一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用与流程

本发明属于海洋细菌及其培养与应用领域，尤其涉及一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用。

背景技术：

类胡萝卜素(carotenoids)是一类天然存在于自然界中的脂溶性色素，属于萜类化合物，含有一系列的甲基支链和共轭双键，因其甲基、共轭双键的数目和取代基的属性而呈现不同的颜色特征。自从19世纪对类胡萝卜素开始研究，已经发现将近1000多种类胡萝卜素，它们都具有多种多样的生物学功能。人类和动物都不能自身合成类胡萝卜素，主要通过食物摄取吸收。自然界的类胡萝卜素主要是由植物和微生物(微藻，细菌和真菌)合成。

类胡萝卜素因其抗氧化的特性而具有许多有益的生物活性和药用价值，比如清除氧化自由基、延缓衰老、防癌抗癌、增强机体免疫等。类胡萝卜素存在着巨大的市场前景。近年来，类胡萝卜素在医学、食品、保健等方面的应用越来越多，并且作为食品添加剂和营养品，已得到fda和who等国际组织的认可。目前，市场上消费的类胡萝卜素主要有β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素和番茄红素。仅虾青素在美国的消费量，预计2020年就可以达到670吨，价值11亿美元。

类胡萝卜素的生产方法主要分为植物(高等植物和藻类)提取和微生物发酵的方法。其中典型植物提取法主要包括：胡萝卜(daucuscarota)用于提取β-胡萝卜素；万寿菊(tageteserecta)用于提取叶黄素；番茄(solanumlycopersicum)用于提取番茄红素。国外已被批准用于商业生产类胡萝卜素的藻类有杜氏藻和红球藻。另外，三孢布拉氏霉(blakesleatrispora)在ph值为11的条件下培养4天，可以44.5mg/gβ-胡萝卜素。一株优化的法夫酵母(xanthophyllomycesdendrorhous)突变株可以产生9.7mg/g虾青素。细菌生产类胡萝卜素的相关工作主要集中在天然类胡萝卜素的生产菌(光合和非光合细菌)和基因工程大肠杆菌的研究。研究较多的生产类胡萝卜素的光合细菌主要有:着色细菌属(chromatium)、红球菌属(rhodopila)、红杆菌属(rhodobacter)、红微菌属(rhodomicrobiun)等，非光合细菌主要有副球菌(paracoccus)、黄杆菌(flavobacteriumsp.)、鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)、短波单胞菌(brevundimonas)等，但这些细菌生产类胡萝卜素的效率较低，干重菌体中的类胡萝卜素含量一般在0.1～1.2mg/g。相比于真菌和微藻，目前能够易于培养和繁殖用于生产类胡萝卜素的细菌还非常少。许多海洋动物，特别是海洋无脊椎动物的体内富含类胡萝卜素，一方面它们通过摄食积累类胡萝卜素，另一方面它们也可以通过体内的共生菌生产类胡萝卜素。然而，迄今为止，从海洋动物体内分离能够生产类胡萝卜素的细菌还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌及其培养方法与应用，以解决现有技术存在的问题。

本发明从一种海洋双壳贝类——华贵栉孔扇贝的肠道内分离、鉴定并已能够稳定培养、且能够极强地适应寡营养环境和具有高效生产天然类胡萝卜素特征的细菌，属于短波单胞菌属brevundimonas，命名为扇贝短波单胞菌(brevundimonasscallopzheng&liu501)，并且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为2019年1月7日，菌种保藏号为cctccno:m2019023。

上述高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌的培养方法，所述培养方法为将所述扇贝短波单胞菌接种到初始ph为7～9的培养基中，接种量为0.05～0.5％，摇床转速为100～200r/min，20～30℃培养3～5天。得到发酵液，从所述发酵液中提取类胡萝卜素。培养方法简单、廉价。

优选的，所述培养基为lb培养基，包括以下重量百分含量组分：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，其余为水。本发明的菌需要的培养基成分比较简单，为通用的lb培养基，不需要额外添加氮源、碳源等营养物质。其他生产类胡萝卜素的菌在培养过程中多数会添加葡萄糖、果糖、半乳糖等碳源。

上述高效生产类胡萝卜素的扇贝短波单胞菌的应用，利用培养基高效生产类胡萝卜素。可生产出1.40-1.52mg/g的类胡萝卜素。发酵液中的细菌细胞无需破壁处理和冷冻干燥，直接离心去上清液，进行有机溶剂提取，获得类胡萝卜素。

优选的，所述培养基为lb培养基。

扇贝短波单胞菌的分离：随机挑选华贵栉孔扇贝金色个体，解剖扇贝取肠道、匀浆、稀释，然后进行无菌培养。将橙色和红色的菌落挑出，进行纯化和后续的鉴定。

扇贝短波单胞菌的鉴定：通过克隆及测定该菌种的16srdna序列，并进行进化分析，结果表明该菌种与brevundimonasvesicularisstrainfdaargos的16srdna序列同源性为99％，与brevundimonasvesicularisstrain266xy4的16srdna序列同源性为98％。该菌落呈现橘红色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、有粘性。电镜观察细菌形态为长杆状，大小为1～5μm。基因组测序结果表明其存在合成类胡萝卜素(虾青素)所有关键酶的基因。

扇贝短波单胞菌培养条件的优化：分别配制四种不同营养成分的液体培养基，接种相同含量的细菌用于后续培养，培养条件为培养条件为25℃，150rpm。每12小时检测发酵液的od600值，测定及比较四种培养状态下扇贝短波单胞菌的生长率。

扇贝短波单胞菌生产类胡萝卜素的效率：在相同培养条件，在四种培养基中接种等量的扇贝短波单胞菌，进行发酵3天，将发酵液2000rpm离心10min，弃上清液，所得菌体加丙酮进行提取类胡萝卜素，并进行类胡萝卜素含量的测定和比较。

现有利用细菌生产天然类胡萝卜素的方法通常采用基因工程技术的细菌，需要30～37℃和200～220rpm的培养条件、5天的培养时间、提取类胡萝卜素的方法复杂，需要对菌体进行破碎和干燥处理，生产效率0.1～1.2mg/g。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明分离的扇贝短波单胞菌来自于海洋贝类，与宿主共生，对宿主无害，没有采用基因工程技术。因此，生态环保。

2.本发明分离的扇贝短波单胞菌具有寡营养特性，在室温25℃条件下，采用普通lb培养基就可以生产类胡萝卜素；并且提取类胡萝卜素生产中无需对细胞进行破壁及干燥处理。扇贝短波单胞菌中的类胡萝卜素可以用有机溶剂直接萃取，其他报道的类胡萝卜素生产菌多数在萃取前都需要进行破壁和干燥处理。因此，成本低、操作简单、易推广。

3.本发明分离的扇贝短波单胞菌只需要3天就能够生产1.40-1.52mg/g的类胡萝卜素。因此，生产效率高。

附图说明

图1为本发明的扇贝短波单胞菌brevundimonasscallopzheng&liu501的扫描电镜照片。

图2为本发明的扇贝短波单胞菌的16srrna系统进化树。

图3为扇贝短波单胞菌的类胡萝卜素合成通路图。

图4为不同发酵条件下扇贝短波单胞菌的生长曲线图。

图5为不同发酵条件下扇贝短波单胞菌的类胡萝卜素产量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述条件。

实施例1：扇贝短波单胞菌(brevundimonasscallopzheng&liu501)的分离、鉴定、培养条件优化和生产类胡萝卜素效率的确定

2016年11月，从广东省汕头市南澳岛海域养殖的8月龄华贵栉孔扇贝中，随机挑选金色个体20-30个，平均壳高与重量分别是54.67±1.34mm和42.77±4.12g；解剖扇贝取肠道、匀浆、稀释，然后进行无菌培养，在室温25±2℃的条件下培养72小时后，将橙色和红色的菌落挑出进行纯化和鉴定；进一步优化培养条件后进行扩大培养72小时；最后提取类胡萝卜素、测定其含量。其具体步骤如下：

1.菌的分离。用无菌pbs匀浆肠道并梯度稀释，然后将取每个稀释度100μl加入到固体lb培养基中，在室温25±2℃的条件下培养72小时后，将呈现橙色和红色的菌落分别挑出，在lb培养基上进行四区划线纯化培养。进一步对纯化的细菌进行-80℃保存。

2.菌的鉴定和命名。将200μl于-80℃保存的菌株接种于100mllb培养基中，培养8～12h，使菌活化至对数期，od600值为1.2～1.6，培养条件为25±2℃，160rpm；对所分离到的类胡萝卜素生产菌株进行了扫描电镜观察，以对该菌种进行形态鉴定，如图1，该菌落呈现橘红色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、有粘性；细菌形态为长杆状，大小为1～5μm。

另外，提取了该菌株的dna，然后pcr扩增16srrna基因，引物为细菌通用引物27f和1492r。对扩增出的16srrna进行测序，和进行ncbi比对，该菌株的16srrna系统进化树如图2所示。

利用lb培养基得到5～10g菌体，进行基因组dna提取。对于提取的dna进行高通量测序及后续分析，得到细菌的基因组数据。基于细菌基因组数据，找到该菌株的类胡萝卜素合成基因簇相关信息如图3，并得到类胡萝卜素合成关键酶(crte/b/y/z/w)的基因序列。

通过形态特征、生理生化及16srdna及全基因组测序分析鉴定该菌株属于短波单胞菌属brevundimonas。结果表明该菌种与brevundimonasvesicularisstrainfdaargos的16srdna序列同源性为99％，与brevundimonasvesicularisstrain266xy4的16srdna序列同源性为98％。由于该株菌来源于扇贝肠道内，因此将其命名为扇贝短波单胞菌brevundimonasscallopzheng&liu501。

3.扇贝短波单胞菌培养条件的筛选及生产类胡萝卜素效率的比较。

3.1.不同培养条件下扇贝短波单胞菌的生长速度比较。

分别配制有无添加葡萄糖的lb和nb液体培养基，培养基具体分为四种：lb培养基(包括0.5％酵母提取物，1％蛋白胨和1％氯化钠，其余为水)，nb培养基(包括0.5％牛肉膏，1％蛋白胨和1％氯化钠，其余为水)，添加葡萄糖的lbg培养基(包括0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％氯化钠和1％葡萄糖，其余为水)和nbg培养基(包括0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，1％氯化钠和1％葡萄糖，其余为水)。相同含量的细菌分别接种于四种培养基用于后续培养，培养条件为培养条件为25℃，150rpm。每12小时检测发酵液的od600值，比较四种培养状态下扇贝短波单胞菌的生长率，结果如图4。添加葡萄糖可以提高细菌的生长率，其中lbg培养基的生长率最高；相比nb培养基，lb培养基更加利于扇贝短波单胞菌的生长。

3.2.不同培养条件下扇贝短波单胞菌生产类胡萝卜素效率的比较。

3.2.1.类胡萝卜素提取。利用四种培养基(lb/nb/lbg/nbg)在初始ph为7～9，接种量为0.05～0.5％，摇床转速为100～200r/min，20～30℃的培养条件进行发酵3天，发酵液中的细菌细胞无需破壁处理和冷冻干燥，直接将发酵液2000rpm离心10min，弃上清液，所得菌体加丙酮进行提取，黑暗条件下摇床过夜，直至菌体变白，获得类胡萝卜素提取液。剩余菌体进行60℃烘干称重。

3.2.2.类胡萝卜素的测定和比较。将3.2.1中的提取液进行等比稀释，取200μl的稀释液于光程长为1cm的比色皿中，在紫外分光光度计480nm处测得吸光值。总类胡萝卜素含量的计算采用如下公式：

tcc(μg/g)＝a480×y×10⁴/(e1％1cm×w)

公式中，tcc是所测样品的总类胡萝卜素含量(totalcarotenoidscontent，tcc)，a480为480nm处吸光值；y为提取液体积(ml)；w为样品干重(g)；e1％1cm为在1cm光程长的比色杯中1g/l浓度溶质的理论吸收值，e1％1cm＝1900。

结果如图5。lb培养基组生产的总类胡萝卜素产量最高，为1.39mg/g菌体干重。

综合扇贝短波单胞菌的培养基成本和生产类胡萝卜素的效率，因此认为lb培养基为该菌生产类胡萝卜素的最佳培养基。培养条件为室温25±2℃、摇床转速150rpm。

采用lb培养基，在室温25±2℃、摇床转速150rpm条件下，又培养了3个批次的扇贝短波单胞菌，测得的总类胡萝卜素含量分别为：1.52mg/g、1.48mg/g和1.40mg/g。

上述实施例中，扇贝短波单胞菌(brevundimonasscallopzheng&liu501)是一株能够生产类胡萝卜素的细菌。与其他细菌相比，本发明分离的扇贝短波单胞菌能够在室温寡营养条件下培养，提取类胡萝卜素的步骤中不需要进行细胞破碎和冷冻干燥处理，并且类胡萝卜素的产量较高。此外，本发明没有采用基因工程技术。因此，本发明具有效率高、成本低、操作简单、生态环保等优点。

另外，凡通过从其他海洋双壳贝类肠道内分离的短波单胞菌及其培养方法也为本发明所述创意思想之所及。