一株分离自母乳的鼠李糖乳杆菌M9及其应用的制作方法

本申请涉及鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)，特别涉及一株分离自母乳的鼠李糖乳杆菌m9及其应用。

背景技术：

健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物称为肠道菌群。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡，一旦机体内外环境发生变化，特别是长期应用广谱抗生素，敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌而乘机繁殖，从而引起菌群失调，其正常生理组合被破坏，而产生病理性组合、引起临床症状就称为肠道菌群失调症。

肠道菌群失调症以严重腹泻或慢性腹泻为主要临床表现，有些旅游者可能因气候和环境的改变而发生肠道菌丛失调，俗称水土不服。近年来，由于冰箱的普及使用，有的家庭储存大量的肉食品及疏菜，过久的储存使食物变质，食用后引起肠道菌群失调，造成呕吐、腹泻，有的出现精神不集中甚至精神恍惚。

肠道菌群的平衡一旦被破坏，则很难重新恢复原有的平衡状态，导致肠道菌群失调难以调整和治愈。

技术实现要素：

本申请的目的之一在于提供一株从中国内蒙古、新疆、湖北、北京等地区100份健康妇女母乳样中分离得到的540株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)，其微生物保藏编号为cgmccno.16002，分类命名为：鼠李糖乳杆菌；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2018年6月22日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

在本申请中，采用pacbiosmrtrsii第三代测序平台对lactobacillusrhamnosusm9全基因组进行测定，其基因组长度3002913bp，gc含量46.77％(其中，gc含量是指在dna4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)，染色体基因组含有2965个编码基因，76个rna基因。

在本申请中，所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)可以根据包括以下方法分离得到：将采集到的100份健康妇女的母乳样品进行倍比稀释，得到10^-1～10^-2稀释梯度，吸取各梯度母乳样品200μl均匀涂布于mrs固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h。挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检。保存分离株，并提取菌株基因组dna用于后续测定分析。

其中mrs培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、tween801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1l，调节ph至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。

本申请对所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)分子生物学鉴定方法包括：

将冷冻保存的供试菌株接种于tpy增菌液体培养基中，于30℃恒温培养24h，经tpy传代培养2～3代后，取2ml对数生长末期的菌体培养物置于无菌ep管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用ctab冻融法提取菌株的基因组dna。

其中，tpy增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温800.25g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1l，121℃、15min灭菌。

采用pacbiosmrtrsii第三代测序平台对lactobacillusrhamnosusm9全基因组进行测定，其基因组长度3,002,913bp，gc含量46.77％，染色体基因组含有2965个编码基因，76个rna基因。

本发明提供的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)具有如下形态学特征：菌体在显微镜(5000倍电镜)下呈杆状，细胞成单、成对或成链状，如图1所示，不具鞭毛或纤毛，不会移动。

本发明的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)在mrs培养基上形成的明显菌落且较大，直径在0.5-1mm之间，边缘整齐，呈奶油白色的不透明菌落，如图2所示。

本申请的另一目的是提供所述鼠李糖乳杆菌m9在制备用作肠道菌群调节剂中的用途。本申请所分离的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)的发酵代谢产物具有调节肠道菌群，从而缓解腹泻的作用。

进一步地，所述鼠李糖乳杆菌m9还可以用作发酵乳制品以及发酵谷物制品的发酵剂。具体地，所述鼠李糖乳杆菌m9可以作为乳制品发酵剂，例如可以作为酸奶、饮用型酸奶、发酵乳饮料或者发酵豆乳的发酵剂。所述鼠李糖乳杆菌m9可以作为发酵谷物制品的发酵剂，例如，可以作为发酵燕麦、糙米或者薏米的发酵剂。

世界卫生组织定义的益生菌是指“摄入一定数量，能够对宿主健康起有益作用的活的微生物制剂”。

本申请提供的鼠李糖乳杆菌m9能够对胃肠道消化液和胆盐有良好的耐受性，因此，本申请提供的鼠李糖乳杆菌m9属于益生菌。

本申请还提供一种益生菌菌剂，所述益生菌菌剂由所述鼠李糖乳杆菌m9制备。

本申请还提供一种复合益生菌，所述复合益生菌包括前述鼠李糖乳杆菌m9，其中，所述鼠李糖乳杆菌m9可以为主要成分也可以为辅助成分。

在本申请中，所述复合益生菌可以为粉剂、片剂、溶液剂或者乳剂等所有医学可接受剂型。

在本申请中，所述复合益生菌可以用作调节肠道菌群平衡的调节剂。所述复合益生菌用作调节肠道菌群平衡的调节剂时，可以单独使用，也可以与其它调节肠道菌群的物质配合使用。

可选地，在所述复合益生菌中，还可以包括所述鼠李糖乳杆菌m9的代谢产物。

本申请还提供一种鼠李糖乳杆菌菌剂，该菌剂由所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)发酵而得，具体包括鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)及其发酵代谢产物。该菌剂也可以用作缓解腹泻的药物。

进一步地，本申请还提供一种包括所述鼠李糖乳杆菌菌剂的复合菌剂，在该复合菌剂中，所述鼠李糖乳杆菌菌剂可以为主要成分，也可以为辅助成分。该复合菌剂也可以用作缓解腹泻的药物。

本申请人发现，本申请提供的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)，具有优异的胃肠液耐受性和良好的胆盐耐受性，具备作为益生菌的基本条件；并且具有增强免疫抵抗作用、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性的益生特点；所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)可以作为益生菌添加到各类普通食品、保健品等中。

附图说明

图1示出鼠李糖乳杆菌m9的电镜下形态图；

图2示出鼠李糖乳杆菌m9的菌落形态图；

图3示出鼠李糖乳杆菌m9在模拟胃肠液中存活率变化图；

图4示出鼠李糖乳杆菌m9发酵稳定性结果。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

以下详述本发明。

实施例

实施例1菌株益生特性

耐酸、耐胆盐和粘附性是用来筛选益生菌的首要标准，因为益生菌被摄入人体后，在肠道内存活能力高低直接关系到益生菌能否发挥健康的促进作用，因此益生菌耐酸、耐胆盐和粘附性特性是益生菌作为功能性食补因子的重要指标。

(1)菌种供试菌液的制备

将连续传代培养的培养周期末期的菌体离心(2500×g、7min)收集，用pbs(ph＝7.2，0.8％nacl、0.02％kh2po4、0.115％na2hpo4，w/v，pbs下同)洗涤2次后，菌体悬浮于10mlpbs中，然后用灭菌pbs梯度稀释至合适倍数后，采用mrs琼脂培养基平板倾注法计菌落总数，同时测定相应稀释度菌悬液在600nm处od值。

依据上述各稀释度od值与所对应的近似菌落数(cfu/ml)的线性关系，即可通过调整各菌体在600nm处od值，使供试菌液菌体最终浓度为1～2×10⁹cfu/ml。

(2)人工胃液和肠液的制备

模拟胃肠液的制备方法：将pbs灭菌后，用1mol/lhcl调节ph值至2.5，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；将pbs灭菌后，用0.1mol/lnaoh调节ph值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟肠液。

(3)供试菌株对人工胃液和肠液耐受能力测定

(3.1)胃液耐受性：取1.0ml各供试菌液加入到9.0ml(2)中制得的人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h、3h取样平板倾注法计数测定活菌数，每个样品做3个平行，将分离纯化得到的菌株活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体。

(3.2)肠液耐受性：取1.0ml已经胃液消化3h的人工含菌胃液加入到9.0ml(2)中制得的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于进入肠液的4h和8h，即，与胃液消化的3h累加，如图4所示，所述菌液分别于7h和11h再次采样，用mrs琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做3个平行。

菌株存活率用菌株存活率可以使用以下公式i进行计算：

其中，

n1表示菌株处理后活菌数；

n0表示菌株初始活菌数。

试验结果如图3所示，由图3可知：所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)在ph＝2.5的人工胃液中消化3小时的存活率83.72％，之后继续在ph＝8.0的人工消化液中消化11小时，其存活率高达78.33％。

由此可知，所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)具有良好的胃肠道消化液耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效，所述特性是作为益生菌的基础。

本申请人认为：本发明提供的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)能够抵御消化道环境的不利影响并在肠道内很好的黏附和定植，其活菌体具有增强免疫抵抗作用、提高肠道菌群多样性、增加肠道菌群稳定性的效果，用于人以及动物时，能够密集、停留在肠内的消化管道壁上，从而起到使有害菌不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的ph值，抑制有害细菌的繁殖。并且，所述鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)活菌菌体能够生成细菌素和过氧化物，从而能够抑制病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起到帮助作用。

(4)胆盐耐受能力

在菌株传代过程中，每培养200代测定菌株的胆盐耐受能力。

试验方法：将处于培养周期末期的试验菌株按1％接种量接入含牛胆盐mrs培养基(0.3％oxgall+0.05％半胱氨酸+0.2％巯基乙酸钠)中，以不加牛胆盐的mrs为对照。将试验菌株置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其吸光值，至吸光值增加0.3个单位为止。

试验菌株耐受胆盐的能力以延滞期的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株吸光值增加0.3个单位所需时间的差值即为延迟时间(lt，lagtime)，每个菌株均做三个平行试验。

分离纯化得到的菌株活化培养三代后，以1％的接种量分别接种到含0.3％牛胆盐(培养基中添加0.2g/100ml巯基乙酸钠，0.3g/100ml牛胆盐)和不含牛胆盐的mrs培养基中，后者作为空白对照，置于37℃厌氧培养。培养期间，每隔一小时取样于620nm测定od值，每组测定三个平行，直到od值增加0.3个单位及以上时停止培养。并计算菌株在含有胆盐和不含胆盐的mrs培养基中生长，od值增加0.3个单位所需的时间，二者之差被称为延迟时间(lt)。

本发明的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)在不含胆盐的培养基中培养，od620nm值增加0.3个单位所需的时间为2.51h，在含有胆盐的培养基中所需的时间为2.17h，延迟时间为0.34h。

在本领域中，一般认为，抗性菌株(延迟时间≤0.25h)，耐受性菌株(0.25h＜延迟时间≤0.67h)，弱耐受性菌株(0.67h＜延迟时间＜1.00h)，敏感菌株(延迟菌株≥1.00h)。因此，鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)的延迟时间为0.34h，为耐受性菌株。

对于活细胞来说，胆盐能破坏活细胞的细胞膜，并且，在小肠中对益生菌存活性影响最大的因素就是胆盐，所以，对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标之一。由本实施例可知，分离自母乳的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)具有良好的益生特性。

(6)菌株糖发酵实验

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。根据api50ch标准化鉴定系统的规范流程进行操作。

本申请提供的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)可利用乳糖及发酵多种单糖，如，葡萄糖、阿拉伯糖以及麦芽糖等。

具体实验结果如表1所示：

表1lactobacillusrhamnosusm9糖发酵实验结果

其中，“+”表示能够被利用的底物，“-”表示不能被利用的底物。由表2可知，鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)可利用d/l-阿拉伯糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、木糖醇等，不可利用甘露醇、l-木糖、淀粉和糖原等等。

综上所述，本发明的鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)可以很好的利用乳糖并具有良好的胃肠液和胆盐耐受性，能够以活的状态进入人体肠道，发挥健康功效，是一株可以广泛应用于普通食品和保健品等的益生菌。

实施例2lactobacillusrhamnosusm9在发酵豆乳中的应用

豆乳中富含蛋白质、膳食纤维、矿物质、维生素，以及大量人体必需的亚油酸和亚麻酸。发酵豆乳是豆制品的重要组成部分，是在豆浆基础上接种乳酸菌发酵而成的植物性发酵食品。经乳酸菌发酵作用，发酵豆乳可提高脂质代谢，不会引起肥胖；发酵后的大豆蛋白质更容易消化吸收，且能提高机体免疫力并有效降低血清中总胆固醇含量；被分解的大豆低聚糖能促进益生菌增殖，保持肠道健康。

但是，发酵豆乳目前存在菌种适应性不强、组织状态差、发酵风味不佳以及具有豆腥味等问题。将lactobacillusrhamnosusm9添加到发酵豆乳中可以很好的改善豆乳发酵状态和风味，有效去除豆腥味。

实验方法：水预热至65℃后加入大豆粉，混料均匀后55℃水合30min，加入8％的白砂糖和稳定剂，均质后杀菌(90℃10min)，冷却41～43℃接菌发酵，其中，接菌所用菌种为嗜热链球菌st-6(5×10⁶cfu/g)和益生菌lactobacillusrhamnosusm9(1×10⁴cfu/g)，发酵终点至ph＝4.50及以下，约发酵6小时，后熟后，10℃留样每间隔7天测定货架期内酸度和益生菌活菌数变化，结果如表2所示：

表2发酵豆乳在10℃贮藏期间酸度和m9活菌数的变化

由表2的测定结果可知，发酵豆乳中添加益生菌lactobacillusrhamnosusm9没有加重豆乳的后酸化现象，几乎没有影响；发酵结束后m9的活菌数达到10⁹cfu/g以上且在贮藏期间均保持较高的活菌数，证明分离自母乳的lactobacillusrhamnosusm9具有良好的益生特性。

实施例3lactobacillusrhamnosusm9在发酵薏米饮料中的应用

目前，用于谷物饮料发酵的益生菌以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和双歧乳杆菌等乳酸菌为主。

本实施例用鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)与嗜热链球菌s10组合物发酵薏米来制备薏米饮料，并以单嗜热链球菌s10发酵薏米制备薏米饮料作为对照组。

具体实验方法：将薏米清洗并浸泡过夜后按1:10的比例加水，90℃熬制2小时，并加入耐高温淀粉酶进行水解，水解后待冷却至65℃，加入6wt％的白砂糖，混合均匀后在30mpa条件下均质，再在95℃条件下杀菌10分钟，冷却至37℃时接菌发酵。

实验组接入鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)(1×10⁶cfu/g)和嗜热链球菌s10(2×10⁶cfu/g)进行发酵；对照组接入嗜热链球菌s10(2×10⁶cfu/g)，发酵终点至ph＝4.0，发酵约20～24小时，发酵结束后进行感官评定和稳定性比较，结果如表3和图4所示：

表3发酵薏米饮料感官评鉴结果

由表3和图4结果表明，添加鼠李糖乳杆菌m9(lactobacillusrhamnosusm9)的实验组能够改善发酵薏米饮料的口感，酸中带甜，滋气味丰富柔和，而且在一定程度上增强发酵薏米的稳定性。

本申请人发现，谷物饮料最大的问题是稳定性，有研究表明，益生菌发酵可降解支链淀粉提高淀粉保水性，形成强凝胶特性；另外，微生物对糖的消耗，多种分泌酶系对蛋白质持水性和乳化性的提高、代谢物对黏度的增加，均能促进谷物饮料的稳定性。薏米是我国传统的药食兼用谷物资源，含多种必需氨基酸及矿物质，我国薏米产量较大，把薏米加工成方便食用易吸收的谷物饮料，既符合现代饮料潮流，又有利于开发薏米深加工食品。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。