一种高效定向富集分离产氢菌的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高效定向富集分离产氢菌的方法及其分离获得产氢菌在发酵产氢、产乙酸和丁酸中的应用。

背景技术：

氢气是一种重要的清洁能源具有高燃烧热(122kj/g)。由于非再生化石燃料消耗及其使用带来的气候变化和空气污染等问题日益凸显，氢气展现出巨大的应用前景。目前，全球各国已将氢能源的发展作为国家未来能源的重要战略之一。2018年《2050年世界与中国能源展望》指出，我国能源发展进入新旧动能转换期。《山东省新能源产业发展规划(2018-2028年)》明确，要把氢燃料电池汽车作为重点发展的主攻方向之一。由此可见，氢气具有广阔的市场与实际应用需求，然而，目前制氢方式主要是能量密集型的化工方法包括：油和天然气的蒸汽重整(78％)、煤气化(18％)和电解水(4％)。

微生物暗发酵制氢是在温和的条件下(30-40℃)，由产氢微生物将有机质(市政有机固废/废水、农业秸秆有机质和工业含有机质的废水)发酵转化为氢气和其他高附加值副产物(如乙酸和丁酸等)的过程。相比工业制氢，微生物暗发酵制氢属于低能量密度输入型，且产氢过程伴随有机质废物的降解，因而既可以实现废物资源化利用，又可以实现污染物的处理。然而，底物利用效率低和产氢微生物氢产量低，一直是微生物暗发酵制氢领域发展中亟待解决的瓶颈问题。

clostridium是目前已知广泛用于微生物暗发酵制氢中的主要接种物之一，具有广泛的产氢底物和较高的氢产量，且在发酵过程中伴随着高附加值副产物的产生。因此，clostridium一直是研究者们广泛研究的对象，是微生物暗发酵产氢过程中的优选接种物。然而，目前关于定向、快速、便捷富集分离clostridium的方法还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效定向富集分离产氢菌的方法及其分离获得产氢菌在发酵产氢、产乙酸和丁酸中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种高效定向富集分离产氢菌的方法：

1)将活性污泥热处理后添加诱导剂无定形水铁矿并在寡营养条件下孵育；其中，活性污泥的ph:5-7、固体浓度(mlss)为40-60mg/l、可溶性总有机碳(stoc)为1800-2400mg/l；

2)将孵育后的培养物转接到含有无定形水铁矿的msg富集培养基中培养，培养产物再继续传代培养，产物即为产氢富集菌群。

所述产氢富集菌群进一步分离纯化获得高效产氢菌株clostridiumpasteurianumyc-1；其中，该菌株已于2019年5月22日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019-5-22，分类学命名为巴斯德梭菌clostridiumpasteurianum。

进一步的说，

1)将活性污泥作为接种物添加到无机盐基础培养基中并添加秸秆粉末作为底物，搅拌均匀、密封、在无氧条件下于90-95℃热处理20-30min，而后向培养体系中添加10-200mg/l无定形水铁矿，厌氧、黑暗、30-37℃条件下静置孵育20-40天；待用；

2)将步骤1)孵育后的泥浆菌悬液按接种量为5-10％(v/v)的转接量转接至msg富集培养基中，并连续转接3代以上培养，富集培养物产氢富集菌群；所述每次转接过程中向msg富集培养基内添加终浓度为10-200mg/l的无定形水铁矿诱导剂。

所述活性污泥按5-20％的接种量接种至无机盐基础培养基中；所述秸秆粉末添加量占无机盐基础培养基质量的0.1-0.5％；其中，无机盐基础培养基为(g/l):cacl2·h2o,0.01-0.05；mgso4·7h2o,0.02-0.06；nahco3,1.0-2.0；naco3·h2o,0.1-0.6。

所述富集培养基msg组分(g/l):大豆蛋白胨：0.1-1；蛋白胨：0.1-1；胰蛋白胨：0.1-1；半胱氨酸：0.1-1；葡萄糖：1-10；nacl：1-5；kh2po4：0.5-1；k2hpo4：1-3。

无定形水铁矿为：将fecl3·6h2o添加至去离子水中充分搅拌至fecl3溶解完全；调节溶解液ph至接近7.0，离心洗涤，沉淀去离子水重新将沉淀悬浮并用力摇匀后再离心；重复该步骤直至离心后上清液变淡黄色；沉淀再用去离子水混匀即得无定形铁；避光保存待用。

所述产氢富集菌群悬液进行梯度稀释后，均匀涂布到添加2％琼脂糖的msg固体培养基表面，黑暗、30-37℃条件下孵育至培养基表面出现单克隆菌落，即为高效产氢菌株clostridiumpasteurianumyc-1。

一种分离获得高效产氢菌株，高效产氢菌株clostridiumpasteurianumyc-1已于2019年5月22日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019-5-22，分类学命名为巴斯德梭菌clostridiumpasteurianum。

所述的高效产氢菌株的应用，所述产氢菌在发酵产氢、产乙酸和丁酸中的应用。

本发明以活性污泥为底物，添加无定形水铁矿作为诱导剂定向富集产氢菌，产氢菌具有异化铁还原能力，而水铁矿是富集异化铁还原菌常用的的电子受体，且水铁矿的还原可以为产氢菌氢酶的合成提供充足的二价铁，同时，水铁矿的还原可以使缓冲发酵体系ph降低；沉积物作为实验样品，进一步验证了该发明方法具有较广的样品适用性。

本发明所具有的优点：

采用本发明中提出的高效定向富集分离产氢菌的方法，较为简单，实际可操作且具有低能耗的特点；采用的水铁矿诱导剂价格低廉，合成方法简便，且无污染；该方法定向富集产氢微生物效果显著，具有很强实际应用价值和广阔的应用前景。

具体为：

1)经该方法富集得到的微生物群落中产氢菌群丰度高达77％以上，且富集得到的产氢菌群结构较为单一，均为典型的产氢菌属clostridium。

2)经本发明诱导富集培养得到的产氢菌落具有底物转化效率高、氢气产量高、副产物高附加值等特征，且便于进一步分离纯化得到高效产氢菌株。

3)该方法涉及的处理过程简单易行，且诱导剂价格低廉易合成。运用该方法后，可显著高效的获得高产氢的富集物或菌株，同时获得高附加值产物乙酸和丁酸；而采用传统方法不能从该厌氧污泥中获得产氢富集物或菌株，且代谢产物中仅有少量的乳酸和乙醇。

附图说明

图1.为本发明方法获得产氢菌群(污泥+水铁矿)与对照组方法获得富集物(污泥)产氢能力对比图；

图2.为本发明方法获得产氢富集物(sf1-sf3)中产氢菌与其他方法获得富集物(s1-s3)中非产氢菌在门和属水平上的丰度变化图；

图3为分离获得菌株clostridiumpasteurianum扫描电镜图；

图4.为本发明方法获得产氢富集物(污泥+水铁矿)与对照组方法获得富集物(污泥)在高附加值产物乙酸和丁酸产量对比图；其中，图a为高附加值代谢产物乙酸，图b为高附加值代谢产物丁酸；

图5.为本发明方法获得菌株(yc-1)与已知典型产氢菌株(dsm525)产氢、产乙酸和产丁酸能力对比图；

图6.为诱导剂无定形水铁矿扫描电镜图。

具体实施方式

通过附图说明和具体实施例对本发明的内容作进一步详细说明。

本发明高效定向富集分离产氢菌的方法，具体步骤如下：

(1)活性污泥热处理结合诱导剂无定形水铁矿添加和孵育过程：

(1.1)将50g活性污泥作为接种物添加到500ml无机盐基础培养基中并添加2g秸秆粉末作为底物，搅拌均匀后分装到100ml西林瓶中每瓶40ml泥浆悬液。

(1.2)西林瓶用丁基橡胶塞密封铝盖加固后，用配备高纯氮气瓶和抽气泵装置进行抽充气循环从而完成除氧过程。除氧后，灭菌锅进行热处理杀死氢气消耗菌和非孢子形成菌，温度：95℃，时间：20min。

(1.3)热处理后，添加100mg/l无定形水铁矿，厌氧、黑暗、37℃条件下，静置孵育30天。

(2)msg培养基富集和无定形水铁矿诱导：

(2.1)将孵育后的泥浆菌悬液转接到20mlmsg富集培养基中，接种量为5％(v/v)，并连续转接两代，转接过程中添加终浓度为100mg/l的无定形水铁矿诱导剂。

(2.2)对获得的富集培养物进行产氢能力测定和群落结构分析，确认获得高氢产量、产氢菌丰度高的产氢富集物。

(3)分离纯化产氢富集菌群并获得高产氢量菌株：

(3.1)将步骤(2.2)获得的产氢富集菌群悬液进行梯度稀释后，均匀涂布到添加2％琼脂糖的msg固体培养基表面，黑暗、37℃条件下静置孵育至培养基表面出现单克隆菌落。

(3.2)挑取步骤(3.1)msg固体培养基表面长出的单克隆菌落，接种到msg液体培养后，进行菌落pcr，将获得的16srrna基因序列测序后，在ncbi数据库进行序列比对，确定获得菌株的种属关系。

实施例1

高效定向富集分离产氢菌的方法：

1)厌氧污泥热处理与寡营养诱导条件下孵育：

废水活性污泥取自啤酒生产厂处理废水的全尺寸上流式厌氧污泥床(uasb)反应器，并储存在4℃冰箱待用。其中，活性污泥的ph:5-7、固体浓度(mlss)为50-55mg/l、可溶性总有机碳(stoc)为2000mg/l；

(1)将50g活性污泥与500ml无机盐基础培养基混合均匀，并添加2g秸秆粉末作为底物，获得泥浆悬浊液；

(2)将混匀的泥浆悬浊液分装并分为实验组和对照组，实验组添加终浓度为100mg/l的无定形水铁矿，对照组添加等体积pbs溶液而不添加水铁矿；

(3)采用抽真空，冲氮气的方式除氧后；

(4)进行95℃，20min热处理；

(5)最后，黑暗、37℃静置条件下孵育，初步获得泥浆菌悬液。

2)富集培养获取菌群，测定菌群产氢量：

对上述孵育的泥浆菌悬液进一步富集，实验组以20mlmsg液体培养基作为富集培养基并添加无定形水铁矿诱导剂进行定向富集，黑暗、37℃静置条件下孵育；对照组msg富集培养基中不添加诱导剂无定形水铁矿，而添加等体积的pbs溶液。实验组和对照组均以msg富集培养基连续传代两次后，每次传递转接量为5％，第三代培养过程中约每8h，用色谱取样针，抽取0.2ml顶部气体通过气相色谱(gc)对其产氢菌群的产氢能力进行检测分析(参见图1)；每次实验组传代培养后收集的培养物依次记为sf1-sf2，对照组传代培养后收集的培养物依次记为s1-s2。

所述实验室合成无定形水铁矿具体方法如下：

(1)称取162.2gfecl3·6h2o添加至400ml去离子水，加入转子进行充分搅拌至fecl3溶解完全；(2)用10mol/lnaoh调节ph至接近7.0，换用0.5mol/lnaoh继续调节ph至7.0；(3)离心洗涤，3500r/min，10min离心后弃上清；(4)用去离子水重新将沉淀悬浮并用力摇匀后再进行3500r/min，10min离心；(5)重复步骤(4)，直至离心后上清液变淡黄色；(6)弃上清后重新加入400ml去离子水混匀后得到浓度约为1mol/l的无定形铁；(7)避光保存待；(8)合成的水铁矿单体颗粒约10-20nm，且单体常聚集成团(参见图6)。

如图1所示,孵育及富集过程中未添加水铁矿的对照组富集物在整个发酵过程中未检测到氢气的产生；而在孵育及富集培养过程中添加诱导无定形水铁矿的实验组中，随发酵时间的进行，氢气量逐渐累积，并最终达到最大值0.97mmol，且氢气含量最大可达72.5％。由此实验结果表明，采用本发明方法可以有效获取70％以上高含量氢气。

同时，在上述测定产氢过程中除了产生清洁能源氢气之外，经高效液相色谱(hplc)检测时还发现，其伴随着大量乙酸和丁酸的积累(参见图4a)。如图4a所示，在获得的富集群落随着发酵时间的进行，代谢产物乙酸逐渐累积，最高乙酸产量可达18mmol/l；而对照组富集方法获得的微生物菌群可产生的乙酸最高仅为2mmol/l。由此可知，本发明富集分离获得的富集菌群，产氢能力突出，且其乙酸产生能力是对照组的9倍，由此可见本发明所获得菌株具有意想不到的效果，同时，除了乙酸外，本发明方法富集得到的产氢菌群还伴随大量丁酸的产生(参见图4b)，如图4b所示，实验组发酵过程结束后，最大丁酸累积量可高达30mmol/l；而对照组得到的富集菌群，其丁酸产量极低，仅为1mmol/l。此结果表明，本发明富集得到的产氢菌群除了可以产生副产物乙酸外，还可以产生大量的丁酸，且丁酸产量比乙酸产量高，是乙酸产量的1.7倍。综合以上结果说明，本发明方法获得的产氢菌群，除了产生大量氢气外，还可以产生大量以丁酸和乙酸为主的高附加值产物。

由上述可见本发明方法富集得到的产氢菌群，除了在清洁能源氢气生产领域具有重要的应用前景，在高附加值产物丁酸和乙酸生产领域也具有一定的应用价值和前景。

实施例2

对上述获得高氢产量菌群落结构基于16srrna基因高通量测序分析：

在门水平实验组富集产物sf1-sf3和对照组富集产物s1-s3中，厚壁菌门均是优势门如图2(a)，其丰度均高达85％以上，如图2(b)结果所示；而在属水平上进行群落结构动态分析的结果显示，实验组sf1-sf3中主要产氢菌属clostridium随富集传代过程的进行，其丰度由1％，27.69％逐步上升为77.4％，也就是说，富集诱导过程中产氢梭菌属clostridium由稀有种属逐步转变成为了占绝对优势的菌属，结果如图2b所示。鉴于clostridium是主要的产氢菌属，且群落分析结果与产氢量结果(图1)相符合，由此实施例可以说明，该诱导富集方法可以有效的获得高氢产量菌群，尤其对clostridium菌群具有显著的富集效果。对照组s1-s3经孵育富集得到的富集物与实验组结果存在显著的差异性，未添加诱导剂无定形水铁矿的对照组，微生物群落结构在属水平上以不产氢的芽孢杆菌(bacillus)为主，且随着传代富集过程的进行，其在富集群落中的相对丰度逐渐增大，最大可达(81.4％)，结果如图2b所示。综合实验组和对照组的结果可知，本发明方法富集得到的菌群与对照组富集得到的菌群结构存在显著的差异，本发明方法富集得到的微生物菌群主要以产氢菌梭菌属(clostridium)为主，而对照组富集得到的菌群主要以不产氢的芽孢杆菌属(bacillus)为主。由此证明，富集培养过程中通过加入无定形水铁矿使产氢微生物得到大量富集进而可有效、定向富集产氢菌群的方法。

实施例3

对上述产氢菌落进一步的纯化分离：

所述产氢富集菌群悬液进行梯度稀释(以便获得产氢菌株单菌落)后，均匀涂布到添加2％琼脂糖的msg固体培养基表面，黑暗、30-37℃条件下孵育至培养基表面出现单克隆菌落，即为高效产氢菌株clostridiumpasteurianumyc-1。

将获得菌株进行菌落pcr，挑选单一菌落接入20μl无菌水中，2μl用于pcr。pcr反应体系：2μlbuffer缓冲液；2μldntp(2.5mol/l)；0.5μltaq酶(5u/μl)；0.5μlba907r(20μmol/l，5′-agagtttgatcctggctcag-3′)反向引物；0.5μlba27f(20μmol/l，5′-ccgtcaattcctttragttt-3′)正向引物；2μl单菌落悬浊液模板；2.5μl无菌水。pcr程序：95℃，30s；55℃，30s；72℃，1.5min，循环30次。并将得到的pcr产物进行16srrna基因测序分析。clostridiumpasteurianumyc-116srrna基因序列如下：atctcaccttcggccgctggccccataaaggttacctcacggacttcgggtgttaccagctctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcaactccaacttcatgcaggcgaatttcagcctgcaatccgaactgggatgagttttcaagtttagctccacctcacggtattgcatctcgttgttctcaccattgtagcacgtgtgtagccctagacataaggggcatgatgatttgacgtcatccccgccttcctcccggttaacccgggcagtctcactagagtgctcaacttaatggtagcaactaatgataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcttcctgccccgaagggcttcacgtatctctacgctattcaggagatgtcaagtctaggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccgctgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtacttcccaggcggagtacttattgtgttaactgcggcacagaaggagtcgatacctcctacacctagtactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcatgcctcagcgtcagttacagtccagaaagccgccttcgccactgatgttcttcctaatctctacgcatttcaccgctacactaggaattccgctttcctctcctgcactctagatacccagtttgaaatgcagtccccaggttgagcccggggctttcacatctcacttaagtatccgcctacacatcctttacgcccagtaaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggcttcctcctttggtaccgtcattatcgtcccaaaagacagagctttacaatccgaagaccgtcatcactcacgcggcgttgctgcatcaggctttcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctctccaactagctaatgcgccgcgggtccatctcaaagcggattactcctttaattaaagctccatgtgaaactttaatattatgcggtattaatctccctttcgggaggctattcccctctttgaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctagaaacccgaaggtttctcgctcgactgcatggtag

将获得的序列在ncbi数据库中进行序列比对，结果显示该分离得到的菌株与clostridiumpasteurianumdsm525的相似性为99％。革兰氏阳性菌(g⁺)，大小，2-5μm(参见图3)。该分离菌株yc-1在产氢量、产乙酸和产酸量上均超过典型产氢菌株dsm525(参见图5)。

实施例4

对上述获得菌群进一步的分离纯化获得高氢产量菌株yc-1：

以上述实施例诱导富集得到的产氢菌落为基础，以该产氢菌落悬液作为接种物，在厌氧操作箱内，将0.4ml的接种液滴加并用涂布器均匀涂布在含2％琼脂糖的固体msg培养基上，37℃，黑暗培养约3天，得到单克隆菌落，即为高氢产量菌株yc-1；

上述获得高氢产量菌株yc-1已于2019年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.17846，分类学命名为clostridiumpasteurianum。

随后进行菌落pcr后对获得16srrna基因序列测序；获得菌株经序列比对后，发现其与菌株clostridiumpasteurianumdsm525的相似性为99％。

菌株分离纯化鉴定后，于msg液体培养中培养，并定期取0.2ml顶部气体通过气相色谱(gc)对其混合气体中的氢气含量进行测定，并与其相似度最高的典型产氢菌株dsm525的氢产量进行比较。结果如图4所示，本发明方法富集分离得到的菌株yc-1和传统典型产氢菌dsm525菌株的氢气累计量均随着发酵时间的进行而增加，培养40h后均达到最大氢产量，但相比菌株dsm525的最大氢气产量0.71mmol，yc-1的最大氢气产量高达0.85mmol，较dsm525有显著的提高。由此表明，本发明方法富集分离得到了一株高氢产量的菌株yc-1，同时也说明，该发明方法不仅适用于富集高氢产量菌群，在分离纯化高氢产量菌株方面也具有一定的应用价值；且具有意想不到的效果。

序列表

<110>中国科学院烟台海岸带研究所

<120>一种高效定向富集分离产氢菌的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1392

<212>dna

<213>高效产氢菌株(clostridiumpasteurianumyc-1)

<400>1

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