专利名称：一株高产l-脯氨酸短波单胞杆菌(jnpp-1)的筛选及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产L-脯氨酸的缺陷短波单胞杆菌 (Brevundimonas sp.) JNPP-I 的筛选及应用。
背景技术：
L-脯氨酸在医药、农业、化工及食品等方面有着广泛的用途，在医药上主要作为氨 基酸类药，是复方氨基酸大输液原料之一，用于营养不良、蛋白质缺乏症、严重肠胃道疾患、 烫伤及外科手术后的蛋白质补充。也是制备巯甲丙脯酸(Captopril)——治疗顽固性高血 压和充血性心力衰竭的药物原料。在合成工业上，L-脯氨酸可参与诱导不对称反应，可作 为氢化、聚合、水介等反应的催化剂，具有活性强、立体专一性好等特点；由于L-脯氨酸具 有一定的甜味，近几年来国外已开始将其应用于食品工业上作添加剂。目前，主要采用化学 法、天然蛋白质水解法和微生物发酵法生产L-脯氨酸。由于化学合成法工艺路线较长，难 以投产；而从天然蛋白质水解液中提取L-脯氨酸，其成本高，不适于现代化工业大生产；直 接发酵法成为生产L-脯氨酸的主要途径。利用葡萄糖发酵生产L-脯氨酸的微生物包括 谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、链形冠氏杆菌、嗜乙酸棒状菌等细菌，由于L-脯氨酸是代谢 过程中的中间代谢产物，不易积累，而且发酵过程中产生的杂酸较多，直接成为L-脯氨酸 工业生产中的瓶颈。因此，筛选一株高产L-脯氨酸的微生物具有非常重要的意义；而关于 缺陷短波单胞杆菌生产L-脯氨酸的研究并未见国内文献报道。
发明内容
(要解决的问题)本发明的目的在于针对现有L-脯氨酸的生产方法中的技术难点及存在的问题， 提供一株新型的高产L-脯氨酸的缺陷短波单胞杆菌，利用该菌株发酵可生产高浓度的 L-脯氨酸，该菌株是极具有开发研究价值的L-脯氨酸的生产菌株。
发明内容
本发明的发明人从国内化工厂取得土样分离筛选获得一株产L-脯氨酸新型缺陷 短波单胞杆菌JNPP-1，并对这株菌进行了发酵研究。本发明提供的菌株是从国内化工厂取得土样分离筛选获得一株短杆菌，根据形态 特征和生理生化特性，将其鉴定为Brevundimonas sp.，编号为JNPP-1。该菌于2010年5月 11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3828。本发明提供的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I的形态特征与生理生化特征为该菌株形态为短杆状，在LB固体培养基上菌落圆形、表面光滑、菌苔湿润、不透 明、颜色灰白色；单个、成对或短链状排列，单侧鞭毛，无芽孢。氧化酶反应呈阳性，V.P.反 应呈阴性，可利用葡萄糖、麦芽糖；不能利用阿拉伯糖、木糖、蔗糖、柠檬酸盐产酸，不能水解 淀粉、酪蛋白、明胶，可以利用尿素、无机碳源。生理生化特征见表1:表 1项目结果项目结果
短杆状+水解酪蛋白_
芽胞-水解淀粉-
V.P.反应-吲躲生成-
D-葡萄糖产酸+水解明胶·*‘
L-阿拉伯糖产酸- 樣酸盐-
D-木糖产酸-氣基乙酸芳氣酸-
蔗糖产酸 - —_ -果糖产酸 - 酪氨酸水解 “ 吲哚 . 氧化酸 + 硫化氢产生_-_確薩原_；_本发明提供的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I是具有良好前景的产L-脯氨酸的新型生 产菌株，该菌株可在高渗肉汤培养基中生长。高渗肉汤培养基配方为葡萄糖20-50g/L;蛋 白胨 5-20g/L ；酵母粉 4-10g/L ；NaCl 5_20g/L ；氯化铵 50_100g/L ；琼脂粉 10_20g/L ；补充 蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7. 0-7. 4，在115°C高压蒸汽下灭菌20min ；上述的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I可以采用发酵法生产L-脯氨酸。应用上述微生物生产L-脯氨酸的方法，其步骤如下1)采用保藏号为CGMCC No. 3828的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I为生产菌种，按照常 规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到肉汤固体培养基上；2)制备的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物挑取步骤(1)的肉 汤固体培养基上的JNPP-I菌株一环，接种于装有20-60mL培养基的250mL锥形瓶中，培 养温度为30-40°C，置摇床上以90-200r/min的转速培养9_12h至对数生长中期，即得到 JNPP-I菌株的细胞液体培养物；3)发酵培养按250mL三角瓶装20-60mL的量，投入发酵培养基，接种步骤(2) 的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物，接种量为5-10% (w/w)，培养温度 为30-40°C，在摇床上以90-200r/min的转速下培养72_84h，得到发酵液；或按发酵罐容 积的40-80%投入所述的发酵培养基，以0. 07-0. IMPa高压蒸汽灭菌维持30min，冷却至 30-40°C，接入步骤(2)所述的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物，接种量 5-10% (w/w)；培养温度为30-40°C，控制通气量为1 0. 5-2vvm，控制发酵罐的搅拌转速 为200-600r/min ；发酵时间为72_84h，得到发酵液；4)产物检测将步骤(3)的发酵液在8000-12000r/min下离心5-lOmin，收集上清 进行氨基酸自动分析仪检测分析发酵液中L-脯氨酸的含量其中 步骤(1)或(2)中所述的肉汤培养基的成分及配比为葡萄糖20_50g/L ；蛋白胨 5-20g/L ；酵母粉4-10g/L ；NaCl 5_20g/L ；琼脂粉10_20g/L ；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培 养基的PH至7. 0-7. 4，在115°C高压蒸汽下灭菌20min ；步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为碳源100_150g/L，氮源20_50g/L, (NH4)2SO4 20-30g/L ；K2HPO4 0. 1-5. Og/L ；MgSO4 0. l_5g/L ；ZnSO4 0. 01-0. lOg/L ； MnSO4O. 01-0. lOg/L ；谷氨酸钠 40_60g/L ；生物素 50-200 μ g/L ；硫胺素 50-200 μ g/L ；补充 蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至6. 5-7. 4，在115°C高压蒸汽下灭菌20min。本发明所述的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株可转化葡萄糖直接生成L-脯氨酸， 发酵液中L-脯氨酸浓度高，转化率高，是一株极具开发研究价值的L-脯氨酸的生产菌株。
图1为本发明的短波单胞杆菌Brevimdimonas sp. JNPP-I菌株在葡萄糖发酵培养 基中发酵生产L-脯氨酸的结果。有益效果提供了一种具有工业应用潜力的生产L-脯氨酸的优良菌株。生物材料样品保藏短波单胞杆菌(Brevundimonas sp. ) JNPP-1，保藏日期2010年5月11日，保藏单 位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3828。
具体实施例方式实施例1短波单胞杆菌JNPP-I的分离鉴定以及菌株的保存(1)短波单胞杆菌JNPP-I的分离、筛选本发明从国内化工厂取得土样，称取1. 0-2. Og土样于250mL三角瓶中，用10_50mL 无菌水悬浮，然后置于水浴锅中，60°C处理lOmin，冷却后进行梯度稀释，取0. 2mL稀释液 涂布于肉汤固体平板上，30-40。C培养24-36h后，挑取单菌落，进行氧化酶实验检测。挑选 氧化酶反应阳性的菌株进行发酵验证。挑取氧化酶反应阳性的菌株单菌落接种到新鲜的 肉汤液体培养基中培养12h后，细胞液体培养物以5% (w/w)接种量接于装有30mL发酵培 养基的250mL的三角瓶中，30-40°C，以90-200r/min的转速振荡培养，36h后收集发酵液， 8000-12000r/min离心5-lOmin，收集上清液，采用氨基酸自动分析仪检测L-脯氨酸产量。(2)短波单胞杆菌JNPP-I的鉴定生理生化鉴定参照伯杰细菌鉴定手册第8版菌株形态为短杆状，在LB固体培养基上菌落圆形、表面光滑、菌苔湿润、不透明、 颜色灰白色；单个、成对或短链状排列，单侧鞭毛，无芽孢。氧化酶反应呈阳性，V.P.反应 呈阴性，可利用葡萄糖、麦芽糖；不能利用阿拉伯糖、木糖、蔗糖、柠檬酸盐产酸，不能水解淀 粉、酪蛋白、明胶，可以利用尿素、无机碳源。菌株保存挑取一环JNPP-I菌株接种于LB液体培养基中，30_40°C，200r/min振 荡培养24-30h后，取0. 5mL的细胞培养液转入装有0. 5mL的60%的甘油保藏管中，_20°C冷 冻保藏。该菌2010年5月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏号为CGMCC No. 3828。实施例2利用短波单胞杆菌发酵生产L-脯氨酸(1)制备缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物挑取固体肉汤培养基上的缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株一环，接种在装有50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，在30°C -40°C条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养9-12h至对数生长中期，即制得缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物。(2)发酵培养基的成分及配比为碳源50_150g/L ；有机氮源6_30g/L ； (NH4)2SO4 20-30g/L ；K2HPO4O. 1-5. Og/L ；MgSO4 0. l_5g/L ；ZnSO4 0. 01-0. 10g/L ； MnSO4O. 01-0. IOg/ L ；谷氨酸钠 40-60g/L ；生物素 50-200 μ g/L ；硫胺素 50-200 μ g/L ；pH 6. 5-7. 4，115°C高压 蒸汽下灭菌20min。所述的碳源选自葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糖蜜的一种或两种；所述的有机 氮源选自玉米浆，蛋白胨，酵母粉中的一种或两种。 (3)摇瓶发酵将上述缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物以5-10% (w/w)的接种量接种在装有灭菌的20-60mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在30_40°C条件 下，置于摇床上以90-200r/min的转速培养，发酵72_84h，L_脯氨酸的产量达到32. 67g/L。(4)发酵罐发酵将上述缺陷短波单胞杆菌JNPP-I菌株的细胞液体培养物按发酵 罐容积的40-80%投入所述的发酵培养基，以0. 07-0. IMpa灭菌30min，冷却至30_40°C，接 种量为5-10% (w/w)，培养温度为30-35°C，通气量为1 0. 5_2 (vvm)，发酵罐的搅拌转速 为 200-600r/min ；发酵时间 72_84h。
权利要求
1.一株高产L-脯氨酸的菌株的筛选及其应用，其特征在于采集自国内化工厂厂房周 围的土壤样品，筛选氧化酶反应阳性的菌株进行发酵验证。获得一株L-脯氨酸的菌株缺陷 短波单胞杆菌(Brevimdimonas sp.)，编号JNPP-I，该菌株在适宜条件下可发酵生产L-脯氨酸。
2.如权利要求1的缺陷短波单胞杆菌(Brevimdimonassp.) JNPP-I，其分离筛选条件 称取1. 0-2. Og 土样于250mL三角瓶中，用10_50mL无菌水悬浮，然后置于水浴锅中，60°C 处理lOmin，冷却后进行梯度稀释，取0.2mL稀释液涂布于肉汤固体平板上，30-40°C培养 24-36h后，挑选氧化酶反应阳性的菌株进行发酵验证。
3.如权利要求1的缺陷短波单胞杆菌(Brevimdimonassp.) JNPP-I，其筛选培养基葡 萄糖 50-70g/L, NH4Cl 20_30g/L ；K2HPO4 0. 1-5. Og/L ；MgSO4 0. l_5g/L ；ZnSO4 0. 01-0. IOg/ L ；MnSO4 0. 01-0. 10g/L ；谷氨酸钠 40_60g/L ；生物素 50-200 μ g/L ；硫胺素 50-200 μ g/L ； 琼脂20g/L。
4.如权利要求1的缺陷短波单胞杆菌(Brevimdimonassp.) JNPP-I，其形态为短杆状， 在LB固体培养基上菌落圆形、表面光滑、菌苔湿润、不透明、颜色灰白色；单个、成对或短链 状排列，单侧鞭毛，无芽孢。
5.如权利要求1所述的一株高产L-脯氨酸的菌株，其特征在于该菌株为缺陷短波单胞 杆菌(Brevimdimonassp.)，编号JNPP-1，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo. 3拟8。
6.如权利要求1的缺陷短波单胞杆菌(Brevimdimonassp.) JNPP-I，其发酵培养 基为碳源 50-150g/L ；有机氮源 6-30g/L ； (NH4)2SO4 20_30g/L ；K2HPO4 0. 1-5. 0g/L ； MgSO4 0. l-5g/L ；ZnSO4 0. 01-0. 10g/L ；MnSO4 0. 01-0. 10g/L ；谷氨酸钠 40_60g/L ；生物素 50-200 μ g/L ；硫胺素 50-200 μ g/L ；pH 6. 5-7. 4，115°C高压蒸汽下灭菌 20min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的碳源选自葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，糖 蜜的一种或两种；所述的有机氮源选自玉米浆，蛋白胨，酵母粉中的一种或两种。
8.如权利要求1的缺陷短波单胞杆菌(Brevimdimonassp.) JNPP-1，其发酵生产L-脯 氨酸的条件250mL三角瓶装20-60mL的发酵培养基，接种量为5_10 % (w/w)，培养温度 30-40°C，摇床转速90-200r/min，发酵时间72_84h ；或按发酵罐容积的40-80%投入所述 的发酵培养基，以0. 07-0. IMPa灭菌30min，冷却至30_40°C，接种量为5-10% (w/w)，培养 温度为30-35°C，通气量为1 0.5-2vvm，发酵罐的搅拌转速为200-600r/min;发酵时间 72-84h。
9.如权利要求1的缺陷短波单胞杆菌(Brevimdimonassp.) JNPP-I作为生产L-脯氨 酸的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及一株高产L-脯氨酸的短波单胞杆菌(Brevundimonas sp.)JNPP-1的筛选及应用。首次筛选到了一株高产L-脯氨酸的假单胞菌JNPP-1，结合形态特征和生理生化特性，将其菌株JNPP-1鉴定为短波单胞杆菌。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.3828。将该菌株可利用葡萄糖产L-脯氨酸，产量可达到32.67g/L。由该菌株产生的L-脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基酸之一，是氨基酸输液的重要原料，已被广泛应用于食品与医药工业等领域。
文档编号C12P13/24GK102127515SQ20101056711
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者史劲松, 张晓梅, 窦文芳, 许正宏, 许泓瑜, 赵世杰, 陆震鸣, 陈敬华 申请人:江南大学