一种启动红发夫酵母RNA表达的启动子及其应用的制作方法

文档序号：23463220发布日期：2020-12-29 12:44阅读：393来源：国知局

本发明涉及酵母生物技术及合成生物学领域，具体涉及一种红发夫酵母rna聚合酶iii启动子及其应用。

背景技术：

酵母菌对科学研究和人类生活具有重要价值。进入二十一世纪以来，以酿酒酵母为模式的研究成果已分别在2001、2013和2016年获得诺贝尔生理学或医学奖。在产业方面，据bccresearch统计，2016年酿酒酵母及相关产品的全球市场达71亿美元，预计到2020年可达100.7亿美元。除了酿酒酵母，自然界还存在大量酵母菌，这些非模式酵母菌具有丰富的物种多样性、遗传多样性和代谢多样性，但其应用开发还很薄弱。

随着基因组测序和现代生物技术的发展，非模式生物研究的可行性和意义逐渐凸显(russelljj,theriotja,soodp,etal.bmcbiology,2017,15:55)。非模式子囊菌酵母在蛋白表达、生物能源、生物基化工品合成等方面具有特色，例如：kluyeromyces酵母合成β-半乳糖苷酶，scheffersomycesstipitis代谢木糖，解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)合成柠檬酸、油脂等(johnsonea.applmicrobiolbiotechnol,2013,97:503-517)。非模式担子菌酵母在蛋白药物合成、次级代谢产物合成、污染物降解等方面具有特色，例如：红发夫酵母(phaffiarhodozyma)合成虾青素、pseudozymaantarctica合成利巴韦林、trichosporon酵母降解芳香族污染物、sporobolomyces酵母合成特殊脂肪酸等(johnsonea.applmicrobiolbiotechnol,2013,97:7563-7577)。

在担子菌酵母中，红发夫酵母因合成虾青素而备受关注。虾青素具有超强的抗氧化能力，兼有抗肿瘤、抗炎症和预防心脑血管疾病作用(ambatir,phangsm,ravis,etal.mardrugs,2014,12:128-152)。据bccresearch评估，到2020年虾青素的市场额度将达到15亿美元。我国已进入老龄化社会，虾青素等类胡萝卜素产品对老龄化社会的退行性疾病、三高症等具有重要预防和改善作用。红发夫酵母合成虾青素的比例可占细胞类胡萝卜素的50％～85％，并且在生长速度、细胞密度、抗污染等方面具有突出优势，被认为是虾青素生产的潜在细胞工厂(belloran,moliném,david-palmam,etal.bmcgenomics,2016,17:901)。但是，红发夫酵母为非模式酵母，虾青素合成代谢调控机制还很不清楚，并且缺乏合成技术平台，严重限制了其应用开发。红发夫酵母的基因组序列于2015年才发表，这也反应了相关基础研究的薄弱(sharmar,gassels,steigers,etal.bmcgenomics,2015,16:233)。基因组序列的发表推动了多种组学研究，最近，比较基因组学、p450组学和代谢物组学数据相继发表，为红发夫酵母合成虾青素研究提供了重要参考。担子菌酵母已发现700余种，但至今缺乏模式生物技术菌种，将红发夫酵母发展为模式，十分有利于这类经济重要性酵母菌的开发应用。

近年，crispr(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats)基因编辑技术迅猛发展，目前已经在多种酵母发展了该技术，包括酿酒酵母、解脂耶氏酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维斯酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、新生隐球酵母等(stovicekv,holkenbrinkc,borodinai.femsyeastresearch,2017,17:1-16)。但是，在具有经济重要性的担子菌酵母中，该技术还未见报道。在红发夫酵母建立这一系统可为其它非模式酵母的技术平台建设提供参考。获得高效表达的grna(guiderna)启动子，是建立这一技术的关键。本发明针对这一问题，鉴定、克隆、验证了有效的红发夫酵母grna，并阐述了其应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种红发夫酵母rna聚合酶iii启动子及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种启动红发夫酵母rna表达的启动子，启动子为红发夫酵母属rna聚合酶iii启动子；启动子为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4，或与上述各序列具有70％同源性、且具有启动子活性的dna核苷酸序列。

所述seqidno:1所示核苷酸或具有70％同源性、且具有启动子活性的dna序列为红发夫酵母rna聚合酶iii启动子pscr1。

所述seqidno:2所示核苷酸或具有70％同源性、且具有启动子活性的dna序列为红发夫酵母rna聚合酶iii启动子pu6a。

所述seqidno:3所示核苷酸或具有70％同源性、且具有启动子活性的dna序列为红发夫酵母rna聚合酶iii启动子pu6b。

启动子为红发夫酵母属rna聚合酶iii启动子与trna^ala基因融合形成的人工杂合启动；人工杂合启动为seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或与上述各序列具有70％同源性、且具有启动子活性的dna核苷酸序列。

所述trna^ala基因为seqidno:4核苷酸所示的红发夫酵母trna^ala基因。

一种启动红发夫酵母rna表达的启动子的应用，所述启动子在启动cirspr基因编辑系统中grna的表达、启动snorna的表达或启动rna聚合酶iii转录产物的表达中的应用。

一种含所述启动子的重组载体。

所述重组载体为游离载体或整合载体；其中，游离载体或整合载体含所述红发夫酵母rna聚合酶iii启动子或融合启动子中任意一种启动子。

一种含所述的启动子的表达盒。

一种含所述重组载体的重组菌。

本发明所具有的优点：

本发明启动子以酵母rna聚合酶iii转录因子tfiiic所识别的dna保守序列为参照，通过序列比对和克隆分析，从红发夫酵母(xanthophyllomycesdendrorhous)基因组中鉴定到rna聚合酶iii启动子；同时以酵母转运rna(trna)序列为参照，通过序列比对和克隆分析，从红发夫酵母基因组中鉴定到trna^ala基因，以rna聚合酶iii启动子与trna^ala基因融合形成的人工杂合启动子，能够有效启动红发夫酵母的rna表达。上述本发明所得启动子可以应用于红发夫酵母crispr-cas9基因编辑系统，指导该系统中grna的表达，将crispr-cas9系统应用于红发夫酵母基因编辑，与自身同源重组相比，基因编辑效率提高4倍，说明本发明所提供的rna启动子启动能力强、grna表达水平高，足以指导cas9蛋白定点切割基因组靶序列。除了本专利，能够在红发夫酵母指导grna表达的启动子还未见报道。

附图说明

图1为本发明实施例提供的以酿酒酵母为例的rna聚合酶iii启动子保守序列；其中，boxa和boxb为转录因子tfiiic识别区。

图2为本发明实施例提供的经viennarnapackage2.0软件预测的红发夫酵母trna^ala基因的二级结构。

图3为本发明实施例提供的以egfp为示踪分子的红发夫酵母核定位序列的检验图；其中，右图表明所用核定位序列nls可正确引导egfp进核。

图4为本发明实施例提供的红发夫酵母crispr-cas9整合质粒示意图。

图5为本发明实施例提供的红发夫酵母基因编辑表型图，其中，左图为et1和et2靶序列位点，右图为et3靶序列位点，白色菌落为正确编辑克隆，红色菌落为未编辑克隆。

图6为本发明实施例提供的红发夫酵母基因编辑修复类型图，其中，et3-3、et3-4和et3-6为碱基替代，et3-5为碱基缺失。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明以酿酒酵母和白假丝酵母的rna聚合酶iii转录因子tfiiic所识别的dna保守序列为参照，通过序列比对，从红发夫酵母基因组中鉴定rna聚合酶iii启动子。以酿酒酵母转运rna(trna)序列为参照，通过序列比对，从红发夫酵母基因组中鉴定trna基因。采用gibsondna装配方法，构建rna聚合酶iii启动子和trna基因的融合启动子。在cirspr-cas9系统中验证启动子的功能。

具体包括如下：

a：所述的红发夫酵母属rna聚合酶iii启动子具有如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示的全部dna序列，以及与各所示序列具有70％同源性且具有启动子活性的dna序列。

b：所述的红发夫酵母属rna融合启动子具有如seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示的全部dna序列，以及与各所示序列具有70％同源性且具有启动子活性的dna序列。

c：携带(a)或(b)所述任意一种rna聚合酶iii启动子的载体，载体包括游离载体或整合载体。

d：转入(c)所述任意一种载体的红发夫酵母属的重组菌。

实施例

1.材料和方法

1.1菌株及培养条件

以红发夫酵母菌株cbs6938(购自荷兰cbs菌种保藏中心)为材料。常规培养使用ypd液体培养基(葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母提取物10g/l)，培养条件为22℃、250rpm。

1.2rna聚合酶iii启动子的预测

以酿酒酵母和白假丝酵母的scr1和u6基因的启动子序列为参照，应用ncbiblastn程序包中的optimizeforsomewhatsimilarsequences程序，由红发夫酵母xanthophyllomycesdendrorhous(taxid:5421)的基因组数据，获得红发夫酵母基因组的同源序列。应用相同方法，以酿酒酵母转运rna(trna)序列为参照，通过ncbiblastn序列比对，获得红发夫酵母trna基因的同源序列；获得序列如下：

以酿酒酵母scr1基因的启动子为参考序列，获得seqidno:1所示核苷酸的红发夫酵母rna聚合酶iii启动子pscr1。

以白假丝酵母u6基因的启动子为参考序列，获得两条同源序列，seqidno:2所示核苷酸的红发夫酵母rna聚合酶iii启动子pu6a；seqidno:3所示核苷酸的红发夫酵母rna聚合酶iii启动子pu6b。

以酿酒酵母trna^ala基因为参考序列，获得seqidno:4所示核苷酸的红发夫酵母trna^ala基因。

将上述获得序列seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3分别与序列seqidno:4融合，获得序列seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7。

1.3基因编辑靶序列的设计

利用crispy-web设计grna靶标序列。以crte基因(1539235-1541616)作为靶标，对红发夫酵母x.dendrorhous基因组的scaffold_79(id：ln483167.1)进行检索；获得如表1记载引物序列。

1.4载体构建

1)载体构建采用gibson装配方法，所用引物如表1所示。crispr/cas9载体包括cas9表达元件、grna转录元件和筛选标记。cas9的表达需要细胞核定位信号，根据红发夫酵母x.dendrorhous密码子偏好性优化核定位序列(nls)sv40，并将其置于egfp扩增引物的5’端，以检验外源sv40核定位信号是否适用于红发夫酵母。带有sv40序列的egfp基因片段和骨架p61hte的扩增引物分别为negfp-f/negfp-r和p61hte-f/p61hte-r。采用kapahifi高保真dna聚合酶，分别pcr扩增sv40-egfp和p61hte片段，扩增体系皆为25ul(2×kapamix,12.5ul；10um引物各0.75ul；模板1ul；加水补至25ul)，即得到各dna序列。扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸时间按照15秒每kb计算，循环数为29-35；72℃延伸6分钟。将两个dna片段应用gibsonassembly方法组装，反应体系中dna片段浓度控制在100-200ng每个反应，总体积为10ul，装配条件为50℃，1小时。反应结束后，取2ul转化dh5α感受态细胞，阳性克隆由菌落pcr和dna测序验证筛选获得，所构建的质粒命名为pcyp-egfp。

2)在构建cas9表达载体时，将pcrct质粒(购自addgene)的cas9基因根据x.dendrorhous密码子偏好性进行密码子优化，并由无锡青蓝生物公司合成，在cas9的n端和c端均与sv40核定位序列融合，使用引物c9-f/r扩增装配片段。cas9基因均置于padh4启动子后。骨架片段的扩展以质粒pcyp-egfp为模板，引物为pc9-f/pc9-r。采用kapahifi高保真dna聚合酶分别进行pcr扩增，扩增体系皆为25ul，扩增条件和装配条件与步骤1.4，1)中记载一致。所得质粒命名为pcyp-cas9。

3)所得grna启动子与grna序列通过gibson方法装配组装。核糖体rdna序列置于表达盒两端，用于同源重组整合，筛选标记为遗传霉素。以ggpp合成酶基因crte为crispr编辑的验证靶点，20bp的靶基因序列通过pcr扩增引入载体中。在构建验证转化效率的质粒时，首先构建crte基因敲除质粒作为对照，将crte基因上下游同源臂与zeocin抗性基因表达盒装配，在此基础上，将分别带有et2和et3的crispr/cas9元件与带有crte同源臂的载体装配。构建过程如下：

以质粒pug6-rdnalong-crte为模板，应用引物pgrna-f/pgrna-r扩增质粒骨架；以质粒pcyp-cas9为模板，应用引物gcas-f/gcas-r扩增cas9蛋白；通过gibson组装获得质粒pug6-crispr。以质粒pug6-crispr为模板，分别应用引物pcopg1-f/pcopg1-r和et1-f/et1-r扩增质粒骨架和带靶序列et1的dna片段，gibson组装获得质粒pug6-crispr-et1。以质粒pug6-crispr为模板，分别应用引物pcopg2-f/pcopg1-r和et1-f/et2-r扩增质粒骨架和带靶序列et2的dna片段，gibson组装获得质粒pug6-crispr-et2。分别应用引物pcopg3-f/pcopg1-r和et1-f/et3-r扩增质粒骨架和带靶序列et3的dna片段，gibson组装获得质粒pug6-crispr-et3。以质粒pug6为模板，应用引物pug6-f/pug6-r扩增骨架；以红发夫酵母基因组为模板，应用引物edisr-f/edisr-r扩增crte同源片段；通过gibson组装获得质粒pug6d1。以质粒pug6d1为模板，应用引物pedisr-f/pedisr-r扩增骨架；以pug6-zeocin质粒为模板，应用引物zeo-f/zeo-r扩增zeocin基因，通过gibson组装获得质粒pug6d2。以质粒pug6d2为模板，应用引物pezin-f/pezin-r扩增质粒骨架；以红发夫酵母基因组为模板，应用引物ez-f/ez-r扩增crte同源片段；gibson组装获得质粒pezin。以质粒pug6-crispr-et2为模板，应用引物gt2-f/gt2-r扩增cas9-grna片段；以质粒pezin为模板，应用引物puez-f/r扩增质粒骨架；gibson组装获得质粒peget2。所有pcr扩增采用kapahifi高保真dna聚合酶，扩增体系皆为25ul，扩增条件和装配条件与步骤1.4，1)中记载一致。

表1.本发明所用的pcr扩增引物

1.5红发夫酵母转化

从ypd平板培养基上挑取菌株cbs6938单菌落，接种于含30mlypd的250ml摇瓶(ypd成分为葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母提取物10g/l)，22℃培养48h。将上述培养的菌液接种于含50mlypd的500ml摇瓶中，至终浓度为od600＝0.02，而后于22℃培养至od600约为1.2，约需14-20h。将培养液离心，用磷酸钾缓冲液(50mm,ph7.0)重悬，加入dtt，终浓度为25mm，处理15min。然后，4℃离心，用冰冷的蔗糖缓冲液stm(270mmsucrose,10mmtris-hcl,ph7.5,and1mmmgcl2)洗涤两次，洗涤后细胞重悬于0.1mlstm缓冲液，备用。取60μl上述获得感受态细胞，加入10μg基因表达盒dna，电转化，条件为1000ω,800v,25μf。转化液用600μl冰冷(约0℃)的ypd重悬，22℃孵育2.5h，取100μl涂布于筛选平板。筛选平板的抗性浓度分别为g418200μg/ml。

1.6rna聚合酶iii启动子功能分析

通过红白菌落差异，筛选cirspr-cas9基因编辑克隆，白色菌落为正确编辑克隆。挑选正确编辑克隆，测定dna序列，通过序列比对，检验rna聚合酶iii启动子的功能。并且通过分析红发夫酵母cirspr-cas9基因编辑效率，检验rna聚合酶iii启动子的功能。

2.结果与分析

2.1rna聚合酶iii启动子的预测

以酿酒酵母和白假丝酵母的scr1和u6基因的启动子序列为参照(图1)，通过ncbiblastn序列比对，鉴定红发夫酵母同源启动子，检索到的序列如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示。以酿酒酵母转运rna(trna)序列为参照，通过ncbiblastn序列比对，鉴定红发夫酵母trna基因(图2)，检索到的基因序列如seqidno:4所示。将trna分别与预测的scr1和u6融合，所得融合启动子如seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示。

2.2核定位序列验证

由于cas9基因需要定位在细胞核中才能发挥作用，首先利用荧光蛋白进行核定位序列的验证。选择外源sv40序列cctaagaagaagagaaaggtc作为验证对象，以egfp荧光蛋白为示踪分子。通过荧光显微镜观察荧光蛋白egfp在细胞中的定位，结果显示，在细胞核位置呈现明显的绿色荧光，说明egfp蛋白能够成功进入细胞核，表明sv40nls可以用于引导cas9蛋白进入红法夫酵母细胞核(图3)。

2.3rna聚合酶iii启动子的有效性

通过在红发夫酵母转化crispr-cas9质粒(图4)，验证所预测的rna聚合酶iii启动子的功能。以crte基因中三个不同的靶点序列为研究对象，结果发现在不加供体dna的情况下，以et2和et3为靶点的转化子出现白色菌落，为正确编辑菌株(图5)。这表明，所预测的rna聚合酶iii启动子pscr1、pu6a和pu6b以及各自与trna^ala的融合启动子，可以成功用于grna的表达。对转化子crte位点进行dna测序，结果显示crte3-2菌株基因组有1308bp碱基缺失，crte3-5菌株基因组有6bp碱基缺失，另有克隆出现碱基替代，从而证明了启动子的正确功能(图6)。

2.4crispr/cas9系统的编辑效率

通过上述实验可以确定红发夫酵母crispr/cas9系统可以成功编辑et2和et3靶dna序列。针对基因敲除，比较了基因编辑法与同源重组法的敲除效率。结果表明，采用crispr/cas9系统，以et2和et3为双链断裂和基因敲除靶点，crte基因的敲除效率均显著高于同源重组法，分别提高了4.1倍和2.9倍，这从另一方面支持启动子pscr1、pu6a和pu6b以及各自与trna^ala的融合启动子，可以指导grna的表达，并且所构建的crispr/cas9系统可以有效提高红发夫酵母基因编辑效率。

>seqidno:1

scr1启动子

tgtcgttagtgtcatcggattgatctctatcccaggcctgatgacaggagcgatcatcggtggttcttccgtcgaacaag

ccgcgaaattacaaagtacatctcgaaatttcgatactttgaactttgcctttaaaacttttagatcgactgatatactc

ttcgtttcctttaccaaaagtgatcttgatgtttatgatcagcgcttcttctgcactatccggttagtccttcttcctcc

tatcgatcgcctagtcccaatcagaactcctttgaattgactcctgatcctttgttttccatcttcaactctcgccaata

gtgctggcagccatgatattcacattctcggtcgtattcgaccctcaacatcgaatcagagacgacaggatatattcgtc

cgagagcgtgctttctggtgggatcagaagtgttgggaagatcggcgtgttgggttggaaatcgatcaaaaatctaggag

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>seqidno:2

u6a启动子

agttgcacctccatactgtgcagtcttaaagctcttttcgtcctgggcaaccaggacatcaataatatcgaatacaatac

agagaagattagcattgcccctgcataaggatgacacgattcgatcagagtggagaccttcgggtcaaattattttttta

ctcatgtatctacatattctgaattccacatgggcatataatctcaggaaagcaagaggttgctatatatgtatcagaac

gtaataacttatgacagatggaggtaggcaacacagtccgcttcct

>seqidno:3

u6b启动子

gcttcctttcgtcctgggcaaccaggacatcaataatatcgaatacaatacagagaagattagcattgcccctgcataag

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aaaggcgaggaggtgaggaaaaccgccgcagtgaaatgcgagacgacagaccatctcacttttctaagatccttcactcc

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>seqidno:4

trna^ala序列

gtggggacctggcgtagtggtagcgcccagcctttgcgtggctgtagccccggttcgattccgggggtctccaacc

>seqidno:5

scr1-trna^ala杂合启动子

tgtcgttagtgtcatcggattgatctctatcccaggcctgatgacaggagcgatcatcggtggttcttccgtcgaacaag

ccgcgaaattacaaagtacatctcgaaatttcgatactttgaactttgcctttaaaacttttagatcgactgatatactc

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>seqidno:6

u6a-trna^ala杂合启动子

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>seqidno:7

u6b-trna^ala杂合启动子

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tggggacctggcgtagtggtagcgcccagcctttgcgtggctgtagccccggttcgattccgggggtctccaacc

序列表

<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120>一种启动红发夫酵母rna表达的启动子及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>510

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtcgttagtgtcatcggattgatctctatcccaggcctgatgacaggagcgatcatcgg60

tggttcttccgtcgaacaagccgcgaaattacaaagtacatctcgaaatttcgatacttt120

gaactttgcctttaaaacttttagatcgactgatatactcttcgtttcctttaccaaaag180

tgatcttgatgtttatgatcagcgcttcttctgcactatccggttagtccttcttcctcc240

tatcgatcgcctagtcccaatcagaactcctttgaattgactcctgatcctttgttttcc300

atcttcaactctcgccaatagtgctggcagccatgatattcacattctcggtcgtattcg360

accctcaacatcgaatcagagacgacaggatatattcgtccgagagcgtgctttctggtg420

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<210>2

<211>286

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>468

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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agacgacagaccatctcacttttctaagatccttcactccttcctctcatctttcatccc420

actttcttcttctctcttggactgtcttataagttgattccatcacca468

<210>4

<211>76

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtggggacctggcgtagtggtagcgcccagcctttgcgtggctgtagccccggttcgatt60

ccgggggtctccaacc76

<210>5

<211>586

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5