克雷伯氏菌株Z3及其在还原六价铬离子中的应用的制作方法

本发明属于生物制造
技术领域：
，具体涉及一个克雷伯氏菌klebsiella菌株z3及其在还原六价铬离子中的应用。
背景技术：
：自1797年法国科学家沃克兰首次发现铬以来，工业上对铬及其化合物的需求量急速增加，使铬盐的生产迅速发展，随之铬矿的开采量也逐年增加。目前，全世界每年的铬产量约为750万吨。据统计，每生产1吨铬盐会排放3.5吨铬渣，每生产1吨金属铬会排放约10吨铬渣。我国作为发展中的大国，铬盐生产量及消费量均居世界第一。然而，由于铬盐生产工艺的落后，铬矿的利用率极低，导致在铬盐生产过程中产生大量的铬渣。铬渣中主要含有铬酸和铬酸钙，其中的六价铬是主要的有害物质，长期堆放经雨水淋洗冲刷后，会对土壤、地表水、地下水造成污染。据悉，我国现有铬盐生产企业25家，年生产能力32.9万吨(以重铬酸钠计)，每年排放铬渣约45万吨，历年累积600万吨。而经解毒处理或综合利用的铬渣不足17%，严重污染土壤约1250多万吨。含铬废水对环境造成危害的原因，主要是由于水体中的六价铬具有较高的毒性和迁移性。因此，含铬废水的处理一般是将六价铬还原为三价铬，使其形成cr(oh)3沉淀。传统的铬治理方法主要分为两类，一类为化学法（如铁屑铁粉处理法，硫酸亚铁还原法，铁氧体法，铬酸钡沉淀法等），主要通过化学方法改变铬离子在废水中的形态从而去除铬离子；另一类为物理法，物理法主要分为离子交换法和吸附法。离子交换法是利用离子交换剂对物质的选择性交换能力来去除废水中的污染物的方法；吸附法是利用多孔吸附材料吸附处理废水中重金属的一种有效方法。与传统物化法相比，微生物处理法具有治理成本低、对环境友好、操作简单等优点，在含铬废水治理方面具有广泛的应用前景。目前，利用微生物法治理含铬工业废水已成为国内外研究的热点，与传统的物化法相比，其优点主要体现在以下几个方面：（1）菌体易获得，对环境友好，不会造成二次污染；（2）成本低，治理效果好，沉淀产物可重复利用；（3）操作方便，工艺流程简单，易于推广。因此，利用微生物治理含铬工业废水具有广阔的应用前景，已成为现今的一大研究热点。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种克雷伯氏菌klebsiella菌株z3及其在还原六价铬离子中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株克雷伯氏菌klebsiella菌株z3，其分类为克雷伯氏菌属（klebsiellasp.），该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：cctccno：m2018231。保藏日期为2018年04月24日；保藏单位地址：中国武汉市武汉大学。菌株z3是从堆放废矿渣的土壤中分离纯化得到的，能将cr6+有效还原为cr3+。本发明提供了上述克雷伯氏菌klebsiella菌株z3在还原cr6+中的应用。进一步的，本发明还提供了上述克雷伯氏菌klebsiella菌株z3在将cr6+还原为cr3+中的应用，即将cr(vi)还原为cr(iii)。具体的，可以是：挑取斜面上的菌株z3至50mllb培养基内，振荡培养至对数期（od600≈1.0）；将处于对数期的菌株z3，以5%（体积比）的接种量接种于含cr6+的lb培养基中，振荡培养即可。每2h取样，测定培养液的od600值及上清中cr6+的含量。进一步的，振荡培养优选在36℃、180rpm条件下进行振荡培养。和现有技术相比，本发明的有益效果：本申请从长期堆放废矿渣的土壤中筛选到一株高效还原cr(vi)的菌株，经形态观察、生理生化特性、16srrna核酸序列和系统发育分析，鉴定该菌株为克雷伯氏菌（klebsiella），命名为菌株z3。cr(vi)的还原特性结果表明，z3是一株好氧菌，具有嗜碱耐盐的特性，还原cr(vi)的最适温度为36℃，最适ph为9.0。附图说明图1为初筛菌株z1、z2、z3对cr(vi)的还原能力；图2为菌株z3的菌落形态图（左）和革兰氏染色图（右）；图3为菌株z3的16srrna基因的pcr扩增产物；图4为菌株z3基于16srrna核酸序列的系统发育树；图5为菌株z3在含cr(vi)lb培养基中的生长情况；图6为温度对菌株z3的cr(vi)还原过程的影响；图7为ph对菌株z3的cr(vi)还原过程的影响；图8为初始cr(vi)浓度对菌株z3的cr(vi)还原过程的影响；图9为盐度对菌株z3的cr(vi)还原过程的影响；图10为重金属离子对菌株z3的cr(vi)还原过程的影响。具体实施方式以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例1本文从废矿渣堆放土壤中分离筛选到一株高效cr(vi)还原菌株，对该菌的生物学特性进行研究，并结合16srrna核酸序列分析，确定其在生物分类和系统发育中的地位。1材料与方法1.1土样：土壤采自河南某废弃矿区。1.2仪器。仪器厂家hzq-qx全温振荡器哈尔滨东联电子技术开发有限公司电热恒温培养箱上海申贤恒温设备厂phsj-3f型实验室ph计山东潍坊医药集团医疗器械厂ls-b50l立式压力蒸汽灭菌器上海华线医用核子仪器有限公司101-2a型电热鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司超净工作台苏净集团安泰公司制造sb-5200dtdn超声波清洗仪宁波新芸生物科技有限公司mikro-22r高速冷冻离心机德国hettick公司1.3培养基及试剂lb培养基(g/l)：nacl10.0、胰蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0；蒸馏水1000ml，ph调节至7.0，121℃灭菌20min。cr(vi)母液：称取一定容量的重铬酸钾溶于蒸馏水中，配置cr(vi)终浓度为5000mg/l的cr(vi)母液，121℃灭菌20min。1.4cr(vi)的测定方法采用二苯碳酰二肼分光光度法，具体如下：（1）铬标准贮备溶液的配置：首先将k2cr2o7置于110℃烘箱中烘干，称取0.2830g放于50ml烧杯中，加入去离子水溶解后转入1000ml容量瓶中，加入去离子水定容至刻度线，上下摇匀，此时的cr(vi)浓度为0.100mg/ml；（2）铬标准操作溶液的配置：用移液器吸取5ml铬标准贮备溶液于500ml容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度线，上下混匀，此时cr(vi)浓度为1.0ug/ml；（3）二苯碳酰二肼（dpci）混合酸的配置：称取0.2gdpci于棕色瓶中，加入50ml丙酮溶液，摇匀至dpci充分溶解后，加入50ml去离子水，然后分别缓慢加入12.5ml的浓硫酸与浓磷酸，放置于4℃冰箱中保存，可保存一周；（4）标准曲线的制作：用移液器分别吸取0.0，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0ml的铬标准操作溶液，于9个50ml容量瓶中,加去离子水稀释至刻度线，再加入3.0ml含混合酸dpci溶液，立即摇匀，静置5分钟，取上述适量溶液于3cm比色皿中，以去离子水为参照，在540nm处测量吸光度；（5）样品的测定：样品离心（6000rpm、1min），取上清液1ml于50ml容量瓶中，加入去离子水定容至刻度线，再加入3mldpci混合酸溶液，立即混匀，静止5min，取适量溶液于3cm比色皿中，在540nm处测量吸光度。1.5cr(vi)还原菌的分离于含有50mllb培养基的锥形瓶中添加一定量的铬(vi)母液，使其终浓度为20mg/l,加入3g土样，36℃，180rpm条件下振荡培养至培养基颜色（淡黄色）消失。以上述培养液为母液，将其接种至含有更高cr(vi)浓度的lb培养基中。多次重复上述步骤，直至lb培养基中cr(vi)的浓度达到200mg/l。当含200mg/lcr(vi)的lb培养基颜色变为兰灰色时，取菌液进行梯度稀释至10-6，分别取10-4、10-5、10-6稀释度的菌液0.1ml，涂布于含100mg/lcr(vi)的固体lb培养基中，每个稀释度3次重复，37℃培养培养5天，挑取不同形态的单菌落于含cr(vi)的固体lb培养基中反复划线，纯化4～5代后，获得耐铬菌株。1.6cr(vi)还原菌的筛选对1.5中分离得到的耐铬菌株，进行cr(vi)还原能力的检测，以期筛选到高效的cr(vi)还原菌株。方法如下：分别将处于对数期的耐铬菌株，接种至cr(vi)质量浓度为100mg/l的lb培养基中，于36℃，180rpm振荡培养24h，离心（6000rpm，4℃，10min）后检测上清液中cr(vi)的浓度，每组三个重复，测定不同菌株对cr(vi)的还原能力。1.7分离菌株的形态观察将1.6分离所得单菌株分别接种于lb培养基内，37℃、180rpm摇床培养。取菌液进行稀释涂布平皿，培养24h，观察菌落形态，进行革兰氏染色。1.8分离菌株的生理生化试验生理生化试验参照《常见细菌系统鉴定手册》进行。1.9cr(vi)还原菌16srrna核酸序列分析及系统发育树的构建细菌总dna的提取采用试剂盒法。引物为16srrna通用引物，27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'、1492r：5'-ctacggctaccttgttacga-3'。pcr反应体系（50μl）为：taq聚合酶(5u/μl)1.0μl、基因组dna（20ng/μl）1.0μl、10×buffer(含2.5mmol/lmg2+)5.0μl、dntp（10mmol/l）1.0μl、27f引物(10umol/l)和1492r引物(10umol/l)各1.5μl、ddh2o39.0μl。pcr反应条件：94℃10min；94℃1min、54℃1min、72℃1.5min，25个循环；72℃10min终止。pcr产物利用回收试剂盒纯化后，交由上海生物工程有限公司测序。将测得的序列在ncbi上进行blast比对分析，利用软件mega6.0构建16srrna系统发育树。1.10cr(vi)还原菌的生长曲线挑取斜面培养的分离菌株至50mllb培养基内，36℃、180rpm振荡培养至对数期（od600≈1.0），以5%（体积比）的接种量接种于含有40mg/lcr(vi)的50mllb培养基中，36℃，180rpm振荡培养，每2h测定培养液的od600及cr(vi)的含量。2结果与分析2.1cr(vi)标准曲线的绘制以不同标样的cr(vi)浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立坐标系进行线性分析，得到铬的标准曲线方程为：y=0.0147x+0.0021，r2=0.9999，cr(vi)浓度与吸光值相关性显著。2.2初筛菌株对cr(vi)的还原能力通过富集和驯化，从土样中分离获得3株耐受铬的菌株，分别命名为z1、z2、z3。三个菌株对cr(vi)均具有还原能力，还原率分别为31%、42%和91%，z3还原能力最强（见图1）。目前已报道的cr(vi)还原菌中，大多对cr(vi)的还原时间较长、还原率较低，本实验分离获得的菌株z3能耐受200mg/l的cr(vi)，在22h对70mg/lcr(vi)的还原率高达92%。2.3菌株z3的形态特征将分离纯化的cr(vi)高效还原菌株（还原率为92%）命名为z3。z3在lb固体培养基上呈白色粘液菌落，以接种环挑起，易拉成丝（见图2左）。革兰氏染色结果（见图2右）表明：菌株z3为革兰氏阴性菌，细胞呈短杆状，直径2～3μm，长5～10μm。2.4菌株z3的生理生化鉴定菌株z3的部分生理生化试验结果如表1所示。结果表明：z3对葡萄糖氧化产酸、接触酶、硝酸盐还原、淀粉水解、vp以及onpg试验均为阳性；对明胶液化、mr、吲哚和氧化酶试验为阴性。表1菌株z3主要生理生化特征生理生化指标结果生理生化指标结果葡萄糖氧化产酸+氧化酶试验-接触酶试验+硝酸盐还原+明胶液化-淀粉水解+mr试验-vp试验+吲哚试验-onpg+注：+代表阳性，－代表阴性。2.5菌株z3的16srrna核酸序列及系统发育分析pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果（见图3）显示：菌株z3的16srrna核酸片段约为1500bp。pcr产物纯化回收，测序后在ncbi上进行blast序列比对，并构建系统发育树（见图4）。结果表明：菌株z3与klebsiella的同源性达99%，结合形态学和生理生化特性，鉴定z3为klebsiellasp.。2.6菌株z3在含cr(vi)lb培养基中的生长菌株z3在含cr(vi)lb培养基中的生长情况如图5所示，从图5中可知：z3的生长周期约为24h，菌体细胞可在20h完全还原40mg/l的cr(vi)。其中0～1h为菌体的延迟期，之后菌体生长进入指数期，该时期菌体细胞生长旺盛，对cr(vi)的还原速率较快。在第8h进入稳定期，持续约4h，随后进入衰亡期，od600值开始下降。实施例2以上通过富集、分离、纯化获得一株可高效还原cr(vi)的菌株z3。因此，下述主要以z3为研究对象，对其cr(vi)的还原特性做进一步的研究。1材料与方法1.1菌种与培养基菌种：克雷伯氏菌klebsiellaz3lb培养基（ph7.2）：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。1.2cr(vi)的测定方法二苯碳酰二肼分光光度法，方法同上。1.3环境因子对cr(vi)还原过程的影响1.3.1温度对cr(vi)还原过程的影响将处于对数期的菌种以5%的接种量接种至含有cr(vi)浓度为100mg/l的lb培养基中，分别于24、28、32、36、40、45℃条件下，摇床振荡培养12h，测定培养液中cr(vi)的还原率。1.3.2ph对cr(vi)还原过程的影响在cr(vi)浓度为100mg/l的lb培养基中，接种5%处于对数期的菌种，培养基初始ph值分别设置为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，于36℃，180rpm振荡培养，每2h取样，测定培养液中cr(vi)浓度，研究ph对菌体还原cr(vi)过程的影响。1.3.3初始cr(vi)浓度对cr(vi)还原过程的影响于lb培养基中加入不同体积的cr(vi)母液，使培养基中cr(vi)的终浓度分别为70、85、100、140、160、200mg/l。接种5%处于对数期的菌种，36℃，180rpm振荡培养。每2h取样，测定培养液中剩余cr(vi)的浓度，研究不同初始cr(vi)浓度对菌体还原cr(vi)过程的影响。1.3.4盐度对cr(vi)还原过程的影响分别以5%的接种量向含有nacl浓度分别为0、1、3、5、10、20、40、60g/l的lb培养基中接种处于对数期的菌种，于36℃，180rpm条件下振荡培养24h，测定培养液中cr(vi)的还原率。离心（6000rpm，4℃，10min）收集菌体，101℃干燥12h，测定菌体干重，研究不同盐度对菌体还原cr(vi)过程的影响。1.3.5金属离子对cr(vi)还原过程的影响向含有初始cr(vi)浓度为100mg/l的lb培养基中，分别加入一定量的pb(no3)2、mnso4·h2o、mgso4·7h2o、fecl3·6h2o、znso4·7h2o、agcl、cuso4·5h2o、al2(so4)3·18h2o、nicl2·6h2o，使各金属离子的浓度均为20mmol/l，以5%的接种量接入处于对数期的菌种z3，36℃，180rpm振荡培养24h，测定培养液中cr(vi)浓度，研究不同金属离子对菌体还原cr(vi)过程的影响。2结果与分析2.1环境因子对cr(vi)还原过程的影响2.1.1温度对菌体还原cr(vi)过程的影响温度是微生物生长过程中最重要的环境因素，也是影响微生物代谢活动的重要因素之一。不同温度下，菌株z3在12h内的cr(vi)结果如图6所示，在24～36℃范围内，培养液中cr(vi)的还原率随着温度的升高而增加，当温度为36℃时，cr(vi)的还原率最大，为51%；随着温度升高，在45℃时，菌株z3对cr(vi)的还原作用受到抑制，还原率为40%。结果表明：在24～45℃的温度范围内，菌株z3对cr(vi)进行不同程度的还原，最适温度为36℃。2.1.2ph对菌体还原cr(vi)过程的影响ph是影响微生物生命活动与物质代谢的另一重要因素。ph对微生物生命活动的影响主要表现在以下几个方面：（1）ph值的改变会引起细胞膜表面电荷的变化，进而影响细胞对营养物质的吸收；（2）ph通过影响菌体周围营养物质的离子化程度，从而影响细胞与外界物质的交换；（3）ph能改变蛋白质、核酸等生物大分子所带的电荷，通过影响生物大分子如酶的生物活性，从而影响细胞内的生物化学过程，进而影响微生物的代谢活动。ph对cr(vi)还原过程的影响如图7所示。结果表明，在cr(vi)初始浓度为100mg/l时，菌株z3在酸性和碱性条件下均可对cr(vi)进行还原，但碱性条件更利于cr(vi)还原。当ph为5.0时，cr(vi)的还原率仅为30%左右；随着ph升高，在ph为8.0～10.0时，菌株z3对cr(vi)的还原率较高，ph9.0时，还原率高达90%以上。结果表明菌株z3具有嗜碱特性，是一株嗜碱菌，其对cr(vi)还原的最适ph为9.0。2.1.3初始cr(vi)浓度对菌体还原cr(vi)过程的影响cr(vi)具有很强的细胞毒性，不同浓度的cr(vi)会对微生物产生不同程度的影响。实验在ph为9.0，温度为36℃条件下进行。结果如图8所示，在不同初始cr(vi)浓度条件下，当菌体,培养至第22h时，菌体对cr(vi)的还原均达到最大。当cr(vi)初始浓度为70mg/l时，菌体对cr(vi)的还原率最大，为92%。随着cr(vi)浓度的升高，菌体对cr(vi)的还原率逐渐下降，但培养液中cr(vi)的去除总量却呈现先升高后降低的趋势。当cr(vi)的起始浓度为140mg/l时，cr(vi)的去除量达到80mg/l。由以上结果可知：菌株z3能对70～200mg/l范围内的cr(vi)进行不同程度的还原，随着cr(vi)初始浓度的升高还原率逐渐下降，当cr(vi)浓度分别为70mg/l和140mg/l时菌体细胞对cr(vi)的还原率和去除量最大，分别为92%和80mg/l。2.1.4盐度对菌体还原cr(vi)过程的影响无机盐是微生物生长过程中不可缺少的环境因素，它不仅参与细胞结构物质的组成，调节细胞渗透压及氧化还原电位，还可作为酶的激活剂甚至可作为某些自养微生物的能源。微生物所需的大量元素中的钠是细胞内重要的阳离子之一，它主要参与细胞渗透压的调节。对于嗜盐菌而言，钠除了维持细胞的渗透压外，还与营养物质的吸收有关。为检测菌株z3的耐盐性能及高盐条件下cr(vi)的还原情况，将处于对数期的菌种，接种于cr(vi)浓度为100mg/l，含盐量不同的lb培养基中，36℃，180rpm条件下振荡培养24h，测定菌体干重及培养液中cr(vi)的浓度。结果如图9所示：在nacl浓度为0～20g/l时，菌体干重及cr(vi)的还原率均随nacl浓度的升高而增大；当nacl浓度为20g/l时，cr(vi)的还原率达到最大为72%。在20～60g/l的高盐条件下，cr(vi)的还原率随着nacl浓度的升高而降低，但菌体干重仍随nacl浓度的升高而增加，最高可耐受60g/lnacl。以上结果表明，菌株z3具有很强的耐盐性能。2.1.5金属离子对菌体还原cr(vi)过程的影响重金属离子在微生物生长过程中起到非常重要的作用，如k、ca、na、mg、p、s、fe等元素参与能量转移、信号传导及细胞结构的组成，一些微量元素如mo、mn、co、ni、se等则参与酶的组成或作为酶的激活剂。但大多数重金属离子是蛋白质的沉淀剂，对菌体细胞具有毒害作用，高浓度时会抑制细菌生长甚至导致死亡。因此，在cr(vi)的微生物还原工艺中研究重金属离子对微生物还原cr(vi)过程的影响十分必要。重金属离子对z3还原cr(vi)的具有抑制作用，抑制作用由强到弱依次为ag+>ni+>mg2+>zn+>mn2+>al3+>pb2+>cu2+>fe3+，其中只有pb2+、cu2+、fe3+对cr(vi)的还原有明显的促进作用，重金属共存下的还原率分别为97.5%、99.1%、99.4%。同样从图10的实验结果可知：ag+对cr(vi)还原的抑制作用最强，这是因为ag+本身就具有很强的抑菌作用。此外，本申请运用扫描电镜(sem)、梯度超速离心、eds、xps等分析技术研究了z3对cr(vi)的还原机理，结果如下：（1）扫描电镜结果显示，cr(vi)胁迫条件下菌体周围会分泌大量的胞外多聚物，形成对铬的耐受应答，且随着cr(vi)浓度的升高菌体形态变化明显，高cr(vi)浓度下菌体由长棒状变为短杆状，比表面积减小并分泌更多的胞外多聚物。（2）铬在菌体亚细胞中的分布结果表明：大部分的铬被拦截在菌体细胞外，菌体中的铬含量较少,占10.8%～14.4%，在菌体细胞中，胞外多聚物（85.6%～89.2%）及细胞质（11.5%～21.2%）是细胞中铬的主要分布位置，仅有少量的铬分布于细胞壁（6.5%～12.8%）和细胞膜（3.5%～10.4%）中。（3）在细胞各组分对cr(vi)的还原结果中，细胞各组分对cr(vi)的还原能力由高到低依次为：胞外多聚物>细胞质>细胞膜>细胞壁。细胞各组分对cr(vi)的还原能力表明，胞外多聚物在cr(vi)的还原过程中起着非常重要的作用，铬还原酶可能位于胞外多聚物中。（4）菌体细胞的des分析结果显示：在处于cr(vi)还原过程中的菌体细胞中检测到铬的存在，还原过程结束后的菌体细胞中并没有检测到铬，表明还原过程中产生的cr(iii)沉淀主要在培养液中，z3对cr(vi)的还原方式主要为胞外还原。（5）xps结果表明：在对cr(vi)的还原过程中，z3主要将溶液中可溶性的cr(vi)还原为水溶性较低的cr(iii)沉淀，从而达到去除cr(vi)的目的。当前第1页12