一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法与流程

本发明涉及一种小分子肽的制备工艺，尤其涉及一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法。

背景技术：

骨髓基质细胞起源于胚胎发育的间充质干细胞，是成体骨髓中的一类多能干细胞，具有多向分化潜能，具有分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他几种结缔组织细胞的潜能，亦可转分化成心肌细胞、骨骼肌细胞，也是造血微环境重要的组成成份。细胞周期反映了细胞增殖能力的变化。细胞粘附是细胞相互作用的重要方式之一，广泛参与细胞的生长迁移、组织发育、器官形成等生理过程。反映了细胞在体外培养逐渐趋于稳定，对进一步的细胞增殖和运动具有重要的作用。

细胞的迁移能力对活细胞至关重要，是在细胞黏附作用发挥的基础上，接收到迁移的信号而产生移动的生理反应，骨髓基质细胞黏附和迁移能力的增强意味着骨髓细胞增殖、分化、成熟的进程加快。

牦牛是青藏高原特有牛种，目前，对于牦牛皮的研究一直是以脱毛后的皮进行，忽略了牦牛毛的作用。

牛毛主要是由角蛋白组成，具有氨基酸长链，角蛋白类似于胶原，有两种主要蛋白，一种为含硫元素较多的细胞间质蛋白，含有胱氨酸；另一种为含硫较少的纤维质蛋白。而胱氨酸是一种含硫氨基酸，多含于角蛋白中，是人体必需的氨基酸之一，对人体没有不良效果。医药上有促进机体细胞氧化和还原机能，增加白血球和阻止病原菌发育等作用，也用于痢疾、伤寒、流感等急性传染病、气喘、神经痛、湿疹以及各种中毒疾患等，并有维持蛋白质构型的作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、易于实施的增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮1~2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，经紫外灯照射，得到辐照后的牦牛皮；

⑵所述辐照后的牦牛皮切割成1~3cm的块，沸水中提取5~30分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮；

⑶将所述步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为0.5%~10%的酶解液中酶解，过滤，得到滤液；所述牦牛皮与所述酶解液的质量比为1：5~1：15；

⑷所述滤液中加入其质量3~10%的活性炭，充分搅拌后煮沸5~40分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液；

⑸所述滤渣放入质量浓度为0.5%~8%的酶解液中酶解，过滤，得到第二次酶解溶液；所述滤渣与所述酶解液的质量比为1：8~1：20；

⑹将所述第一次酶解溶液与所述第二次酶解溶液合并后煮沸5~40分钟，经差速离心分离，得到上清液；

⑺所述上清液经膜分离，截取分子量为10~45kda的牦牛皮小分子肽溶液，该牦牛皮小分子肽溶液经冷冻干燥，即得。

所述步骤⑴中紫外灯照射条件是指辐射波长为200nm~275nm，照射时间为0.3~2.0小时。

所述步骤⑶中质量浓度为0.5%~10%的酶解液是指在1l去离子水中加入5~100g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

所述步骤⑶中酶解条件是指温度为30~45℃，时间为0.5~8小时。

所述步骤⑸中质量浓度为0.5%~8%的酶解液是指在1l去离子水中加入5~80g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

所述步骤⑸中酶解条件是指温度为30~60℃，时间为0.5~12小时。

所述蛋白酶是指菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、巯基蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶中的一种或两种及以上的复合物。

所述步骤⑹中差速离心分离的条件是指先2000~3000rpm离心5~30min，再10000~15000rpm离心5~20min。

所述步骤⑺中膜分离是指孔径为0.01~0.2μm的超滤膜。

所述步骤⑻中冷冻干燥的条件是指温度为-15℃~-50℃，时间为4~36小时。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明中的牦牛皮小分子肽是以青藏高原特有牛种牦牛带毛的皮为原料，经分离后得到的分子量为10~45kda的牦牛小分子肽。牦牛皮小分子肽的开发，使青藏高原的特有资源牦牛得到更好利用。

2、本发明所制备的牦牛皮小分子肽经药效学实验证明，可通过影响骨髓基质细胞的周期、黏附和迁移能力达到促进骨髓基质细胞增殖的作用，能显著促进骨髓基质细胞的黏附和迁移能力，使得更多的骨髓基质细胞进入分裂期。其完成骨髓细胞周期循环全过程为56.01，骨髓细胞粘附力为55.9%，骨髓基细胞迁移能力24小时达到17.07%，48小时达到36.68%。

①牦牛皮小分子肽对骨髓基质细胞细胞周期的影响：

取200mg/ml牦牛皮小分子肽加入6孔板中预热，每组3个复孔，接种细胞悬液接至内含盖玻片的6孔板中；co2培养箱中培养过夜，使细胞长在盖片上；取出盖片，pbs漂洗3次，每次3min，加入固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定30min,pbs漂洗3次，每次3min,加入giemsa液染色10min后，晾干盖片反扣在载玻片上，镜检。

细胞的生命过程就是不断地新生和死亡，重要过程就是细胞周期的循环，分为间期和分裂期两个过程。实验结果如表1所示，和空白组相比，牦牛皮小分子肽处于分裂期的细胞更多（p<0.01），表明牦牛皮小分子肽能增强骨髓基质细胞的增殖能力。

表1牦牛皮小分子肽对骨髓细胞周期的影响(n=6，)

注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。

②牦牛皮小分子肽对骨髓基细胞粘附力的影响：

取200mg/ml的牦牛皮小分子肽预先加入6孔板中预热，将单个骨髓细胞以以每孔2ml的体积培养于加药的6孔板中，分别于培养的第3天半量换液、第5天全量换液，在第4天时吸出培养液，pbs轻轻冲洗2次除去悬浮细胞，各孔加入细胞密度5×10⁵/ml正常小鼠制备的单个细胞悬液1ml，37℃、5%co2培养箱培养2h后，用培养液轻轻冲洗2次，收集并计数未粘附的骨髓细胞。

细胞粘附指活细胞内一些和细胞骨架有关的蛋白发生重组，从而使得细胞发生聚集形成细胞团或者组织的过程，反映了细胞在体外培养逐渐趋于稳定，对进一步的细胞增殖和运动具有重要的作用。

实验结果如表2所示，和空白对照组相比，牦牛皮小分子肽能显著增强骨髓基质细胞的黏附能力（p<0.01）。

表2牦牛皮小分子肽对骨髓细胞粘附力的影响(n=6,)

注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。

③牦牛皮小分子肽对骨髓基细胞迁移能力的影响：

取骨髓单核细胞悬液以每孔2ml的体积接种于做好标记的6孔板，加入200mg/ml的牦牛皮小分子肽，培养至80%的细胞贴壁，取出6孔板，用10μl枪头比着直尺，垂直于底面的横线横线划痕；用pbs缓冲液清洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；加入无血清培养基，置于co2培养箱培养24、48h时拍照，计算细胞迁移率。

细胞的迁移能力对活细胞至关重要，是在细胞黏附作用发挥的基础上，骨髓基质细胞黏附和迁移能力的增强意味着骨髓细胞增殖、分化、成熟的进程加快。

实验结果如图1所示，空白组在培养24h和48h后，划痕宽度几乎没有变化，细胞迁移能力弱，但各给药组在培养24h和48h后，划痕不同程度上都有变窄，尤其2组，划痕中迁移的细胞明显增多，2组在培养48h后，划痕愈合明显。

如表3所示，不同浓度牦牛皮小分子肽给药后，骨髓基质细胞培养24h和48h后迁移能力和空白对照组相比增强明显（p<0.01），说明牦牛皮小分子肽能增强骨髓基质细胞的迁移能力，迁移能力增加显著（p<0.01）。

表3牦牛皮小分子肽对骨髓细胞迁移能力的影响(n=6,)

注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01。

4、本发明方法简单，易于实施。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明牦牛皮小分子肽对骨髓细胞迁移能力的影响。

具体实施方式

实施例1一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，以275nm的辐射波长经紫外灯照射2.0小时，得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成3cm的块，沸水中提取30分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为10%的酶解液中，于45℃酶解8小时，过滤，得到滤液。

其中：质量浓度为10%的酶解液是指在1l去离子水中加入100g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指30g巯基蛋白酶、20g碱性蛋白酶、5g复合蛋白酶、35g链霉菌角质蛋白酶、10g酵母菌酶的混合物。

牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：5。

⑷滤液中加入其质量3%的活性炭，充分搅拌后煮沸40分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

⑸滤渣放入质量浓度为8%的酶解液中，于60℃酶解12小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为8%的酶解液是指在1l去离子水中加入80g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指3g菠萝蛋白酶、10g胃蛋白酶、30g胰蛋白酶、10g组织蛋白酶、7g木瓜蛋白酶、20g枯草杆菌蛋白酶的混合物。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：8。

⑹将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸40分钟，差速离心分离，先2000rpm离心5min，再10000rpm离心5min，得到上清液。

⑺上清液经孔径为0.01μm的超滤膜分离，截取分子量为10~20kda的牦牛皮小分子肽溶液，该牦牛皮小分子肽溶液于-15℃冷冻干燥4小时，即得。

实施例2一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮1厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，以200nm的辐射波长经紫外灯照射0.3小时，得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成1cm的块，沸水中提取5分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为1%的酶解液中，于30℃酶解0.5小时，过滤，得到滤液。

其中：质量浓度为1%的酶解液是指在1l去离子水中加入10g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指1g菠萝蛋白酶、0.5g胃蛋白酶、2g胰蛋白酶、2g组织蛋白酶、0.5g木瓜蛋白酶、4g枯草杆菌蛋白酶的混合物。

牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：15。

⑷滤液中加入其质量10%的活性炭，充分搅拌后煮沸5分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

⑸滤渣放入质量浓度为0.5%的酶解液中，于30℃酶解0.5小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为0.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入5g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指0.4g巯基蛋白酶、0.1g碱性蛋白酶、4g复合蛋白酶、0.3g链霉菌角质蛋白酶、0.2g酵母菌酶的混合物。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：20。

⑹将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸5分钟，差速离心分离，先3000rpm离心30min，再15000rpm离心20min，得到上清液。

⑺上清液经孔径为0.2μm的超滤膜分离，截取分子量为25~45kda的牦牛皮小分子肽溶液，该牦牛皮小分子肽溶液于-25℃冷冻干燥36小时，即得。

实施例3一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮1.5厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，以223nm的辐射波长经紫外灯照射1.0小时，得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成2cm的块，沸水中提取15分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为5%的酶解液中，于40℃酶解4小时，过滤，得到滤液。

其中：质量浓度为5%的酶解液是指在1l去离子水中加入50g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指15g枯草杆菌蛋白酶、25g巯基蛋白酶、10g碱性蛋白酶的混合物。

牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：10。

⑷滤液中加入其质量5%的活性炭，充分搅拌后煮沸20分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

⑸滤渣放入质量浓度为6%的酶解液中，于50℃酶解6小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为6%的酶解液是指在1l去离子水中加入60g复合蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：10。

⑹将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸30分钟，差速离心分离，先2500rpm离心15min，再13000rpm离心18min，得到上清液。

⑺上清液经孔径为0.05μm的超滤膜分离，截取分子量为10~45kda的牦牛皮小分子肽溶液，该牦牛皮小分子肽溶液于-50℃冷冻干燥24小时，即得。

实施例4一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，以245nm的辐射波长经紫外灯照射0.5小时，得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成3cm的块，沸水中提取10分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为4%的酶解液中，于45℃酶解7小时，过滤，得到滤液。

其中：质量浓度为4%的酶解液是指在1l去离子水中加入40g巯基蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：8。

⑷滤液中加入其质量8%的活性炭，充分搅拌后煮沸10分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

⑸滤渣放入质量浓度为7%的酶解液中，于60℃酶解8小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为7%的酶解液是指在1l去离子水中加入70g菠萝蛋白酶，混合均匀而得的溶液。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：15。

⑹将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸15分钟，差速离心分离，先2500rpm离心20min，再15000rpm离心5min，得到上清液。

⑺上清液经孔径为0.1μm的超滤膜分离，截取分子量为20~40kda的牦牛皮小分子肽溶液，该牦牛皮小分子肽溶液于-20℃冷冻干燥18小时，即得。

实施例5一种增强骨髓基质细胞能力的牦牛皮小分子肽制备方法，包括以下步骤：

⑴将新鲜带离皮2厘米毛的青藏高原牦牛皮清洗干净，以225nm的辐射波长经紫外灯照射1.5小时，得到辐照后的牦牛皮。

⑵辐照后的牦牛皮切割成1cm的块，沸水中提取25分钟后取出，用多刺板刺穿牦牛皮。

⑶将步骤⑵所得的牦牛皮放入质量浓度为5.5%的酶解液中，于40℃酶解0.5小时，过滤，得到滤液。

其中：质量浓度为5.5%的酶解液是指在1l去离子水中加入55g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指5g菠萝蛋白酶、0.6g链霉菌角质蛋白酶、25g酵母菌酶、1g胃蛋白酶、3g胰蛋白酶、0.4g组织蛋白酶、10g木瓜蛋白酶、10g枯草杆菌蛋白酶的混合物。

牦牛皮与酶解液的质量比（g/g）为1：13。

⑷滤液中加入其质量7.5%的活性炭，充分搅拌后煮沸10分钟，过滤，分别得到滤渣和第一次酶解溶液。

⑸滤渣放入质量浓度为4%的酶解液中，于55℃酶解12小时，过滤，得到第二次酶解溶液。

其中：质量浓度为4%的酶解液是指在1l去离子水中加入40g蛋白酶，混合均匀而得的溶液。蛋白酶是指12g巯基蛋白酶、22g碱性蛋白酶、6g复合蛋白酶的混合物。

滤渣与酶解液的质量比（g/g）为1：12。

⑹将第一次酶解溶液与第二次酶解溶液合并后煮沸20分钟，差速离心分离，先3000rpm离心5min，再10000rpm离心20min，得到上清液。

⑺上清液经孔径为0.01μm的超滤膜分离，截取分子量为10~40kda的牦牛皮小分子肽溶液，该牦牛皮小分子肽溶液于-35℃冷冻干燥30小时，即得。

上述实施例1~5中，蛋白酶还可以是菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、巯基蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、链霉菌角质蛋白酶、酵母菌酶中的一种或两种及以上的复合物。