮的母树于10月25日采集种子，挑选并保留铜绿色种子，剔除红色、淡红色种子。将(4)配制复合菌液活菌总数含量调整为1×10⁶cfu/ml，将采集后的种子泡入其中，于40℃恒温箱中浸泡3天，搓烂果肉，除去种皮蜡质层，捞出种子用清水洗净，晾干。将棉布高温消毒，用活菌总数含量调整为1×10⁸cfu/ml的复合菌液润湿包裹种子，放于30℃恒温箱中催芽，期间每天更换棉布，直至70％以上的种子开裂露白，停止培养。将高温消毒后的椰糠、蛭石和沙壤土，按照25％椰糠+20％蛭石+55％沙壤土的比例充分混匀，在此过程中按照每千克基质掺入2克氮肥(n)、1.5克磷肥(p2o5)、1.5克钾肥(k2o)(折纯量，以液体肥最佳)，混合均匀，选择底部有空隙的花盆(或培养装置)装填基质，基质装好后，采用淋水的方式将步骤(4)配制的复合菌液加入基质中，每千克基质的添加量为50ml复合菌液，调整基质含水量达到65％。小心均匀点播预处理好的种子，保持行、株距10cm，播种深度1cm，播种结束后转移到28-30℃的恒温培养箱中。培养过程及时补充水分，保持土壤含水量60-65％，培养30天统计种子萌发情况。

试验结果统计并分析

试验结束后采用计数法统计各处理种子发芽率，用冲根法完整取出幼苗，用刻度尺准确测量黄连木幼苗地上部和地下部长度，用螺旋测微器准确测量地上部苗粗，用电子天平测量幼苗鲜重，之后将幼苗放入烘箱，105℃杀青30分钟，65℃烘干至恒重，取出后用电子天平测量幼苗干重。主要数据测定结果如下：

表1不同处理黄连木种子萌发情况

注：处理组4与处理组1比较，^▲p＜0.05；处理组4与处理组2比较，^★p＜0.05；处理组4与处理组3比较，^■p＜0.05。

从表1的统计数据可以看出，采用本发明的复合菌剂对黄连木种子的出苗率、种苗的地下部和地上部长度、苗粗、苗的鲜重和干重都有显著提升，种苗培育质量大大提高。处理组4相对于处理组1，黄连木种子的出苗率提高了48.31％、种苗的地下部提高了64.10％、地上部长度提高了68.38％、苗粗提高了27.51％、苗的鲜重提高了65.94％、干重提高了70.06％。处理组3相对于处理组1黄连木幼苗的长势虽有较大提升，但与处理4相比仍有显著差异，尤其是在发芽率方面差异极显著，处理组2相对于处理组1黄连木的发芽率虽也有较大提升，但对种苗长势影响不大，与处理组1间差异不显著。