一种白术内生真菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一种白术内生真菌及其在制备白术内酯Ⅰ、Ⅱ中的应用。

背景技术：

白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ是白术的主要活性成分，是菊科植物白术中所含的三环倍半萜内酯化合物。现代药理学研究表明白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅱ具有抗炎、抗肿瘤、改善脾胃、抑制肌肉收缩、预防老年痴呆、改善记忆等多种药理活性。自从上世纪八十年代，从白术的挥发油中分离得到白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ以来，人们便尝试优化各种提取条件，提高其得率。有学者等用水蒸气蒸馏法从白术药材中提取挥发油，再将挥发油进行反复柱层析分离，石油醚—乙酸乙酯梯度洗脱，并结合重结晶，得到白术内酯Ⅰ无色针晶。有学者采用正交设计法研究了索式提取法提取白术中白术内酯Ⅰ的最佳工艺，表明白术粉末过80目筛，120mL石油醚(400g白术)提取12h的方法得率最高。超临界CO2流体萃取法也被用于白术中白术内酯Ⅰ的提取，杨林等以体积分数为10％乙醇为携带剂，药材粒度60目，萃取压力25MPa，解析压力5MPa，萃取温度40℃，解析温度30℃的条件下萃取4h为最佳工艺。有学者采用体积分数为80％乙醇对白术药材进行渗漉提取，从石油醚萃取层中，经柱层析分离制备白术内酯Ⅱ。综上，目前白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅱ的制备主要是依靠从白术生药材中分离提取所得，白术原药材消耗量大，化合物得率低，无法满足工业化需求。

微生物发酵是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件，不需要添加其他的催化剂，不需要高温高压，强酸强碱的条件，催化反应一般在室温条件下进行，产生的代谢废物绿色环保，不会对环境造成污染，使用到的仪器设备操作简单、安全，容易实施，因此具有高效专一、条件温和、经济快捷、污染低和可循环率高等特点，广泛被应用于活性代谢产物制备、天然产物转化等领域。微生物包括细菌、古菌、真菌、黏菌、病毒等，而内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在植物细胞中或在其生活史某一时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害的一类真菌。研究表明，内生真菌可产生多种结构新颖、活性显著的真菌次生代谢产物，包括内酯类、聚酮类、生物碱、萜类、酚酸等，且大多具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节、促进骨髓增殖、抑菌、杀虫等，是重要的微生物药源分子宝库。

但是，关于一种能够通过微生物发酵产生白术内酯Ⅰ、Ⅱ的内生真菌及其应用目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种白术内生真菌及其应用，该白术内生真菌能够通过微生物发酵产生白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅱ。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种白术内生真菌，所述的内生真菌是从菊科苍术属植物白术活体中分离所得，分类命名为AM06(Boeremia exigua)，菌种保藏号为CGMCC No.17782。

一种白术内生真菌的应用，该应用为：白术内生真菌用于制备白术内酯Ⅰ和Ⅱ。

进一步地，白术内生真菌通过PDB液体发酵制备得到内酯Ⅰ和Ⅱ，具体包括以下步骤：

(1)取白术内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基，26℃活化培养约5-7d。

(2)将活化后的菌种用真菌打孔器打成5mm×5mm的菌饼，无菌条件下转接至已灭菌的液体PDB发酵培养基中，26℃下180rpm暗培养7d。

(3)发酵完毕，对菌丝发酵液进行抽滤，将菌丝体置于40℃下烘干至恒重，按照物料比1:20的体积比加入甲醇，超声提取约30min，过滤后将滤液减压蒸干得提取物A；超声功率为250W，频率为33kHz。

(4)取步骤(3)中滤液，加入100mL乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯层减压蒸干得提取物B，甲醇超声溶解合并提取物A与B，而后过滤减压蒸干，甲醇复溶即得白术内酯Ⅰ和Ⅱ。

进一步地，PDB液体发酵培养基的配方是：200g土豆、20g葡萄糖、1000mL蒸馏水。

进一步地，所述土豆葡萄糖培养基的配方是：200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂、1000mL蒸馏水。

本发明优点在于：

本发明通过白术植物活体中分离得到内生真菌，所述的内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生白术内酯Ⅰ、Ⅱ，是寻找白术内酯Ⅰ、Ⅱ新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

附图说明

图1：AM06(Boeremia exigua)在固体培养基上的菌落形态；

图2：AM06(Boeremia exigua)在PDB液体培养基上的发酵液形态；

图3：AM06(Boeremia exigua)在光学显微镜下的菌丝形态(×200倍)；

图4：基于ITS5和ITS4引物扩增的AM06(Boeremia exigua)ITS序列凝胶电泳图；

图5：基于ITS序列的AM06(Boeremia exigua)系统进化树(NJ法)；

图6：白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅱ的化学结构；

图7：内生真菌AM06(Boeremia exigua)发酵液HPLC分析(1.白术内酯Ⅰ；2.白术内酯Ⅱ)；

图8：内生真菌AM06(Boeremia exigua)发酵液UPLC-MS/MS二级质谱(a,b:白术内酯Ⅰ标品与样品；2.c,d:白术内酯Ⅱ标品与样品)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：从浙江於潜白术植物活体中分离得到的内生真菌的菌株。

所述内生真菌按以下步骤分离获得：取新鲜白术的茎和叶，在清水下冲洗去除表面杂质。剪取适宜大小茎叶，包裹纱布后进行三步表面消毒处理：体积分数为75％乙醇溶液1min，体积分数为1％次氯酸钠溶液3min，体积分数为75％乙醇溶液30s。消毒取出，剪取茎、叶组织中间部分约0.5cm×0.5cm大小的小块接种于加有青霉素(50mg/L)的无菌分离培养用平板中，每皿4块。封口膜密封，编号记录，室温下培养7-12d。定期观察菌落的生长情况，根据其菌群形态和颜色等筛选出目标单一的菌落。在无菌条件下，挑取目标菌丝尖端组织块转移至新鲜制备的土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)中再次培养，编号记录，待培养完成后，再次观察筛选，挑选出合适菌落，取菌落边缘菌丝接于新的平板，不断重复筛选、挑取及培养来纯化菌株，最终得到本发明的内生真菌菌株AM06，其固体培养特征为：在PDA培养基上26℃，65％湿度条件下暗培养，生长较为缓慢，菌落圆形或椭圆形，初期为白色菌丝体，中后期菌丝逐渐呈黑白色，绒状，边缘整齐，外圈围绕一层薄层白色菌丝，背面蓝黑色，如图1所示。其液体培养特征为：

(1)在PDB液体培养基上，26℃，180rpm恒温摇床暗培养7d；

(2)发酵培养特征：培养第1-2d，黑色菌块有少量白色菌丝体长出，发酵液较清晰，菌块可见；培养第3d，黑色菌块逐渐长出白色菌丝，发酵液稍变浑浊，菌块模糊；培养第4d，隐约可见白色菌丝体，菌块逐渐自溶于发酵液，发酵液胶状，棕褐色；培养第5d，菌块完全自溶于发酵液，白色菌丝体消失，发酵液颜色变为蓝黑色，胶状；培养第6-7d，发酵液呈深蓝黑色，振动隐约可见胶状融合体，发酵液粘稠，如图2所示。

在显微镜下的形态特征为：菌丝体灰黑色，粗3.5-5.5μm，菌丝内部暗色有隔，没有分枝，表面平滑，如图3所示。

分离出来的内生真菌菌株AM06于低温下保存(4℃)。

取AM06菌株的冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌丝置于新制的PDA培养基中活化，26℃遮光培养至成熟，用以ITS序列扩增及鉴定。按照改良CTAB法提取菌株DNA，利用ITS5和ITS4对其ITS基因进行PCR扩增。PCR反应循环参数扩增步骤：1.95℃，3min，初始变性；2.94℃，40s，变性；3.52℃，50s，退火；4.72℃，1min，延伸；5.2-4重复循环35次；6.72℃，10min，扩展。其ITS扩增电泳图见图4，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

将经琼脂糖凝胶电泳检测后的PCR产物送至上海生工公司进行序列测定。以PCR产物测得序列作为靶序列，在NCBI中的GenBank数据库搜索同源序列，发现同Boeremia exigua(KX284747)，同源性99.25％。下载与形态型序列最相似的参考序列，用邻接法(Neighbor-joining，NJ)系统发育分析，随机挑取1个序列，重复比对1000次来确定待鉴定菌株的系统发育地位，系统进化树如图5所示。本发明的内生真菌菌株经微生物分类学鉴定为AM06(Boeremia exigua)。该菌株已保藏，菌株保藏号为CGMCC No.17782，保藏日期为2019年5月20日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。

实施例2：白术内生真菌通过PDB液体发酵制备得到内酯Ⅰ和Ⅱ。

(1)菌种活化与发酵：取低温状态(4℃)下保存的AM06菌种，接种于PDA培养基中，并置于26℃下暗培养5-7d。待菌种长满培养基，用酒精灯灼烧打孔器，待其冷却后，在PDA培养皿中菌落较密集处打孔15个菌块，用同样灼烧后冷却的接种针挑取至PDB锥形瓶中，封口，放进恒温摇瓶柜中进行发酵(恒温摇瓶柜：180rpm，26℃)。以上操作均在超净台上进行，且打孔器、接种针每次使用前后均需灼烧，培养皿打孔时，以扇形连续打孔为宜。

(2)菌丝提取：对菌丝发酵液进行抽滤，40℃下将菌丝烘干，称重，研磨，粉末倒入水解管，按照物料比1:20的体积比加入相应甲醇，超声(功率250W，频率33kHz)提取30min，过滤后将滤液减压蒸干得提取物A；

(3)滤液提取：取步骤(2)中滤液，加入100mL乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯层减压蒸干得提取物B，甲醇复溶合并提取物A与B，定容至2mL容量瓶，过0.45μm滤膜，注入液相瓶，编号，待用。

(4)HPLC检测：分别精密称取白术内酯Ⅰ，白术内酯Ⅱ的标准品适量。白术内酯Ⅰ，英文名：AtractylenolideⅠ，分子式：C15H18O2，PubChem CID号：5321018；白术内酯Ⅱ，英文名：AtractylenolideⅡ，分子式：C15H20O2，PubChem CID号：14448070；白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅱ的化学结构见图6。用甲醇分别配制成终浓度为0.13、0.14mg/mL的标准品溶液。取适量溶液，过0.45μm滤膜，然后注入液相瓶，标注纯度和日期，4℃下冷藏待用。将AM06发酵液进行HPLC分析，与白术主要的有效活性成分标准品进行对比分析。HPLC色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×150mm，1.7μm)，流动相水—乙腈，柱温30℃，进样量1μL，检测波长为220、276nm，流速为0.2mL/min，洗脱程序采用梯度洗脱，依次进样样品溶液，记录出锋时间。

(5)UPLC-MS/MS检测：对AM06发酵液采用UPLC-MS进行进一步分析。质谱条件为AB Sciex Qtrap 5500，Analyst1.6.3，EPI DP180，EP10，CE30，CES5。白术内酯Ⅰ：231.1/185.1/157.1，DP 190，CE 25/32V。白术内酯Ⅱ：233.1/187.1/177.2，DP160V，CE21/23V。CUR 40，CAD High，IS 5500V，TEM 55℃，GS1，55.0，GS2，55.0。经以上HPLC与UPLC-MS/MS分析，如图7、8所示，表明本发明的白术内生真菌菌种液体发酵能够产生白术内酯Ⅰ与白术内酯Ⅱ，产量分别为1.28μg/g与1.76μg/g。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 一种白术内生真菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

cttaggtgac tgcggaggtc attacctaga gttgtaggct ttgcctacca tctcttaccc 60

atgtcttttg agtaccttcg tttcctcggc gggtccgccc gccgattgga caaacttaaa 120

ccctttgtaa ttgaaatcag cgtctgaaaa aacataatag ttacaacttt caacaacgga 180

tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtagt gtgaattgca 240

gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cccttggtat tccatggggc 300

atgcctgttc gagcgtcatt tgtaccttca agctctgctt ggtgttgggt gtttgtctcg 360

cctttgcgtg tagactcgcc ttaaaacaat tggcagccgg cgtattgatt tcggagcgca 420

gtacatctcg cgctttgcac tcataacgac gacgtccaaa aagtactttt tacactcttg 480

acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcc gggaggaaa 539