一种水环境中微生物的检测方法与流程

本发明涉及一种水环境中微生物的检测方法，属于微生物技术领域。

背景技术：

水体是一种很好的溶剂，溶解有氮、磷、硫等无机营养物和以各种形式进入水中的有机物，总体上看，虽然水体中各种营养物质的含量不及土壤丰富，但基本能满足微生物生长发育的需要；各种水体的温度有较大差异，并随季节有较大的变化；不同水体的ph范围在3.7～10.5，大多数ph6.5～8.5，适宜大部分微生物生长，而在一些酸性和碱性水体中也有相应的微生物类群生长。此外，由于氧在水中的溶解度较小，容易被微生物耗尽，因此，水中生物的生存具有很大的威胁。

现有的微生物检测方法有：血球计数法、染色计数法、平板菌落计数法、生理指标法、液体稀释法和固体平板扩散法等。现有的这些技术存在的问题是操作过程较为复杂、需要复杂的仪器、时间长、灵敏度不高等。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种指示剂，是以蛋白质粉和玉米浆为原料，经红花染料染色后获得。

在本发明的一种实施方式中，所述红花染料的制备方法为：将100g红花加入50g水，搅碎榨汁，获得60g溶液；采用公开号为cn104087009b公开的提取方法制备红花红色素，具体步骤为：加入微晶纤维素，用醋酸调节ph至3.0-5.0，搅拌30分钟，室温静置2小时，过滤，得到干净的吸附了红花红色素的微晶纤维素；用碳酸钾溶液浸泡微晶纤维素，室温搅拌15分钟，抽滤，收集滤液；滤液加入柠檬酸调节ph至3.0-5.0，5℃下放置10-12小时，虹吸移去上清液，将沉淀于-20℃下冷冻干燥，即得到红花红色素。

在本发明的一种实施方式中，所述玉米浆按如下步骤制备：按料液比4～7:1将玉米粒磨为玉米浆，先在40-60℃浓缩，得到浓缩量为40-50％的玉米浆料，再于80-90℃下干燥至含水量为20-30％，在90-100℃烘干至完全干燥。

在本发明的一种实施方式中，将烘干后的玉米浆料研磨至粒径为100～1000nm，获得玉米浆浓缩颗粒。

在本发明的一种实施方式中，将3～5份所述玉米浆浓缩颗粒与5-10份蛋白质粉混合，加入30-50份水，升温至60-80℃，于1000-3000rpm搅拌均匀，然后按1-3ml/min滴加10mmol/l过硫酸盐，加入3份所述红花染料，搅拌1-2h，静置、降温至常温。

在本发明的一种实施方式中，将降温后的混合浆液先于50-60℃干燥30-40分钟，再于80-100℃完全干燥，研磨至粒径为100-1000纳米，即得所述指示剂。

本发明的第二个目的是提供所述指示剂在微生物检测方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种水质微生物的检测方法，所述方法是将待测水样加入至含有指示剂的透明容器中，混合后静置2～4h，通过指示剂颜色变化判断水质微生物含量。

在本发明的一种实施方式中，所述透明容器包括但不限于袋状或瓶状容器。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还预先建立菌浓与水体吸光度之间的线性关系，通过检测待测水样的吸光度值，根据线性关系换算水样中的微生物浓度。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物包括但不限于真菌和细菌。

在本发明的一种实施方式中，待测溶液占容器容量的40-70％，指示剂填充率为容器容量的10％-20％。

有益效果：

本发明的水质微生物检测方法效果优异，当待测水质放入口袋中后，水的存在会使里面的微粒分散开，一些水质微生物会将颗粒物质吞噬，导致水的颜色发生变化，因此可以根据水质的颜色来判断微生物的数量。

本发明的水质微生物检测方法采用玉米、蛋白质、红花等天然物质，生态环保不会污染水质。

本发明的水质微生物检测方法方便、快捷，反应时间仅2h，准确率高于90％以上。可以节省培养基培养的时间。

本发明的饮用水微生物检测方法中采用红花进行染色，由于红花含有-oh，与玉米浆的醇羟基、蛋白质的羧基、氨基发生反应，染色效果好，不易掉色，不会对检测有影响。

本发明的水质微生物检测方法具有很大的经济效益。

附图说明

图1为微生物检测装置示意图。

图2为不同等级的颜色对照图；其中0～6分别对应6个等级。

图3为不同等级的颜色对照图；其中0～6分别对应6个等级。

具体实施方式

红花染料的制备方法：将100g红花加入50g水，搅碎榨汁，获得60g溶液；采用公开号为cn104087009b公开的提取方法制备红花红色素，具体步骤为：加入微晶纤维素，用醋酸调节ph至3.0-5.0，搅拌30分钟，室温静置2小时，过滤，得到干净的吸附了红花红色素的微晶纤维素；用碳酸钾溶液浸泡微晶纤维素，室温搅拌15分钟，抽滤，收集滤液；滤液加入柠檬酸调节ph至3.0-5.0，5℃下放置10-12小时，虹吸移去上清液，将沉淀于-20℃下冷冻干燥，即得到红花红色素。

实施例1

(1)玉米浆浓缩颗粒物的制备：

用磨浆机将玉米粒磨为玉米浆，磨浆过程中玉米粒与水的质量比为4:1，将磨好的玉米浆液先在40℃进行蒸发，得到浓缩量为40％的玉米浆料，然后在80℃下进行加热循环蒸发，得到基本干燥物，在90℃烘干。

取最终的干燥物研磨至粒径为100-500纳米，即为玉米浆浓缩颗粒物。

(2)染色蛋白质粉和玉米浆

在反应釜中加入5份蛋白质粉和3份玉米浆颗粒，30份水，升温至60℃，于1000rpm搅拌均匀，然后缓慢滴加10mmol/l过硫酸钠，滴加速度1ml/min，加入红花染料3份，滴加完成之后，搅拌2h，静置、降温至常温。

烘干：先在60℃烘干30分钟，再于80℃完全干燥，用研体研磨至粒径为100-500纳米，即为染色的蛋白质粉与玉米浆颗粒的混合颗粒。

(3)将第二步得到的经染色的混合颗粒用透明密封膜包裹起来，混合颗粒占整个结构的15％，整个结构就像口袋一样。

将取待测水样100ml，倒入口袋中，将口袋口敞开，静置2h，观察上层清液的颜色变化。随着时间的改变，水质颜色由原色缓慢变为红色，2h之后取上层清液进行吸光度检测。

实施例2

(1)玉米浆浓缩颗粒物的制备：

用磨浆机将玉米粒磨为玉米浆，磨浆过程中玉米粒与水的质量比为6:1，将磨好的玉米浆液进行蒸发，先在50℃进行蒸发，得到浓缩量为50％的玉米浆料，然后在90℃下进行加热循环蒸发，得到基本干燥物，在100℃进行烘干。

取最终的干燥物进行研磨，得到粒径大概为500纳米的微粒，即为玉米浆浓缩颗粒物。

(2)染色蛋白质粉和玉米浆

在反应釜中加入8份蛋白质粉和4份玉米浆颗粒，40份水，升温70℃，2000rpm，搅拌均匀，然后缓慢滴加10mmol/l过硫酸钠，滴加速度2ml/min，加入红花染料3份，滴加完成之后，搅拌2h，静置、降温至常温。

烘干：先进行55℃烘干30分钟，90℃烘干至完全干，用研体进行研磨，得到粒径大概为500纳米的微粒，即为染色的蛋白质粉与玉米浆颗粒的混合颗粒。

(3)将第二步得到的染色的蛋白质粉与玉米浆颗粒的混合颗粒用透明密封膜包裹起来，混合颗粒占整个结构的15％，整个结构就像口袋一样。

将取待测水样100ml，倒入口袋中，口袋口敞开(或者留有缝隙)，静置3h，观察上层清液的颜色变化。随着时间的改变，水质颜色由原色缓慢变为红色，2h之后取上层清液进行吸光度检测。

实施例3

(1)玉米浆浓缩颗粒物的制备：

用磨浆机将玉米粒磨为玉米浆，磨浆过程中玉米粒与水的质量比为7:1，将磨好的玉米浆液进行蒸发，先在60℃进行蒸发，得到浓缩量为50％的玉米浆料，然后在90℃下进行加热循环蒸发，得到基本干燥物，在100℃进行烘干。

取最终的干燥物进行研磨，得到粒径大概为1000纳米的微粒，即为玉米浆浓缩颗粒物。

(2)染色蛋白质粉和玉米浆

在反应釜中加入10份蛋白质粉和5份玉米浆颗粒，50份水，升温80℃，3000rpm，搅拌均匀，然后缓慢滴加10mmol/l过硫酸钾，滴加速度3ml/min，加入红花染料3份，滴加完成之后，搅拌2h，静置、降温至常温。

烘干：先进行60℃烘干40分钟，100℃烘干至完全干，用研体进行研磨，得到粒径大概为300-500纳米的微粒，即为染色的蛋白质粉与玉米浆颗粒的混合颗粒。

(3)将第二步得到的染色的蛋白质粉与玉米浆颗粒的混合颗粒用透明密封膜包裹起来，混合颗粒占整个结构的15％，整个结构就像口袋一样。

将取待测水样100ml，倒入口袋中，口袋口敞开(或者留有缝隙)，静置4h，观察上层清液的颜色变化。随着时间的改变，水质颜色由原色缓慢变为红色，2h之后取上层清液进行吸光度检测。

实施例4

采集河水，对河水进行灭菌处理；以大肠杆菌和恶臭假单胞菌为指示菌，分别配制菌浓为1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷cfu/ml的河水样品。取口袋容量15％的实施例1制备的染色颗粒放置于100ml口袋，取水样65ml，混合均匀，

建立菌体浓度与颜色变化级别，如表1所示。

表1菌浓与吸光度的对照表

分别采用实施例1～3制备的混合颗粒作为指示剂，对菌浓为6×10⁵cfu/ml的河水样品进行检测。将所述混合颗粒按照15％的比例加入至容量为100ml的透明袋中，加入65ml待检测的水样，混合后静置2h。在520nm下检测吸光度值。结果如表2所示。虽然三个实验例测试结果均为4级，但是实施例3和标准更接近。

表2实施例1、2、3的测试结果

对比例1不同染料对饮用水的染色效果

以饮用水为待测样品，比较不同染料的染色效果。

取饮水机里面的水，经平板菌落计数法检测，饮水机中的微生物数量为78cfu/ml；

分别将染料按3份红色物质加入至步骤(1)的饮用水中，对吸光度进行检测，结果显示，

红花的染色效果最好。苏丹红染色在水中会有轻微掉色，使得颜色加深，红墨水、市售大红染料、大红颜料属于水溶性的，遇水会掉色严重，颜色加深。

表3不同染料对饮用水检测结果的影响

注：市售大红染料活性红3bs购自山东鸿赋化工有限公司；大红颜料190购自郑州市金水区鑫汇化工商行。

对比例2不同染色剂对河水的染色效果

以河水为待测样品，比较不同染料的染色效果。

(1)取样：取某镇上的河水，经平板计数法法检测，河水中的微生物数量为6×10⁵cfu/ml；

(2)分别将染料按3份红色物质加入至步骤(1)的河水中，对吸光度进行检测，结果显示。苏丹红染色在水中会有轻微掉色，使得颜色加深，红墨水、市售大红染料、大红颜料属于水溶性的，遇水会掉色严重，颜色加深。

表4不同染料对河水检测结果的影响

对比例3

(1)在反应釜中加入5-10份蛋白质粉和玉米浆，30-50份水，升温60-80℃，1000-3000rpm，搅拌均匀，然后缓慢滴加过硫酸盐，滴加速度1-3ml/min，加入红花染料3份，滴加完成之后，搅拌1-2h，静置、降温至常温。

(2)烘干：将步骤(1)的浆液先在50-60℃烘干30-40min，再于80-100℃烘干至完全干，用研体进行研磨，得到粒径为100-500纳米的微粒，即为染色的蛋白质粉与玉米浆颗粒的混合颗粒。

(3)分别采用仅经过烘干处理的玉米浆和本对比例制备的混合颗粒对菌浓为6×10⁵cfu/ml的河水样品中的微生物浓度进行检测。结果显示，单独的玉米浆颜色很重，无法很好的进行染色，而且在液体情况下无法准确的定位玉米浆的染色，导致结果测试存在很大误差。

表5玉米浆不做浓缩物颗粒的测试结果

对比例4

分别按照下表的方法制备用于染色的颗粒剂，分别用染色剂对下述物质染色，以染色后的颗粒剂作为指示剂对菌浓为6×10⁵cfu/ml的河水样品中的微生物浓度进行检测。结果显示，蛋白粉：玉米浆颗粒＝1:1时的测定结果与实际值较为接近，其他比例的结果均存在很大的误差。

表6不同被染色物质的检测结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。