一种用于鉴定杂交构树的分子标记及其应用的制作方法

文档序号：18737607发布日期：2019-09-21 01:23阅读：316来源：国知局

本发明涉及一种植物分子标记，尤其涉及一种用于鉴定杂交构树的分子标记及其应用。

背景技术：

DNA分子鉴定可以应用于亲子鉴定、疾病诊断、产前筛查、中草药鉴定、植物品种鉴定以及转基因鉴定等等。DNA分子鉴定是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种或样本进行快速的自动鉴定。

构树(Broussonetia papyrifera)又名楮树、榖树、光叶楮、楮桃子、谷浆树、鹿仔树、当当树、奶树、纸木，在APGIII系统(Angiosperm Phylogeny Group)中归属于固氮分枝、蔷薇类、蔷薇目、桑科Moraceae构属Broussonetia。除了东北、西北等地之外，我国其他省区均有自然分布，是我国的乡土树种。在东南亚、欧美和太平洋诸岛等地均有分布。构树既是制布原料，又是造纸原料，同时还有较好的食用和药用价值，并且是良好的畜禽饲料原料，同时由于构树及其产业具有治理盐碱地和石漠化、加速造林绿化、可循环持续利用等功能，具有良好的生态和经济效益。

中科院植物所沈世华研究团队以野生构树(Broussonetia papyrifera)为父本，同属灌木植物小构树(Broussonetia kazinoki)为母本，通过现代育种技术与常规技术相结合的方法，进行种间杂交获得了原始的杂交构树新种质(B.kazinoki X B.papyrifera)，并通过神州飞船系列连续8年的太空搭载，经过宇宙空间微重力、高真空、弱磁场和多辐射线诱变等特殊环境影响下，刺激细胞发生地面难以实现的稳定基因变异。种苗从神州飞船上取下后，中科院植物所科研团队将它们切割后分别在特定的培养基中进行培养，让杂交构树幼苗自然生长，成长到一定程度的种苗再栽到土壤中进行培育。通过对这些变异种苗成长过程的观察，筛选出具有优良性状的品种，最终培育出更适合产业化推广应用的杂交构树新品种，并将其命名为杂交构树科构101号。

杂交构树是由中国科学院植物研究所的研究团队以野生构树为父本，以小构树为母本进行种间杂交获得新品系。在目前市场上经常出现使用野生构树和其他植物来冒充和替代杂交构树的市场乱象，蒙蔽种植户，让种植户遭受经济损失。因此，如何对杂交构树进行快速而准确的鉴定具有重要意义。目前，市场上还没有专门针对杂交构树的DNA分子标记。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种用于杂交构树鉴定的分子标记。

本发明提供的用于杂交构树鉴定的分子标记来源于杂交构树(Broussonetia kazinoki×B.papyrifera)，为如下1)或2)：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

本发明的第二个目的是提供扩增上述DNA分子全长或其任一片段的引物对。

进一步的，所述引物对由正向引物和反向引物组成；

所述正向引物为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述反向引物为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。

本发明的第三个目的是提供上述分子标记或上述引物对的新用途。

本发明提供了上述分子标记或上述引物对在如下c1)-c8)中任一种中的应用：

c1)制备用于鉴定或辅助鉴定杂交构树的产品；

c2)鉴定或辅助鉴定杂交构树；

c3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否为杂交构树的产品；

c4)鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否为杂交构树；

c5)制备区分或辅助区分杂交构树与其他植物的产品；

c6)区分或辅助区分杂交构树与其它植物；

c7)制备区分或辅助区分杂交构树与其他构树的产品；

c8)区分或辅助区分杂交构树与其它构树。

本发明的第四个目的是提供含有上述引物对的试剂盒；

所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：

d1)鉴定或辅助鉴定杂交构树；

d2)鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否为杂交构树；

d3)区分或辅助区分杂交构树与其它植物；

d4)区分或辅助区分杂交构树与其它构树。

本发明的试剂盒还包括用于PCR扩增的其它试剂。

所述用于PCR扩增的其它试剂可包括Buffer缓冲液、dNTP、Taq酶和ddH2O。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否为杂交构树的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否为杂交构树的方法包括如下步骤：检测待测植物样品是否含有上述分子标记：

若待测植物样品含有上述分子标记，则待测植物样品为或候选为杂交构树；

若待测植物样品不含有上述分子标记，则待测植物样品不为或候选不为杂交构树。

上述鉴定或辅助鉴定待测植物样品是否为杂交构树的方法中，

所述检测待测植物样品是否含有上述分子标记的方法包括如下步骤：以待测植物样品的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，根据所述PCR产物的核苷酸序列判断待测植物样品是否含有上述分子标记：

若PCR产物的核苷酸序列为序列3，则待测植物样品为或候选为杂交构树；

若PCR产物的核苷酸序列不为序列3，则待测植物样品不为或候选不为杂交构树。

本发明第六个目的是提供一种区分或辅助区分杂交构树与其他构树的方法。

本发明提供的区分或辅助区分杂交构树与其他构树的方法包括如下步骤：检测待测植物样品是否含有上述分子标记：

若待测植物样品含有上述分子标记，则待测植物样品为或候选为杂交构树；

若待测植物样品不含有上述分子标记，则待测植物样品为或候选为其他构树。

上述区分或辅助区分杂交构树与其他构树的方法中，

若PCR产物的核苷酸序列为序列3，则待测植物样品为或候选为杂交构树；

若PCR产物的核苷酸序列不为序列3，则待测植物样品为或候选为其他构树。

本发明的最后一个目的是提供一种区分或辅助区分杂交构树与其它植物的方法。

本发明提供的区分或辅助区分杂交构树与其它植物的方法包括如下步骤：

1)以待测植物样品的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，根据所述PCR产物的大小判断待测植物样品为构树还是其他植物：

若PCR产物的大小为3649bp，则待测植物样品为或候选为构树；

若PCR产物的大小为4125bp，则待测植物样品为或候选为其他植物；

2)按照上述区分或辅助区分杂交构树与其他构树的方法区分杂交构树与其他构树。

上述任一所述的方法中，所述PCR反应体系具体如下(总体积为25μL)：DNA模板1μL，正向引物和反向引物各1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(10mmol/L each)2μL，Taq酶(20U/μL)0.25μL，ddH2O 12.25μL。所述正向引物和所述反向引物在反应体系中的终浓度均为5μM。

所述PCR反应条件具体如下：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36个循环；72℃延伸10min。

上述分子标记或应用或试剂盒或方法中，所述待测植物样品可为待测植物叶片或根或茎秆。

上述分子标记或应用或试剂盒或方法中，所述杂交构树为杂交构树科构101号；

所述其他植物选自如下至少一种：拟南芥Arabidopsis_thaliana、甜菜Beta_vulgaris_subsp、油菜Brassica_napus、青花菜Brassica_oleracea、小构树Broussonetia_kazinoki、野生构树Broussonetia_papyrifera、大麻Cannabis_sativa、辣椒Capsicum_annuum、番木瓜Carica_papaya、衣藻Chlamydomonas_reinhardtii、西瓜Citrullus_lanatus、甜瓜Cucumis_melo、黄瓜Cucumis_sativus、铁皮石斛Dendrobium_officinale、褐藻Ectocarpus_siliculosus、草莓Fragaria_vesca、大豆Glycine_max、野生大豆Glycine_soja、棉花Gossypium_raimondii、向日葵Helianthus_annuus、橡胶树Hevea_brasiliensis、大麦Hordeum_vulgare、黑麦草loliunm_perenne、百脉根Lotus_japonicus、苜蓿Medicago_truncatula、中国莲Nelumbo_nucifera、烟草Nicotiana_tabacum、水稻Oryza_sativa、三角褐指藻Phaeodactylum_tricornutum、蝴蝶兰Phalaenopsis_equestris、菜豆Phaseolus_vulgaris、挪威云杉Picea_abies、火炬松Pinus_taeda、萝卜Raphanus_sativus、蓖麻Ricinus_communis、海带Saccharina_japonica、丹参Salvia_miltiorrhiza、番茄Solanum_lycopersicum、野生西红柿Solanum_pennellii、马铃薯Solanum_tuberosum、高粱Sorghum_bicolor、小麦Triticum_aestivum、绿豆Vigna_radiata、玉米Zea_mays、枣树Ziziphus_jujuba；

所述其它构树选自如下至少一种：小构树Broussonetia_kazinoki、野生构树Broussonetia_papyrifera。

本发明基于DNA条形码技术提供了用于杂交构树鉴定的分子标记，并设计了用于扩增所述分子标记的引物对，成功建立了杂交构树的鉴定方法。本发明提供的分子标记可以区分杂交构树与野生构树、小构树等其他植物，可用于目前在全国各地推广的杂交构树种源的鉴定，既可以保护中国科学院植物所的知识产权，也可以保障广大种植户的利益，不仅对于杂交构树的品种鉴定具有重要的理论和实际意义，而且对于农牧业和生态环境治理所需的植物品种的培育与鉴定也具有较高的实际应用价值。本发明将在农业和经济能源作物领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为样品DNA提取电泳示意图。

图2为PCR结果电泳示意图。

图3为序列比对结果示意图。

图4为进化树构树示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用核苷酸序列均由上海美吉生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品，所用水均为超纯水。

下述实施例中的杂交构树为杂交构树科构101号(“科构101”)，记载于文献“沈世华，彭献军，段瑞，熊伟.科技引领创新产业助力扶贫——杂交构树扶贫工程在山东菏泽的成效与启示[J].中国科学院院刊，2018,33(9):979-986”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、用于鉴定杂交构树的分子标记及其特异性扩增引物对的设计

一、杂交构树的分子标记

本发明提供了来源于杂交构树(Broussonetia kazinoki×B.papyrifera)的DNA条形码(DNA barcode)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，并将其命名为Bpmcbode。序列3所示的DNA分子即为用于鉴定杂交构树的分子标记。

二、特异性引物对

根据步骤一获得的杂交构树特有的Bpmcbode序列，设计用于特异性扩增其全长的引物对，引物序列如下：

F：5′-AACCTGGGGCGTATTGCTCAA-3′(序列1)；

R：5′-TTACCATATATATATAACACAAAATTTC-3′(序列2)。

实施例2、用于鉴定杂交构树的引物对的特异性检测

1、植物材料DNA的提取

分别提取表1中各植物材料的总DNA，并将提取得到的总DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。其中，以杂交构树叶片或根或茎秆为材料提取的总DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。结果表明，所提取的DNA有明显的电泳条带，大于20kb，表明获得了纯度较高、较完整的DNA。

2、PCR扩增

分别以步骤1提取的总DNA样品为模板，采用实施例1步骤二设计的引物对进行PCR扩增，分别得到PCR产物。

PCR反应体系如下(总体积为25μL)：DNA模板1μL，F、R引物各1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP Mixture(10mmol/L each)2μL，Taq酶(浓度为20U/μL)0.25μL，ddH2O 12.25μL。F、R引物在反应体系中的终浓度均为5μM。

PCR反应条件如下：先94℃预变性5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36个循环；最后72℃延伸10min。

3、PCR产物检测和测序

将PCR产物进行电泳检测，然后使用PCR产物纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行回收，回收后直接送给上海美吉生物公司进行序列测序。

结果如表1所示。

表1、各植物材料的中文名和拉丁名及其扩增产物大小

结果表明：杂交构树、小构树和野生构树中均扩增得到大小为3649bp的条带(杂交构树的PCR产物的电泳检测结果如图2所示)，而在其他植物材料中均扩增得到大小为4125bp的条带。因此，通过本发明的特异性引物对可以有效区分构树与其他物种：若待测植物样品PCR产物大小为3649bp，则待测植物样品为构树；若待测植物样品PCR产物大小为4125bp，则待测植物样品为其他植物。

另外，本发明特异性引物对在杂交构树中的扩增产物的核苷酸序列如序列3所示，在小构树中的扩增产物的核苷酸序列如序列4所示，在野生构树中的扩增产物的核苷酸序列如序列5所示。本发明还可以根据Bpmcbode序列区分杂交构树、小构树和野生构树：若待测植物样品PCR产物的核苷酸序列为序列3，则待测植物样品为杂交构树；若待测植物样品PCR产物的核苷酸序列不为序列3，则待测植物样品为其他构树。

4、序列的比对

使用mega7.0版本将测得的序列结果与其他物种的响应序列进行比对。比对结果如图3所示。

5、进化树的构建

使用NJ的策略对步骤4的比对结果进行进化树的构建。构建的进化树如图4所示。进化树结果表明，该Bpmcbode序列可以将杂交构树与野生构树、小构树等植物区别开来，成功的应用于杂交构树的鉴定。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>一种用于鉴定杂交构树的分子标记及其应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

aacctggggc gtattgctca a 21

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

ttaccatata tatataacac aaaatttc 28

<210>3

<211>3649

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

aacctggggc gtattgctca aatcattggt ccggtactgg atgtagcttt tccgccgggc 60

aagatgccta atatttacaa cgctgacttg tgaagtacag caattattag gaaataatcg 120

agttagaact gtagctatga gtgctacaga tggtctaatg agaggaatgg aagtgattga 180

cacaggagct cctttaagtg ttccggtcgg cggagcgacg ttaggacgaa tttttaacgt 240

gcttggagag cccgttgata atttaggtcc tgtagatact cgcacaacat ctcctattca 300

tagatctgcg cctgccttta tacaattaga tacaaaatta tcgatttttg aaacaggaat 360

taaagtagta gatcttttag ccccttatcg ccgtggggga aaaatagggc tattcggggg 420

ggctggagta ggtaaaactg tactcattat ggaattgatc aacaacattg ccaaagctca 480

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catggaaatg aaagaatccg gcgtaattaa tgaacaaaat attgcagaat caaaagtggc 600

tctagtctac ggtcagatga atgaaccgcc gggggctcgt atgagagttg gtttaactgc 660

gctaactatg gcggagtatt tccgagatgt taatgaacaa gatgtacttc tatttatcga 720

caatatcttt cgttttgtcc aagcgggatc cgaagtatcc gccttattgg gtagaatgcc 780

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tacttctacc aaagaggggt ccataacttc tattcaagca gtctatgtac ctgcggatga 900

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ttgactcgtt tttatagttt acacactttt gtattacctc ttcttactgc cgtatttatg 1800

ttaatgcatt tcctaatgat acgtaagcaa ggtatttctg gccctttata atgactatag 1860

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agggtttcat aattggacat tgaacccatt tcacatgatg ggcgttgccg gggtattggg 2460

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tgatggtgca aatacattcc gtgcttttaa cccaactcaa gctgaagaaa cttattcaat 2580

ggttaccgct aaccgctttt ggtcccaaat ctttggggtt gctttttcca ataaacgttg 2640

gttacatttc tttatgttat ttgtaccagt aactggttta tggatgagtg ctcttggagt 2700

agtcggtctg gctttgaatc tacgtgccta tgacttcgtt tctcaggaaa tccgtgcagc 2760

ggaagatcct gaatttgaga ctttctacac caaaaatatt ctcttaaacg agggtattcg 2820

tgcttggatg gcggctcaag atcagcctca tgaaaacctt atattccctg aggaggttct 2880

accccgtgga aacgctcttt aaatgggaca aaaaataaat ccacttggtt tcagacttgg 2940

tgcaacccaa ggtcatcatt ctctttggtt tgccaaccaa aaaattattc tccaagaaga 3000

taaaaaatac gatagtatca agaaatcgac ttgacaaaaa gaactttgca aatccttatg 3060

gacaccctaa tattcttgca gaatttatag ccggacaatt aaaaaataat tccgcaaaaa 3120

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ttgcacgtgt cgaatggatc agagaaggta gggtgcctct acaaaccatt agggctaaaa 3240

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taaaaaaaga acagttcgaa taccatatac taacatcact gaaaacattc ttaaaatcct 3420

tttacgagaa ggttttattg aaaaatgagg aaacatcagg aaaacaacaa tctttttttg 3480

gtttcagatc agtcgacccg gtctacgaat ctattctaat tatcaaagaa tcccaagaat 3540

tttaggcggg atagggattg taattctttc tacttctcgg ggtataatga cagacagaga 3600

agctcgacta gaaggaatcg gtggagaaat tttgtgttat atatggtaa 3649

<210>4

<211>3649

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

aacctggggc gtattgctca aatcattggt ccggtactgg atgtagcttt tccgccgggc 60

aagatgccta atatttacaa cgctgacttg tgaagtacag caattattag gaaataatcg 120

agttagagct gtagctatga gtgctacaga tggtctaatg agaggaatgg aagtgattga 180