一种具有抗菌活性的放线菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体的说是一种具有抗菌活性的放线菌及其应用。

背景技术：

植物病害一直是农业生产中存在的一个严重威胁，世纪全球气候变化给粮食作物带来严重的流行病害，对未来的粮食安全构成巨大的威胁。作物保护是确保农业可持续发展的一个重要手段。我国农用抗生素的研究起始于二十世纪50年代，相继成功开发井冈霉素、春雷霉素、灭瘟素、公主岭霉素、庆丰霉素、中生菌素等十多种农用抗生素，为我国农业作物病虫害的防治及农作物的丰产提供了强有力保障。对于造成全球粮食和其他作物的严重减产的植物病害来说，杀菌剂仍是防治植物病害的首要选择。但是，合成农药给环境及人类健康带来了一定的安全隐患，因此，农业的可持续发展需要一种新的、安全的植物病害防治措施来实现。在这一大环境下，人们对以微生物为基础的制剂或这类制剂与化学药品结合制成生物防治剂来防治植物病害越来越感兴趣。

放线菌是一种革兰氏阳性菌，其次级代谢产物结构多样并且具有广泛的生物活性，是酶制剂、有机酸等多种活性物质的主要产生者，是新颖生物活性次生代谢产物的重要来源，所产次生代谢产物涉及生物碱、蒽醌、内酯、黄酮及酚等。其代谢产物其中许多已广泛应用在医药、农业和畜牧业中并体现出重要价值。

海洋中的微生物为了适应诸如低温、高盐、高压、无光等各种极端条件，其生长特性、营养需求、繁殖规律、细胞结构、膜结构、蛋白及酶的结构、核酸结构、基因表达调控等均与普通环境中的微生物有着巨大的差异。生存于海洋这种特殊生境的放线菌，经过长期的进化选择，必然具有特殊的代谢类型，从而合成结构新颖、独特、生物活性广泛的次生代谢产物，这必然将极大地提高新颖生物活性化合物的发现几率，是发现具有生物活性的新结构天然产物的宝藏。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性的放线菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种具有抗菌活性的放线菌，放线菌为糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044，已于2019年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为cgmccno：17274。

所述糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044为革兰氏阳性菌，通过下述方法分离得到：将海洋沉积物样品置于通风处自然风干，然后用无菌研钵研成粉末，称取1g土样加入到99ml无菌水中，水浴37℃，温育15min，采用梯度稀释涂布法使其终浓度为10^-3g/ml、10^-4g/ml，取0.2ml涂布于分离培养基上，培养4周。该菌株气生菌丝发达，在isp2、isp4、高氏一号及r2a培养基上生长良好。生长温度范围为10-37℃,最适生长温度为28℃，ph生长范围为6.0-11.0，最适ph为7.2，盐浓度（nacl）生长范围为0-5%。菌株全细胞壁氨基酸dap类型主要组分为meso-dap；全细胞水解产物主要包括半乳糖和阿拉伯糖；极性脂主要由双磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰甘油(pg)等组成；甲基萘醌主要为mk-9(h4)；主要脂肪酸为iso-c15:0,iso-c16:0,iso-c17:0,anteiso-c17:0和c17:0,基因组dna(g+c)含量为70.6mol%，在发酵培养基中产生具有抗革兰氏阳性菌及真菌等多种活性化合物。该菌株16srrna基因序列与最近有效菌株saccharopolysporagloriosaeyim60513^t(eu005371)的相似率为98.11%，且在进化树上成独立分支，为潜在新菌种。

一种具有抗菌活性的放线菌的应用，所述菌株在防治真菌中的应用。

所述真菌为草莓灰霉病菌、芦笋茎枯病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌或水稻稻瘟病菌。

一种菌剂，菌剂含所述糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044。

所述糖多孢菌为该菌株的培养物、培养浓缩物、培养菌悬液、发酵菌丝体或发酵分离上清液。

一种菌剂的应用，所述菌剂在防治真菌中的应用。

所述真菌为草莓灰霉病菌、芦笋茎枯病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌或水稻稻瘟病菌。

本发明所具有的优点：

本发明糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044分离自海洋沉积物中，对草莓灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、芦笋茎枯病菌、水稻稻瘟病菌等均有较好的抑菌活性，表明该菌在生物农药、微生物制剂及其他抗菌相关领域具有较好的开发应用前景。

附图说明：

图1是本发明实施例提到的糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044于isp2培养一周后的照片。

图2是本发明实施例提到的糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的抑菌圈活性照片。

图3是本发明实施例提到的基于16srrna基因序列构建的菌株saccharopolysporasp.mg16044与其邻近糖多孢菌属菌株的系统进化树。

具体实施方法

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1：糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的筛选和分离及鉴定

将海洋沉积物置于通风处自然风干，然后用无菌研钵研成粉末，称取上述粉碎的土样1g加入到99ml无菌水中，水浴37℃，温育15min；采用梯度稀释涂布法使其终浓度为10^-3、10^-4g/ml，取0.2ml涂布于分离培养基上，28℃恒温培养4-8周。

分离培养基：蛋白胨5g，酵母提取物1g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.9g，硫酸镁3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸氢钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34g，硼酸22g，硅酸钠4g，氟化钠2.4g，硝酸铵1.6g，磷酸二钠8g，琼脂20g，海水和蒸馏水各500ml，ph7.8。121℃高温高压灭菌20min。

根据上述于分离培养基中形成的菌落形态特征和生长特性，挑取单菌落，以isp2培养基作为纯化培养基进行菌株的分离纯化，将纯化得到的菌株接种于isp2斜面培养基，置于4℃保存。同时，以15%甘油作为保护剂，-80℃保藏。

实施例2：糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的生长特性

将上述筛选获得菌株接种在isp2培养基上，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、28℃、32℃、37℃、42℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次；

再将上述筛选获得菌株接种在含有不同浓度nacl（不同浓度的nacl依次为0%，3%，5%，8%，10%，15%）的isp2培养基内，37℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次；

另，再将上述筛选获得菌株接种在含有不同缓冲液（不同缓冲液为：phbuffer：ph5.0-5.5：0.1m柠檬酸-0.1m柠檬酸钠；ph6.0-8.0：10mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸-0.5mnaoh；ph8.5-11.5：0.5mnahco3-0.5mna2co3）的isp2培养基中，并以空白培养基作阴性对照，37℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。

结果表明：菌株生长温度范围为10-37℃，最适生长温度为28℃，ph生长范围为6.0-11.0，最适ph为7.2，盐浓度（nacl）生长范围为0-5%。

实施例3：糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的化学组分分析

（1）全细胞壁氨基酸分析：取适量菌体，装入硬质安瓿管中，用无水乙醇浸泡24h，弃去乙醇，凉干；加入6nhcl0.2ml，封口，120℃水解12h左右；取1μl水解液点样，标准品dap(同时含有l，l-dap、meso-dap和d，d-dap)0.2μl同板点样，展层系统为甲醇：吡啶：冰乙酸：水=10：1：0.25：5（v/v）。上行法展层2次；0.4%茚三酮丙酮溶液显色，100-110℃加热2-3min。

（2）全细胞水解液糖分析：菌体水解加入0.5nhcl，封口，120℃水解15min；取1μl水解液点样，标准品含鼠李糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖各1%，马杜拉糖单独配制存放在-20℃冰箱中；展层系统为乙酸乙酯：吡啶：冰乙酸：水=8：5：1：1.5（v/v）。上层法2次层析；显色剂为苯胺邻苯二甲酸，120℃加热3-4min。

（3）磷酸类脂分析：称取100mg冻干菌体放入1ml的0.3%nacl研磨10min，用10ml甲醇将磨碎的菌体洗入到50ml的耐有机溶剂螺口离心管中；沸水浴加热5min，再加入3ml0.3%nacl溶液和5ml氯仿；4000rpm离心5min弃去细胞残渣和上层水相，收集氯仿层；加入5ml0.3%nacl溶液和5ml氯仿；4000rpm离心5min，收集氯仿层；45℃减压蒸馏，干燥物即为磷酸类脂；将干燥的极性脂重新溶于约0.1ml氯仿/甲醇（2：1，v/v）中，备用；采用双向展开法：第一向展层剂（氯仿:甲醇:水＝65:25:4（v/v））层析约25min；第二向展层剂（氯仿：甲醇：冰醋酸：水＝80：12：15：4（v/v）)层析约30min，晾干后用dragendorff试剂、ninhydrin试剂、anisaldehyde试剂、dittmerandlester试剂显色。

（4）甲基萘醌（mk）的测定：用高效液相色谱分析法测定甲基萘醌。液相柱为十八烷基硅烷（zorbaxeclipsexdb-c185μm，250×4.6mmid），流动相为甲醇：异丙醇=2:1溶液，流速为1.00ml/min，柱温为40℃，249nm、270nm和330nm紫外检测。根据标准条件下不同甲基萘醌组分与洗脱时间的关系，结合标准菌株的校正值，分析实验菌株的甲基萘醌。

（5）脂肪酸组分分析：采用气相色谱测定脂肪酸组分。色谱柱为ultra-2柱，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，5℃/min升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100：1，进样量2μl；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气流速30ml/min。

结果表明：糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044全细胞壁氨基酸dap类型主要组分为meso-dap；全细胞水解产物主要包括半乳糖和阿拉伯糖；极性脂主要由双磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰甘油(pg)等组成；甲基萘醌主要为mk-9(h4)；主要脂肪酸为iso-c15:0,iso-c16:0,iso-c17:0,anteiso-c17:0和c17:0。

实施例4：糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的系统发育分析

菌株总dna的提取：取适量菌体转移至eppendorf管中，加入5%的chelex100溶液20μl，涡旋振荡混匀；100℃水浴10min，立即冰浴1min；12000r/min离心10min，取上清液作为dna模版，-20℃保存备用。

16srrna的基因pcr扩增中所使用的引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，其序列为：27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′；1492r：5′-tacggctaccttgttacgactt-3′。pcr反应采用50ul的体系，pcr产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定。根据测序结果，将16srrna序列登陆数据库ezbiocloud中进行blast比对，得到序列相似性比对结果。对于需要进行系统进化分析的菌株，选取相关菌株的16srrna基因序列，用clustalx(version1.83)进行多序列比对，mega4.0进行数据分析，重复1000次并采用neighbor-joining法进行系统进化树的构建。

结果表明：菌株16srrna基因序列与最近有效菌株saccharopolysporagloriosaeyim60513^t(eu005371)的相似率为98.11%，且在进化树上成独立分支，为潜在新菌种。

实施例5：糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的抗菌活性。

将上述筛选生长良好的糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044接种于含100mlisp2培养基的500ml三角瓶中，180rpm旋转摇床，28℃培养7d；将上述获得发酵液在4500rpm离心20min，将菌丝体与发酵液分开，以1:1体积比将发酵液经乙酸乙酯萃取，合并后蒸干；将蒸干后的粗提物用甲醇溶解在5ml的螺口瓶中，低温保存备用。

检定菌分别在pda斜面培养基上37℃生长3-5天，直到至菌丝覆盖整个斜面。从上述各真菌的斜面上刮取尽量多的菌体，使用磨菌器将菌丝分别磨碎，而后于5ml无菌水中得到不同待检定菌的菌悬液。将菌悬液分别以1%的量加入融化并冷却至40℃左右的bhi培养基中，摇匀后迅速倒入已经含有相应固体培养基作为底层的9cm培养皿中。

吸取甲醇溶解的粗提物60μl，分2次加到直径为5mm的圆形无菌滤纸片上，待甲醇挥干后，贴于含有指示菌的检定平板上，同时以甲醇为阴性对照，以双抗（1000unit/ml青霉素和1000mg/ml链霉素）作为阳性对照，细菌于37℃培养12h、真菌37℃培养48h，观察并记录抑菌圈的大小。

结果表明，糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044对草莓灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、水稻纹枯病菌、芦笋茎枯病菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌等均有较好的抑菌活性，表明该菌在生物农药、微生物制剂及其他抗菌相关领域具有较好的开发应用前景。

表1糖多孢菌saccharopolysporasp.mg16044的抑菌活性