一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物RT-qPCR检测试剂盒与检测方法与流程

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物rt-qpcr的检测试剂盒与检测方法。

背景技术：

莲藕(nelumbonucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，有三千多年的栽培历史，生产上可分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕富含淀粉、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，是我国南方地区的主要水生蔬菜，其栽培面积近40余万hm²。

甘薯潜隐病毒(sweetpotatolatentvirus，splv)属于属于马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属(potyvirus)，是1979年在中国台湾的甘薯上首次发现的，其介体昆虫为蚜虫，可随薯苗营养繁殖体及薯块传播。甘薯潜隐病毒具有变种和多样性(比如甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweetpotatolatentvirus-lotus，splv-lotus)，是本实验室前期在莲藕中发现的一种甘薯潜隐病毒新型分离物)。江苏省莲藕主产区splv-lotus感染越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势，因此脱毒莲藕种苗的应用迫在眉睫。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明目的在于提供一种用于甘薯潜隐病毒莲藕分离物rt-qpcr检测试剂盒与检测方法，具体为脱毒莲藕种苗检测的高灵敏度实时荧光定量检测试剂盒，以及该试剂盒的制备方法及检测方法。

甘薯潜隐病毒莲藕分离物(sweetpotatolatentvirus-lotus，splv-lotus)，是本实验室前期在莲藕中发现的一种甘薯潜隐病毒新型分离物。该分离物与splv甘薯分离物具有很大的遗传差异，核苷酸相似性在76.28％-76.60％之间，与最新的国际病毒分类委员会(internationalcommitteeontaxonomyofviruses，ictv)制定的马铃薯y病毒科病毒的分种标准相同，且该分离物与splv甘薯分离物有四个蛋白酶水解切隔识别位点存在差异，其编码的pipo的长度差异较大。splv-lotus自然条件下能够侵染莲藕，并且能有效侵染豆科、藜科、葫芦科、茄科植物，但未见明显的症状表现。2016年，我们在江苏省莲藕产区首次发现splv-lotus，后续调查发现，splv-lotus在江苏省莲藕主产区发生越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势，因此脱毒莲藕种苗的应用迫在眉睫，但目前已有的splv-lotus的rt-pcr检测技术不能满足脱毒莲藕种苗的检测精度。因此，亟需发展splv-lotus的精确检测鉴定技术。rt-qpcr检测方法以其灵敏度高、特异性好等特点受到青睐，在植物病毒检测特别是脱毒苗木病毒检测中应用越来越广泛。本发明即是开发一种能够高灵敏度检测splv-lotus的rt-qpcr检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物rt-qpcr检测试剂盒，其特征在于，包括2条针对splv-lotuscp基因设计的特异性引物：

qsplv-lotus-f：5’-tggaacactatctagcagcgattatgg-3’；

qsplv-lotus-r：5’-gttgcggatggttgacctgtctc-3’。

所述试剂盒还包括m-mlv反转录酶、m-mlv酶反应缓冲液、dntps、sybrgreendna聚合酶、mg²⁺、pcr反应缓冲液。

所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物splv-lotus实时荧光定量的检测方法，其包括以下步骤：(1)采用多糖多酚植物组织的裂解法提取待测样品总rna；

(2)设计并合成引物；引物包括

qsplv-lotus-f：5’-tggaacactatctagcagcgattatgg-3’；

qsplv-lotus-r：5’-gttgcggatggttgacctgtctc-3’；

(3)实时荧光定量pcr。

步骤(3)的pcr反应体系中，qsplv-lotus-f、qsplv-lotus-r的浓度分别优选为10μmol/l。优化引物浓度步骤：以splv-lotus质粒标准品为模板，控制引物浓度分别为100μmol/l、10μmol/l、5μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l。

步骤(3)的pcr反应条件中，退火温度优选为60.1℃。

其中，步骤(3)具体为：逆转录和pcr

①反转录合成cdna

以莲藕总rna为模板，以qsplv-lotus-r引物，通过反转录酶合成cdna；

②pcr扩增

以cdna为模板，以qsplv-lotus-r和qsplv-lotus-f为引物，进行pcr反应。

本发明还提供甘薯潜隐病毒莲藕分离物rt-qpcr检测试剂盒在莲藕脱毒苗检测中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明方法与常规rt-pcr相比，提升检测甘薯潜隐病毒莲藕分离物灵敏度100倍，适合脱毒莲藕种苗的检测。本发明在分子水平上为甘薯潜隐病毒莲藕分离物的检测提供了一种快速、灵敏的试剂盒和检测方法，也为莲藕脱毒苗的制备提供了有效的检测方法。

附图说明

图1不同splv-lotus质粒浓度的常规pcr电泳图，1-9：7×10⁹-7×10¹拷贝·μl^-1；

图2不同splv-lotus质粒浓度的real-timepcr扩增曲线，1-9：7×10⁹-7×10¹拷贝·μl^-1。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

(1)引物设计与合成

根据splv-lotus基因组序列(seqidno.3)，设计并合成荧光定量检测引物qsplv-lotus-f(5’-tggaacacatctagcagcgattatgg-3’)和qsplv-lotus-r(5’-gttgcggatggttgacctgtctc-3’)。

以上序列分别为seqidno.1和2。

(2)总rna提取

采用多糖多酚植物组织裂解法进行待测样品(莲藕脱毒苗)的总rna提取。

(3)优化引物浓度

以splv-lotus质粒标准品(带有splv-lotus基因组序列的质粒)为模板，控制引物浓度(指单个引物的浓度，qsplv-lotus-f、qsplv-lotus-r)分别为100μmol/l、10μmol/l、5μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l。

(4)实时荧光定量rt-pcr

①反转录合成cdna

以莲藕总rna为模板，以qsplv-lotus-r引物，通过反转录酶为mlv，合成cdna，反转录体系为表1所示：

表1反转录体系

轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；

②pcr扩增

pcr反应体系如下表2：

表2pcr反应体系

两步法pcr扩增标准程序(表3)：

表3pcr反应程序

结果发现各引物浓度在10μmol/l时荧光强度最高，ct值最小，因此确定10μmol/l为该体系引物终浓度。

(5)退火温度优化

在优化的引物浓度下观察退火温度在54～64℃下对荧光信号的影响。退火温度在60.1℃时荧光值最高，ct值最小，且熔解曲线为单一峰，因此确定该体系的退火温度为60.1℃。

(6)灵敏度检验

分别以10倍稀释的7×10¹-7×10⁹拷贝·μl^-1的splv-lotus质粒标准品为模板，平行进行实时荧光定量rt-pcr和普通rt-pcr。试验结果显示，实时荧光定量pcr能够检测到7×10¹拷贝·μl^-1质粒浓度，而普通pcr只能检测到7×10³拷贝·μl^-1的质粒浓度，说明实时荧光定量pcr的灵敏度是普通pcr的100倍(图1、图2)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员对之可作一些修改或改进。但是，在不偏离本发明内涵的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物rt-qpcr检测试剂盒与检测方法

<130>xhx2019062601

<141>2019-06-26

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggaacactatctagcagcgattatgg27

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gttgcggatggttgacctgtctc23

<210>3

<211>10081

<212>dna

<213>sweetpotatolatentvirus-lotus

<400>3

aaattaacaaaactcaatacaacaacagaagaattaagcaaacaaaaccaatttctaatt60

atcataaacaagtgaattctcggttctcgaacaagttcagactcttcataattccatcat120

atataattatcacaattattacgatggcagctgttatctttggatcttttactgaaactc180

cagttctgttagactcggctaagataactcctacaatcacgcggaagcgattcgttgagg240

agcgtatcatagtacgcgagaagaaagtttatggaaagtgtggagtttgtggcgatgaga300

tgccaacgaagtccatgctacgcaagcatcttgcgttaaagtgtgactatctggcactat360

cctcatcccttgagtatgaggatgttgagaaaatcatcactaaggtggttgaggaggaag420

tcccattttatgatttcacgtggctccaacatcgcgtgttggacaaaccagctatcgatg480

ttggtaagatcaatacagcgatcatgccagcttttggcaccatggaagttattgaatcac540

agcagcaggattttattgaaattgacactggtgtgattataaagcccaaagaatcttgtg600

tatatcggggaccaccagtgttcccaatattggcaactaaggtggacaagcgaactaaaa660

tattagctcacaatcttactagtgctgcaaagaacataatatctgaatatgatgctaggc720

ttgagaaggcatttgcaacgcttgatgtggttgtgcaaaaagatgcggacaggaaagcta780

ctatgaaggtagtgaagaagcgcaatggaacatgcatatttaggccctataatactaggg840

actatctgaagatgcgtaggaaggagagagctgcagcagcaaatgtggcatttgctaaac900

aggccccacacgttatcatcaagttgtcaatggctggtgggcccacaccatcagcgatgg960

atcatgagatggctaccaaacgacctcttaataaaacgcctagcatgaagaggcgatgtg1020

tctgtaagcgtgtgacaatggaagaaggaaaaatcgaggatctcatacatacgattggga1080

ggatagcttcaaagaatcaccttcggttcgaaattgtggccgggggaaaacctacgactg1140

gtaggtttaagcaatttaatggaaataaccatatgtttcttgatcttaagcatatgaaag1200

gcctaaggaggcgaatagacgttagtcttagtgatgcaaaccagcagatcactacaaagc1260

tggccaaagctgtgaattatgaacgaagatttgatactacgcatttttcatatggatcta1320

gtggattagttattaatccatttaaatccgttggaagaatgggtagggcaagaggagagg1380

tattcatagtgagagggcggcatgaaggaaagctatatgatgcgcgtcaaaaggtcactg1440

aatctgtcatgttacatatgatgcattatgcagacacagcccaaaagttttggagaggtt1500

ttgaaaaagtgttcctctcgaataggccagaagaaagatcacatacttgtgtggcagatt1560

tggatgttggtaagtgtggagaaattgcagcactaacatgtcaagcgatacaaccatgtg1620

ttaaaattacgtgtacgcaatgtttcacacacttaaatggattaagcgacagagcttata1680

gggagttattaaagagccaagttttgaagatagcacctcaaattcgtgcacattacccag1740

aattcgcatttatggctgaatttattgagaaatttgggcgaacagcgacattagctaatg1800

ataattataatgcgttctcggaaagtcgccgcttaattggtgataggaatgaacaaccat1860

tctcatcacttaataagttaaataactacctcataaagggtgggaatttaacaagcgatg1920

aattctcagatgcatctgattgtcttagagagctggtgcgataccataataatagaacgg1980

agaacataaagaagggctccttggaacaatttcgtaataaagtctcccagagaagtcatt2040

tcaatgcatcactcatgtgtgataatcaacttgataaaaatggtaatttcatatggggtg2100

agaggggatatcatgcaaaacgattcttcgccaattattttgatatagttgagccaaaag2160

atgggtacacaaagtatatccatcgcaaaaatcctaatggaagtcgtgaactcgccatta2220

ataacctcatagtctccacgaactttgaaagaatgagggaattaatggaaggcatacctg2280

tgaagaagcacccgttatccaagcagtgtgtgagtatgcgaaatgggaattttgtttatg2340

tgtgctcctgtgtaacattaaatgatggacagccccaagagtctgatttgaagctgccaa2400

cgcgtaatcacttggtgattggaaatgcaggagatcctaaatatgttgatttaccaacag2460

aagtgagtgaaaaactatatattgcaaaggagggtttctgctacataaacatcttcctgg2520

ccatgttagtaaatgtgagagagtcagaggctaaggatttcacgaaaagagtgcgagata2580

tagtagtccaaaaattaggaaaatggccaacaatgatagatgtagctacagcatgttgtt2640

tgctcgctgtatttcatccagaagtgcaagatgctgaattgccacgaatcctaattgatc2700

acaccaccaagacaatgcatgtgattgattcttatggttcaaagaacactgggtatcaca2760

ttctgaaggctaatacagttagtcagctaatgcaatttgccagcgattcacttgattctg2820

agatgaaattctatgttgtgggtggacatgcgcacacttcatcctttgagagaacttcaa2880

tcacaaccataattaagggtgtatataaaccagctgtcatgcgagagatccttgatacgg2940

atccgtatttgctactgatggctatcttgtctccgactgtgctcagagcactacacacta3000

gtggatcacttgagcgagctcttgaatattggataagtagtgaccaagatgtggtaacaa3060

ttataacactggtgaagactttagcacaaaaagtatcagttgcaagaaccttaaccacgc3120

aaatgcaagtcgtgcaggattatgctacggagctaacgggctacgttcaccaaacaaagc3180

gagtatcgatagcagcagttgtggcattccgtacgcttcagcatctgagtaataagcgca3240

gcgctgatggaatattgacacaacaagggtttcaaaacacagtggagcgcgagactcttg3300

aagcccttgagaaaaaatatgcgtgggagctaaagcagcagtggaacgctttaagcttgt3360

gtcaaaaatgttactacacactacagtatatgaagcaatgcaggcgatcacacgagtctg3420

tagccagcgtgcgcaccacagagcgcgtagaggcctttatcgcatatccatctcagtgtt3480

tggggagtgcaattgcaatcgcaaggcagtctaaggagcgaattcaaagtgcattcgtgg3540

aaggcaaactcaaaataaagctctttttgtttgataaagcactaactgttatgcgatttg3600

gaataccagatgtggtaaggttggctaatatccttattgtgattactatactgtatggag3660

tctcatccagattgcggcgtctattgcaagatcacctcaaataccgtgcgttatacatgc3720

aagagactgatgataaggattttgccaggttgcaggatatatatgtggagtgtattggta3780

cggatggaactctaccaacagttggggagtttttaaaagctgtcaatattaaagcaccag3840

aattaaatgagtatgcgttggaaacaactgcatttgctagtgataatgttgtgcatcagg3900

cgaagagcccaaccgaggcaaaatatgagaggatcatagcaatggttgctttgtttatga3960

tggcctttgatacagagaggagtgattgtgtgtataagattctgaacaagctgagaacac4020

tcacgaacattgcgcaacaagatgtgcatcatcaaagtttggatgatatcaaagatgagt4080

ttagtgaaaaacagatgactattgattttgaacttgattcagatacacaaagtccaagtt4140

ctttaacggatgtgacatttgccaaatggtggtcaaaccaactggcaatgaacaatgtta4200

ttccacactacaggactgagggtcattttatggagttcacacgagcaaatgcctctgcag4260

tagctcatgagatcgccataggacagcataatgacattttaattagaggtgcagttggat4320

ctggaaagtcgacgggtttgccatttaatttgatgcgcaagggagcagtattgttaatag4380

aacccacaaggccactagcagagaatgtgtgcaaacagctgagaggagatccttttaatt4440

tgagtccaacacttaaaatgcggggattatcagtatttggttccagcccaatcacaataa4500

tgacaagtgggtatgcattacattaccttgcgaataatgtacattgtatagccaattatc4560

aatttattatctttgacgagtgtcatgtaaatgacgcagcagctatggcttttagatgct4620

tgctacatggacatgcattcgctggaaagattctcaaagtgtcagcaacaccaccaggtc4680

gagaggttgaattcaccacacagcatccagtgaaagttttagttgaggaatcaatttcat4740

ttaatgactttgttgctgcacaaggaacaggacaaaatgctgatgtgattgtgaggggtg4800

acaatatattggtgtatgtagctagttataatgaagttgatattctaagtaagctcttac4860

tggaacgtggttacagagttaccaaggtggacggtcgaacaatgaaagttggtagtgtag4920

agatagcgacctatggaacgagcaaacaaaaacacttcatagtcgcaacaaacataattg4980

agaatggagtaactcttgacattgatgttgtggtcgattttggcagaaaagtctccccgt5040

cacttgacacggattgccgtcagattatagcaggacaagtgccaattacatacggtgagc5100

gcatacagagattaggacgcgtgggcagagtgaaacctggatgtgcgcttagaatcggat5160

ggacggaaaaagggcttgttgatatacctgcgttagtagccactgaagctgcgttgttgt5220

gtttcacttatggtttgccagttatgacacacaacgtatccaccgctcttcttagtggtt5280

gtacagtgagacaagcaagaacgatgcaacactttgaactctcaccatatttcacagtag5340

accttgtgcgtcatgatggcacaatgcacccaatgatacatggattactgaagaagtata5400

aactcagggactcagaaataagtcttaacaagatggcgctaccagtgggacaatcaacaa5460

ggtggatgacagtccgagagtacaacagatgcacacgtgctatgagtcttgatgaagata5520

taagaatacccttcctaatgaacggaataccagaaacactatatagtgaactctgggcga5580

ctattcagaagtataggggtgatgttggctttggacgactcacaagcagtagtgcgggaa5640

aaatagcatacacactcaaaactgactttgcagctcttccacggacagttaagataattg5700

aagagttaatagaaggtgagatggcaaagcaagagtatttcaggagtgtttctgcaaatg5760

cttgctcatcatctaatatttctctcgctagtgcactgaatgcgataaaagcacggtatg5820

caaaggatcatactgctgagaacatagccgtactacaggctgcaaaggcccaaatcattg5880

agcttagaaatcttgatcttgatggatcttttatgtcgatgggtaatcgagcagttgagt5940

cttatgtcaaggaatatagtgcatccagttgtgtagaacaccaaagtaaagagggcgtta6000

tcaaacacctcaaattgaaagacatttggaataaaagtctaatcacgcaagatattgtgg6060

tgatgggtggcgtctttcttggaggtttgtatctgatccatgagtcttttaaagatggaa6120

tgagcactaaggtcacgcaccagggctataacaagaggcaaaggcagaagcttaaatttc6180

gagatacttgtgatcagaagcttggtagagaagtgtatggtgatgacggaacaatagagc6240

attattttggaacagcatacactaagaagggaaagactaaaggcactaagagagggatgg6300

gagcaaagaatagacgttttacgaatatgtatggatatgatccatcagattattcctttg6360

tgcgattcgtagatcctcttactggccacacactagatgaaaacatatatgctgatattg6420

aattggtgcaggagcactttggggaagtgagacgtgcgtatatggcggaggacaagttgg6480

aaccacaaaagatcatgagcatgcctggtattcaagcatattatatgagcaacgctgcag6540

acaaggcactgagagttgacatgacacctcacaacccgtttaaggtgtgtgatgcaacta6600

ataccattgcaggattcccagaacaggaggctattttaagacaaactggtaagcccgaga6660

tgataaagagctctgaagtacctacaattaatgaatacactcaagacacagtcattcatg6720

agagcaaatcattgtttagaggcttgagggactacaatccaatcgctagtaccatttgcc6780

aaatcacgaatgactctgacggccatagtagttctacttatggtatcggatatgggtgta6840

taatcattgcaaaccagcatttattcaaacgtaataatggcacactaatgatcaaatcaa6900

gagctggtgagtttcgaattcaaaactctacaactttaaagatgaagccatgtgtaggga6960

gagatgtgattctgttgcagatgccgaaagattttccaccattcccacggagactgaagt7020

ttaggcaacctgctaaaggtgagaggatatgtatggtaggttcgaactttcaggagaaga7080

gtatatctagtgttatatcagaaagcagtgttatacaccctgtggatggcactcattttt7140

ggaagcactggatagatacaaaggacgggcaatgtggtttaccaatagttagcacgaagg7200

acggttccatactgggcatacatagtctagcaggctcttcaaatactaccaacttcttta7260

cagactttccagagggctttgtggaagagtttttagagaatgcacataatctggactgga7320

caaaagcttggaaatacaatcctgttggagttttgtggggttcacttaaattaacagaca7380

gtcaacctgagccaattttcaaagctcaaaagctcatatccgacctcaattcgatgcaag7440

tctacgcacaatcttatgatggaaagtggctattctcagcattgaacggaaatctgaaag7500

ctgttggtgagagtccatcacaattggtcacgaagcatgtggttaaaggaaaatgcccta7560

tgtttgaattatatctccaaactgatgaggtagcccgggagtattttcaaccattgatgg7620

gtgcttaccagaaaagcatgttaaataaagaagcatataaaaaggatctcttcaaatatg7680

ctgaagtgacggatgtcggacttgttaattgccaaatttttgagagggcacttggatctg7740

tcattaatctccttgagcggaaccagtttggaacttgtgtgtacatcactgatgaaaacg7800

aaattattgattcattaaatatgaaagcggctgttggtgctttgtacacagggaagaaga7860

aagagtattttaatgagatgagccaagaggagcgtgaaaatatattgcgtgctagttgtt7920

tgaggctgtatacaggaaagcttggtgtttggaatggttcactcaaggcagaattgcggc7980

ctttggagaaagtgcaagcgaataaaacgcgaacattcactgccgcgccattagatacgc8040

tactcgctgggaaagtttgtgtggatgcatttaacaacagattctatgacttgcacattc8100

aatgcccatggagtgttgggatgaccaagttttatggggggtggaatgagctactgacag8160

cattgcccgatggttggagatactgtgatgctgatggatctcaatttgatagttctcttt8220

caccatatttaataaacgcagttttacaactgcgtttgcatttcatggaggattgggata8280

taggtgaacaaatgctgaaaaatttatatacggagattgtctacactccgatcttgacac8340

ctcatggtacaattgtcaaaaagcacaaaggaaacaacagcggacaaccttctactgtcg8400

tggataatacattgatggttatactggctatgtattattcattgcatgcagaaggctact8460

cagctgaatatgctgaaagtgtttgtaagttctttgtgaatggagatgatttactaatcg8520

cagtacacccgcaacatgagtctatcttggataaactgcagacacacttcaagtgcttgg8580

gattgaagtacacatttgataatagacatgatgataaaacatctctctggtttatgtcgc8640

accaaggaatcaaaagggatggaatttttattcctaaactggaaaaggaacgaattgtat8700

caatccttgagtgggacagatcaagagaaccaatccatcgaatggaggcaatatgtgctg8760

caatggtcgaggcatggggctatgatgacttggtgtatgagatcagaaaattctataagt8820

ggatgttggagcaagctccgtactcagatcttgcgaagaatggaggagcaccatacattg8880

ctgaagtcgcgctgagaagactatacacatctattataccggaacagtctgaattggaac8940

aatatctagcagcgattatggaggaaccagattttgatgaagaagaaattggtgttcatc9000

atcaagctgctgacgatgaactagatgctggtaagatgaatgtaaagaaacaacaaggaa9060

ctggcgaggcaggtcaaccatccgcaacaccaccacagtcaaatgctaaggacaaaggca9120

aagaggttgtatcagcacaagggagtgggatcatcaataaaccagagctggaccgagata9180

taaatactggtacaattggaacatttcaggtacctcggttgcgtgcgatacccacaaaga9240

tccgactaccaataattaagtccggagcagcacttaatctcgatcatttgttagtttata9300

agccctctcaacttgacattacaaacgctaaatccacaagggatcagtttagccaatggt9360

atgaaggagtgaagaatgcttatgaagtagatgaccaacagatgtcaatactaatgaatg9420

ggctagtggtatggtgcatcgagaatggaacatccccgaatataaatggtgattgggtga9480

tgatggatggagacacacagatttcatatccaatcaaaccactgatagattttgcggcac9540

caacatttcgacaaatcatgaaacattttagtgatgtcgcagaggcctacatacagatgc9600

gtaatgcagaacaaccgtacatgccaaggtacggtttacagcgtaacttgacagacatgt9660

ccttggcacgatatgctttcgatttctatgaagttacatcaaggacacctattcgtgcca9720

aggaagctcactttcagatgaaagctgcagcacttacaaatacacatcatcggctgttcg9780

gtttggatggaaatgtctcaactaatcaagagaatactgaacggcataccgcaactgatg9840

tggatcggaacatacacacactacttggaatgcgtggcattcattagtgtgtatgcttat9900

ctataaagttatttatatttatgtatgtatgttcgtcgaaggggaatctacttgtggagc9960

gttgtgagggtgtccctcgagtgaaacatttagtgtgatcctttccgttatatttcaaga10020

aatttatgatattagtgaggcactgcctccattcataaactttttgctttataccagaga10080

c10081