一种无腥味低分子量牡蛎肽及其应用的制作方法

本发明属于水产品深加工
技术领域：
，具体涉及一种无腥味低分子牡蛎肽及其应用。
背景技术：
：牡蛎是我国药食同源的食品之一，味道鲜美，营养丰富。牡蛎中蛋白含量很高，氨基酸组成完善。由于牡蛎以海藻和浮游生物为食，这些藻类及其携带的微生物在代谢过程中产生腥味物质，逐渐积累形成了牡蛎独有的腥味，影响了食用口感，牡蛎产品进行脱腥处理是必需的。此外，因为水解过程的不可控，会产生大量游离氨基酸和苦味肽，降低了分子肽得率，也影响了产品的大规模应用。目前水产品酶解多肽的脱腥方法主要有以下几类：1、物理吸附或包埋法，如使用粉末活性炭对腥味物质进行吸附，使用β环糊精、甲壳素、壳聚糖等物质进行包埋，此方法的缺点是无选择性，多肽损失率高；2、遮蔽法，如使用辛香味调料、乙基麦芽酚、乙酸乙酯等物质遮挡原有腥味，此方法的缺点是添加物多，引入了其他味道；3、超临界萃取脱腥，采用超临界萃取仪进行脱腥，效果理想，但是设备成本高，工艺复杂，不利于大规模应用；4)超滤除腥，一般不单独使用，与其他工艺配合使用，超滤速度受到料液情况影响，超滤膜需要定期清洗。牡蛎肽腥味主要产生于制备过程中，牡蛎内脏中的藻类、微生物含量丰富，且牡蛎肉中富含不饱和脂肪酸，这些物质不断地代谢、氧化、相互作用，令许多含硫含氮化合物发生转化，游离脂肪酸发生酸败，产生难以去除的腥臭味，单一添加某种物质难以达到较为理想的除腥效果，有必要研发一种新型的脱腥方法，克服现有技术不足，易于放大生产，降低成本。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种无腥味低分子牡蛎肽，既可以有效去除牡蛎本身带有的特殊味道，抑制油脂氧化及微生物腐败后产生的腥臭味，提高产品品质；而且制备的牡蛎肽具有降血压的作用，有效提供能了制备的多肽的应用价值。本发明首先提供一种无腥味低分子牡蛎肽，其制备方法如下：1)牡蛎酶解液的制备：将牡蛎肉匀浆后，在匀浆液中依次加入胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，制成酶解液；2)将牡蛎酶解液，保持温度在40-50℃；加入海洋解脂亚罗酵母的酶蛋白进行除腥；处理结束后对酶解液进行灭活；所述的海洋解脂亚罗酵母，优选为保藏编号为cctccm203095的适冷性海洋酵母bohaisea-9145；所述的酶蛋白的制备方法，是将海洋解脂亚罗酵母接种到培养基中进行发酵培养，培养液离心去除菌体后，上清液用100kda的超滤膜进行超滤，再用10kda的超滤膜浓缩，冷冻干燥制成酶蛋白；所述的培养基，其一种组成如下：3％豆饼粉，2％花生粕，0.5％橄榄油；所述的对酶解液进行灭活，是在100℃15min对酶进行灭活；3)将步骤2)处理的酶解液离心去除上层漂浮物及底层沉淀，保留上清液；4)在上清液中加入乳酸菌和酵母菌，在30-35℃条件下搅拌均匀，静置12-24h进行发酵处理；5)将步骤4)的发酵液进行离心去除沉淀，选用不超过10000da的超滤膜进行超滤澄清；作为优选，其中超滤膜的截留分子量为2000da；更进一步的，所述的超滤膜的截留分子量不超过1000da；6)将超滤液进行低温干燥，制备得到无腥味低分子牡蛎肽干粉。本发明所制备的牡蛎肽可用于制备降血压的制剂。本发明制备的具有降血压效果的无腥味低分子牡蛎肽干粉最大限度的保留了牡蛎肽中的活性成分，不引入其他香料的气味。通过酶的催化作用，将产生腥臭味道的有机醛酸转化为气味友好的物质。通过微生物作用，中和碱性腥臭物质，将多余糖分转变为蛋白，提高了牡蛎肽的质量。附图说明图1：脱腥牡蛎肽与酶解液挥发性盐基氮(tvb-n)值变化情况图；图2：脱腥牡蛎肽的降血压效果图。具体实施方式在本发明中对于筛选的获得的具有降血压活性的牡蛎肽水解液中添加海洋解脂亚罗酵母的酶蛋白，一方面可以对酶解液中长链的醇、醛、酸、酯进行水解、醇解、酯化、转酯化及逆向合成等，将产生腥臭味道的有机物质进行转化，降低油脂含量，抑制油脂氧化和腐败过程。另一方面可以将一些水不溶物质转换为水溶性物质，提高后续离心分离的效率。经过分离的水解液加入乳酸菌和酵母菌，其中乳酸菌可以显著降低料液的ph，中和氨气、三甲胺、甲硫醇、硫化氢、吲哚和杂环氨含氮化合物等碱性腥臭物质，酵母类可以有效利用料液中的糖类，产生高质量蛋白，提高多肽品质和含量。最后结合超滤设备进行处理，可以得到高品质的无腥味低分子牡蛎肽。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。实施例1：牡蛎酶解液的制备方法1、海洋微生物酶的制备方法将适冷性海洋酵母用接环划线或涂布在ypd平板(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)上生长。挑取单菌落接种于产酶培养基(3％豆饼粉，2％花生粕，0.5％橄榄油)中，25℃培养24h。离心去除菌体，上清使用100kda的超滤膜去除大分子物质，再用10kda的超滤膜浓缩10倍后，冷冻干燥，作为酶制剂使用。其中适冷性海洋酵母为bohaisea-9145，分离自渤海海泥中，保藏号为cctccm203095(在申请号为200410096668.7的中国发明中公开了)，既具有脂肪酶又具有酯酶活性。2、酶蛋白的活性测定底物为对硝基苯基月桂酸酯p-nitrophenyllaurate。反应体系为:a液,40mgpnp-laurate溶解在12ml异丙醇中。b液,0.1mol/lph8.0磷酸盐缓冲液100ml加入0.4gtritonx-100。a、b液配好后4℃冷藏。测活前取0.1mla液和1.5mlb液混合后置于35℃水浴中孵育3min,随后加入50μl酶液(以50μl,100℃5min灭火的酶液为对照)继续水浴8min,取出反应液置于冰上终止反应,在410nm下测定其吸光值。酶活力单位(u)定义为:在35℃,ph8.0条件下,每分钟催化底物水解产生1.0μmolp-nitrophenol所需的酶量。蛋白含量测定:采用bradford(1976)测定方法，测得酶的活性测定的催化活性为7610u/mg。3、微生物除腥剂的制备方法1)乳酸菌的培养：挑取mrs平板(蛋白胨1％，牛肉粉0.8％，酵母粉0.4％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，乙酸钠0.5％)上的乳酸菌单菌落，接种于液体培养基中36℃培养24～48h，离心收集菌体，重新悬浮于无菌缓冲液中。2)酵母菌的培养：挑取ypd平板上的酵母菌单菌落，接种于液体培养基中30℃培养48h，离心收集菌体，重新悬浮于无菌缓冲液中。将乳酸菌与酵母菌1:1混合，使用前离心去除缓冲液，湿菌体加入到水解液中。使用上述制备的酶蛋白、乳酸菌与酵母菌来制备牡蛎肽，具体过程如下：1)牡蛎酶解液的制备：称取10g牡蛎肉，将牡蛎肉匀浆后，加入50ml蒸馏水，在匀浆液中依次加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，在30-35℃进行酶解5h制成酶解液；2)将牡蛎酶解液，保持温度在40-50℃；加入海洋解脂亚罗酵母的酶蛋白至6000u/ml进行除腥；处理结束后进行灭活100℃15min对酶进行灭活；3)将步骤2)处理的酶解液在10000rpm/min离心10min去除上层漂浮物及底层沉淀，保留上清液；4)在上清液中加入乳酸菌和酵母菌的湿菌体，在30-35℃条件下搅拌均匀，静置12-24h进行发酵处理；5)将步骤4)的发酵液在10000rpm/min离心10min进行离心去除沉淀，选用不同分子量的超滤膜进行超滤澄清；超滤膜的截留分子量选择500-10000d,获得1000d以下、2000-5000d、5000-10000d不同分子量的多肽，进行降血压功能检测，最终确定选用分子量小于1000的多肽；6)将分子量小于1000的多肽的超滤液进行低温干燥，制备得到无腥味低分子牡蛎肽干粉。实施例2：低分子牡蛎肽除腥效果评价1、挥发性盐基氮(tvb-n)指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，可用总挥发性盐基氮的含量判断牡蛎肽腐败及产生恶臭气味的程度。由图1可知，使用本发明中的制备方法获得的牡蛎肽，与未曾经过脱腥处理的牡蛎水解液相比，有效抑制了挥发性盐基氮(tvb-n)随时间的升高趋势，腐败腥臭味大大减少。2、使用水产品腥味感官评分标准(如表1)来比较脱腥效果，结果表明实施例1制备的无腥味低分子牡蛎肽干粉的分值完全符合水产品的无腥味要求，由表2可知，本发明中使用的酶和微生物制剂可以有效去除牡蛎的腥臭味道，并且可以改善产品的浑浊度和颜色。表1：水产品腥味感官评分标准表2：各样品的感官评价结果表3、通过测量实施例1的牡蛎肽的氨基酸组成，其谷氨酸含量最高(5.35％)，其次是天冬氨酸和赖氨酸。获得的牡蛎肽中低于1000的水解蛋白占总蛋白的97％以上，牛磺酸含量为2.04g/kg，锌含量为490mg/kg。表3：牡蛎肽的氨基酸组成氨基酸种类含量(g/100g)占氨基酸总量比例(％)丙氨酸2.186.27丝氨酸1.694.86亮氨酸2.67.47天冬氨酸3.810.92异亮氨酸1.74.89甘氨酸2.146.15精氨酸2.497.16组氨酸0.92.59缬氨酸1.925.52脯氨酸1.885.40苏氨酸1.795.15苯丙氨酸1.273.65蛋氨酸0.922.64谷氨酸5.3515.38赖氨酸2.878.25酪氨酸1.293.714、实施例1制备的牡蛎肽的降血压效果检测试验用雄性原发性高血压大鼠共30只，每笼2只，体质量为260±20g，自由进食和饮水。将大鼠随机平均分成空白组、阳性对照组和牡砺肽组，每组10只。适应饲养3d,3d后每日进行心脏收缩压(sbp)测定、体质量称量、给药灌胃等操作。牡砺肽组灌胃牡砺肽，150mg/kg(体质量)；阳性对照组灌胃卡托普利，剂量为20mg/kg(体质量)；空白组灌胃蒸馏水0.5ml/300g(体质量)。早晚灌胃两次，共灌胃28d，停止灌胃后继续观察6d。每天测量，每只测定5次，取其平均值。由图2可以看出，随着灌胃时间的延长，空白组、阳性对照组和牡砺肽组心脏收缩压均先下降后到达稳定。牡砺肽各天数值明显低于空白组，第25天时降到最低值后，基本保持恒定。停止灌胃ace抑制肤6d内，牡蛎肽组的心脏收缩压与空白组相比仍十分显著，说明牡砺肽降压的稳定性良好。当前第1页12