一种大豆GmEF1B基因突变体植株及其制备方法及应用与流程

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种大豆gmef1b基因突变体植株及其制备方法及应用。

背景技术：

大豆菌核病是由核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)引起的真菌性病害，是一种危害严重的世界性病害，直接影响大豆的品质及产量，病情严重时发病率高达50％～90％，甚至绝产。由于传统育种方法的局限性，利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要，然而目前抗病品种培育的基因资源稀少，制约了新品种选育的效率以及准确性。

技术实现要素：

为了明确大豆抗核盘菌相关基因的抗病功能，加快大豆抗菌核病品种选育的进程，本发明提供了一种大豆gmef1b基因突变体植株，所述突变体植株含有突变的大豆gmef1b基因，所述突变是指gmef1b基因编码区中5’-gcttccccggcaatgctcaa-3’核苷酸序列发生碱基取代或缺失，使其编码的氨基酸序列发生改变；所述大豆gmef1b基因核苷酸序列如seqidno：1所示。

进一步地限定，所述突变的大豆gmef1b基因的核苷酸序列如seqidno：10所示。

本发明还提供了上述大豆gmef1b基因突变体植株的制备方法，包括如下步骤：

1)根据大豆gmef1b基因设计grna单靶点引物；

2)制备grna单靶点引物二聚体；

3)将引物二聚体插入到cas9/grna载体中，构建大豆gmef1b基因敲除载体；

4)将步骤3)构建的gmef1b基因敲除载体转化大豆，经筛选获得大豆gmef1b基因突变体植株。

进一步地限定，步骤1)所述大豆gmef1bgrna单靶点引物的正向引物为gmef1b-1-s，其核苷酸序列如seqidno：2所示，反向引物为gmef1b-1-a，其核苷酸序列seqidno:3所示。

进一步地限定，步骤2)所述制备grna单靶点引物二聚体，是指每20ul合成体系中正向引物5μl，正向引物5μl和h2o15μl，反应条件为95℃3min，冷却后静置。

进一步地限定，步骤3)所述构建gmef1b基因敲除载体，是指每10ul反应体系中，引物二聚体1-7μl，cas9/grnavector，1μl，solution11μl，solution21μl，h2o0-6μl，16℃反应5-10h。

进一步地限定，步骤4)所述大豆为大豆品种maplearrow；所述农杆菌为农杆菌eha105。

进一步地限定，步骤4)所述筛选所用正向引物为mutv-s，其核苷酸序列如seqidno：4所示，反向引物为mutv-a，其核苷酸序列如seqidno：5所示，用于筛选阳性突变体植株。

进一步地限定，步骤4)所述筛选所用正向引物为gmef1b-target1-s，其核苷酸序列如seqidno：6所示，反向引物序列为gmef1b-target1-a，其核苷酸序列如seqidno：7所示，上述两条引物作为单靶点突变检测引物，用于检测利用引物gmef1b-1-s和gmef1b-1-a构建获得的大豆gmef1b基因突变体植株。

本发明所述的大豆gmef1b基因突变体植株可用于gmef1b基因功能研究或抗大豆菌核病品种选育。

名词及缩写：卡那霉素：kan；链霉素：str；利福平：rif。

有益效果

本发明利用crispr/cas9技术对大豆gmef1b基因编码区进行靶向突变，获得了大豆突变体植株，通过与野生型表型鉴定及gmef1b基因表达量分析对比可看出，gmef1b基因突变后，其对大豆菌核病的抵抗力削弱，确定了gmef1b能够参与到抗大豆菌核病的抗性反应中，本发明为大豆抗菌核病相关基因功能的研究提供了理论依据。

附图说明

图1gmef1b基因敲除载体转化大肠杆菌后菌落pcr鉴定结果，m：dl2000marker；1-5：5个阳性菌落；

图2t1代gmef1b基因突变体植株的pcr检测结果，m：dl2000maker；1：阳性对照，2：阴性对照，3：空白对照组(水)，4-6：t1代突变体植株的pcr产物；

图3t1代gmef1b基因突变体植株的pcr产物测序结果；

图4t1代gmef1b基因突变体及野生型植株叶片接种核盘菌后表现，ck：maplearrow叶片；1-7：突变体植株叶片。

具体实施方式

大豆品种maplearrow，记载在吕春梅,赵月,赵雪,etal.大豆品种maplearrow耐菌核病生化机制[j].中国油料作物学报,2014,36(5):630.，公众可通过东北农业大学获得。

核盘菌记载在吕春梅,赵月,赵雪,etal.大豆品种maplearrow耐菌核病生化机制[j].中国油料作物学报,2014,36(5):630.，公众可通过东北农业大学获得。

所使用的crispr/cas9试剂盒购买自北京唯尚立德生物科技有限公司，货号vk005-15。

所用的lb培养基的配制方法为：配制每升培养基，在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l。在温度121℃、15psi高压下蒸汽灭菌21min。

yep液体培养基：配制每升培养基,在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl5g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l。在温度121℃、15psi高压下蒸汽灭菌21min。

ms0培养基：称取4.43gms粉末，30g蔗糖，加600-800ml蒸馏水溶解，玻璃棒搅拌充分溶解后，调节ph值至5.8，定容至1l，加入6g琼脂粉末，在温度121℃、15psi高压下蒸汽灭菌21min。

其他涉及的试剂、仪器、设备等如无特殊说明，均为本领域常用的试剂、仪器或设备，均可通过商业化途径购买获得。

下述实施方式中所涉及的分子生物学实验如反转录、pcr扩增，胶回收等各实验步骤如无特殊说明，均参照相应的产品说明书或按照标准的分子克隆技术进行。

实施例1.大豆gmef1b基因突变体植株。

本实施例所述的大豆gmef1b基因突变体植株，所述突变体植株含有突变的大豆gmef1b基因，所述突变是指gmef1b基因编码区中5’-gcttccccggcaatgctcaa-3’核苷酸序列发生碱基取代或缺失，使其编码的氨基酸序列发生改变；所述大豆gmef1b基因核苷酸序列如seqidno：1所示。

实施例2.大豆gmef1b基因突变体植株的制备方法。

下面举例描述本发明所述的大豆gmef1b基因突变体植株的制备方法：

本实施例所述的突变体植株中，所述的突变的gmef1b基因是指在gmef1b基因编码区中5’-gcttccccggcaatgctcaa-3’核苷酸序列发生碱基取代或缺失，使其编码的氨基酸序列发生改变；即靶点核苷酸序列为：5’gcttccccggcaatgctcaa3’位于gmef1b编码区第203位至第222位碱基处。制备步骤如下：

1)根据大豆gmef1b基因设计grna单靶点引物。

首先扩增获得大豆gmef1b基因，以大豆品种maplearrow为材料，待长出第一组三出复叶时，取材，提取总rna并反转录合成cdna第一链。根据phytozome上gmef1b基因序列，利用primer5软件设计基因克隆引物，其核苷酸序列如下：

引物1-s：5’-atggccgttaccttctcaaat-3’(seqidno：8所示)；

引物1-a：5’-ttagattttgttgaatgcaac-3’(seqidno：9所示)。

以cdna为模板进行rt-pcr反应，反应体系如下，反应程序：94℃5min；38个循环：94℃30s，60℃30s，72℃30s；72℃10min，4℃保存。反应后取pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收纯化目的片段。rt-pcr反应体系如下：

按照tiangen公司的pgm-t克隆试剂盒的步骤，将上述得到的胶回收产物与克隆载体进行连接，获得带有目的基因的克隆质粒pgm-t-gmef1b，转化top10大肠感受态细胞，挑取单克隆并进行pcr及测序验证。最终得到目的片段大小为675bp的gmef1b基因，如seqidno：1所示。

根据获得的gmef1b基因序列，设计grna单靶点引物。正向引物为gmef1b-1-s，5’-ttggcttccccggcaatgctcaa-3’(seqidno：2所示)，反向引物为gmef1b-1-a，5’-aacttgagcattgccggggaagc-3’(seqidno：3所示)，上述引物经引物合成公司合成获得。

2)制备grna单靶点引物二聚体。

将上述正、反向引物按如下比例混合形成二聚体：gmef1b-1-s/a(10μm)各5μl，h2o15μl混合后，进行如下处理：95℃3min；95℃到25℃缓慢冷却；16℃5min。

3)将引物二聚体插入到crispr/cas9试剂盒中cas9/grna载体中，构建gmef1b基因敲除载体。

反应体系如下(10μl体系)：16℃过夜反应。

4)将步骤3)构建的gmef1b基因敲除载体转化农杆菌，侵染大豆，经鉴定获得大豆gmef1b基因突变体植株。

a转化：取上述产物10μl加入到刚解冻的50μltop10感受态中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰上静置2min，再加入500μl无抗lb培养基中，置于37℃恒温摇床中，170转，复苏1h后，涂kana抗性的固体平板，37℃过夜培养，挑取3-5个单斑摇菌，进行菌液pcr及测序，如图1所示。所述菌液pcr检测引物为：

mutv-s：5’-aaaagtcccacatcgcttag-3’(seqidno：4所示)

mutv-a：5’-tgtgcaaggtaagaagatgg-3’(seqidno：5所示)，目的片段为435bp，将测序结果与载体序列进行比对，保存阳性菌液于-80℃备用。

b.根癌农杆菌介导法转化大豆茎尖。

将gmef1b基因敲除载体转入农杆菌eha105中，采用本实验保存的质粒，冻融法转化农杆菌的方法，该方法可参考：王涛.大豆mirna172及靶基因参与开花诱导和逆境响应的功能分析.博士学位论文.东北农业大学.2016中所述农杆菌转化方法。

通过农杆菌介导法将ggmef1b-cas9基因敲除载体转化耐病大豆品种maplearrow中，具体方法如下：

(1)菌液制备：取制备好的菌液分别在yep固体平板(50mg/mlstr，50mg/mlkan，25mg/mlrif，所述各抗生素浓度均为在培养基中的终浓度，下同)上划线28℃培养，挑取单菌落接种于yep液体培养基(50mg/mlstr，50mg/mlkan，25mg/mlrif)中，28℃200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的yep液体培养基中震荡培养至od600为0.6-0.8。

(2)种子灭菌：选取饱满、无菌斑种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16h后置于超净工作台内吹走残留的氯气，大约30min左右，密封待用。

(3)种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下种于ms0培养基中，每瓶种10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗条件下萌发5-6天。

(4)茎尖外植体的制备：种子萌发至子叶即将冲破种皮时，用镊子和解剖刀去掉种皮，将两半子叶中的一半切掉，用解剖刀轻轻刮掉子叶和生长点之间的腋芽，并在子叶节处轻轻划3-5道伤口，剩余的部分作为外植体用于侵染。

(5)侵染与共培养：将制备好的外植体放入侵染液中进行抽真空处理，抽真空条件为0.6pa，10min。真空侵染后的外植体用灭菌蒸馏水清洗三次，用无菌纸将外植体表面的侵染液吸干，插入ms0培养基中共培养3天，观察复活情况，根据外植体返青的情况确定移栽时间，移栽至土壤中后，置于25℃，16h光照/8h黑暗条件下的培养箱中培养。

c.突变体植株鉴定：取经敲除gmef1b基因的大豆植株的t1代叶片以及对照(maplearrow)叶片，提取其dna，进行pcr鉴定，引物为：

mutv-s：5’-aaaagtcccacatcgcttag-3’(seqidno：4所示)；

mutv-a：5’-tgtgcaaggtaagaagatgg-3’(seqidno：5所示)，目的片段为435bp，鉴定出转gmef1b基因敲除载体的转基因植株。收取t1代中鉴定为转基因植株的大豆种子并种下，提取叶片dna，用单靶点突变检测引物进行pcr检测，正向引物为：gmef1b-target1-s:5'-ttttcccaatgctgccaagt-3'(seqidno：6)；反向引物：gmef1b-target1-a:5'-gccctgtaaccataggtcacatc-3'(seqidno：7)。扩增出目的片段641bp(图2)并将产物进行测序，如图3所示，测序结果发现有1个阳性植株在靶点处发生了突变，较野生型发生1个碱基缺失，突变的gmef1b基因序列如seqidno：10所示。收取t1代中鉴定为转基因植株的大豆种子并种下，在第一轮三出复叶完全展开取叶片接种核盘菌，接种一天后观察发现(图4)：maplearrow对照大豆叶片初期叶面产生暗绿色水渍状斑纹，后扩展为不规则状病斑，病斑处中心为深褐色，病斑四周颜色为浅褐色，处理后期叶片泛黄，病斑扩展终止；gmef1b突变体植株大豆叶片初期叶面产生较大的暗绿色水渍状斑纹，后期病斑扩展速度加快，最后几乎布满整个叶片。证明敲除gmef1b基因后的抗病品种maplearrow植株对大豆菌核病的抗性减弱，说明了gmef1b基因在所述的靶点区(核苷酸序列为5’-gcttccccggcaatgctcaa-3’)发生上述的碱基缺失，使得功能氨基酸发生了变化，从而导致抗病品种maplearrow对核盘菌的抗性被削弱。

核苷酸序列表

<110>东北农业大学

<120>一种大豆gmef1b基因突变体植株及其制备方法及应用

<130>

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>675

<212>dna

<213>大豆gmef1b基因

<400>1

atggccgttaccttctcaaatctccacacagaatcaggtctcaagtccctcgacgacttc60

ctctctgggaaggtctacgtttctggggatcagttcacaaaggacgacatcaaagtgtat120

ggtgctgttttggagaagccaggtgactcttttcccaatgctgccaagtggtacgaggtt180

gtctcatctcagcttgctgcaagcttccccggcaatgctcaaggggtgagattcagtggc240

aaagcttctgctccagcggaggctgctcctgcgaaaccggatgcttctgctgctgaagat300

gatgatgaccttgatctctttggcgatgagactgaggaagacaaaaaggcagcagaggaa360

agggaggctgctaagaagtctaccaagaagaaagagagtggcaaatcttctgttctgctt420

gacgttaagccttgggatgatgaaacagacatgaagaagctggaagaggctgttcgcagt480

gttgagatgcctggtctattgtggggagcatccaaactggttcctgttggttatgggatc540

aagaagttgcagatcatgttaactattgtcgatgaccttgtatctgtggacacccttgtt600

gaggagactctcacagttgagcccatcaatgagtatgtccaaagctgtgacattgttgca660

ttcaacaaaatctaa675

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>正向引物gmef1b-1-s

<400>2

ttgcgacgacttcctctctggga23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>反向引物gmef1b-1-a

<400>3

aactcccagagaggaagtcgtcg23

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>正向引物mutv-s

<400>4

aaaagtcccacatcgcttag20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>反向引物mutv-a

<400>5

tgtgcaaggtaagaagatgg20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>正向引物gmef1b-target1-s

<400>6

ttttcccaatgctgccaagt20

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>反向引物序列gmef1b-target1-a

<400>7

gccctgtaaccataggtcacatc23

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>引物1-s

<400>8

atggccgttaccttctcaaat21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>引物1-a

<400>9

ttagattttgttgaatgcaac21

<210>10

<211>674

<212>dna

<213>突变的大豆gmef1b基因

<400>10

atggccgttaccttctcaaatctccacacagaatcaggtctcaagtccctcgacgacttc60

ctctctgggaggtctacgtttctggggatcagttcacaaaggacgacatcaaagtgtatg120

gtgctgttttggagaagccaggtgactcttttcccaatgctgccaagtggtacgaggttg180

tctcatctcagcttgctgcaagcttccccggcaatgctcaaggggtgagattcagtggca240

aagcttctgctccagcggaggctgctcctgcgaaaccggatgcttctgctgctgaagatg300

atgatgaccttgatctctttggcgatgagactgaggaagacaaaaaggcagcagaggaaa360

gggaggctgctaagaagtctaccaagaagaaagagagtggcaaatcttctgttctgcttg420

acgttaagccttgggatgatgaaacagacatgaagaagctggaagaggctgttcgcagtg480

ttgagatgcctggtctattgtggggagcatccaaactggttcctgttggttatgggatca540

agaagttgcagatcatgttaactattgtcgatgaccttgtatctgtggacacccttgttg600

aggagactctcacagttgagcccatcaatgagtatgtccaaagctgtgacattgttgcat660

tcaacaaaatctaa674